一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法及临床应用。

背景技术

肿瘤干细胞(CSC)在肿瘤细胞群中占比非常少，但它在肿瘤发生中起关键作用。肿瘤生物学中的一个基本问题是CSC中发生了哪些遗传和表观遗传变化，以及这些变化是否与该肿瘤的其他肿瘤实质细胞中的变化相似。

癌症发生是一个复杂的进化的过程，目前我们知道，与正常细胞相比，肿瘤细胞中发生了许多多种原因导致的显著的遗传和表观遗传变化。很多癌症被认为起源于CSC，它们带来了肿瘤治疗的耐药性和复发的高风险。了解人类CSC的遗传和表观遗传学变化可为设计新的、更好的癌症治疗方法提供启发。但是，研究人类CSC总是很困难，因为它们通常只占临床患者肿瘤标本的很小一部分。因此，人们对人类CSC中发生的遗传和表观遗传学变化以及这些变化是否与该肿瘤的其它肿瘤实质细胞一样，仍知之甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法及临床应用，适用于稀少CSC的研究，尤其是考虑到空间异质性时。

为了实现上述目的，本发明提供一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法(CIL-seq)，包括：

(A)免疫组织化学(IHC)方法处理肿瘤组织；

(B)激光捕获显微切割(LCM)方法捕获所需细胞；

(C)单细胞测序技术分析人类肿瘤干细胞(CSC)的少量但关键的遗传和表观遗传变化。

进一步的，所述的肿瘤为肝癌。但是本发明的方法也可以应用于除了肝癌之外的其它类型癌症的研究，如肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、头颈鳞癌、皮肤癌等实体瘤。

进一步的，所述的步骤A免疫组织化学(IHC)方法中对肿瘤组织采用冷冻切片的处理方法。为了更好地获得肝癌干细胞(LCSC)供进一步研究，我们对冷冻切片进行了EpCAMIHC染色。但是本发明的方法也可以应用于石蜡包埋肿瘤组织切片的研究。

进一步的，所述的步骤B采用激光捕获显微切割(LCM)方法在多个空间区域中更精确，更直观地捕获所需细胞，这有助于研究肿瘤生物学和异质性。

进一步的，所述的步骤C采用全外显子测序(WES)分析人类肿瘤干细胞(CSC)的关键遗传变化，采用全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)分析人类肿瘤干细胞(CSC)的少量的关键表观遗传变化。更进一步的，所述的人类肿瘤干细胞(CSC)的少量的关键表观遗传变化为DNA甲基化变化。

为了测试IHC过程是否会破坏基因组DNA的完整性，我们分别选取了约40个聚在一起的同类型的纯的一团细胞(HCC细胞或癌旁肝实质细胞(PL)，进行基于单细胞技术的WGS建库分析。几个相同类型细胞的同时测序可以尽可能减少由单细胞的全基因组扩增引起的固有的单碱基假阳性。

更进一步的，所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法(CIL-seq)，包括以下步骤：

a)免疫组织化学(IHC)和激光捕获显微切割(LCM)：

将OCT包埋的冷冻肿瘤组织和癌旁组织切成10μm厚的切片，然后贴在PEN膜载玻片(Leica)上；EpCAM的IHC后，通过在50ml无菌离心管中增加乙醇浓度(分别为50、75、85、95、100和100％乙醇，每次60s)使组织脱水；当膜片完全干燥后，用Leica LMD 7000激光显微切割系统启动LCM程序；所有捕获的样品收集在0.2ml PCR管中；最后，膜片经过二甲苯透明，封片后长期保存；

b)遗传文库：

通过Quick-DNA Microprep Plus试剂盒(Zymo Research)从LCM样品中提取超低DNA，然后使用REPLI-g单细胞试剂盒(Qiagen)，基于单细胞多重置换扩增(MDA)技术，对微量DNA进行扩增；获得高质量的全基因组DNA扩增产物后，使用Agilent SureSelect HumanAll Exon V6试剂盒进行全基因组外显子捕获和文库构建；全基因组文库由QIAseq FX单细胞DNA文库试剂盒(Qiagen)构建；

c)全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)文库：

利用EZ DNA甲基化直接试剂盒(Zymo Research)，用1mg/ml蛋白酶K将LCM的组织样品消化长达4小时；彻底消化后，将显微切割收集的细胞立即用Pico Methyl-Seq文库制备试剂盒(Zymo Research)，进行超低量DNA文库的构建，并稍作调整：将亚硫酸氢盐转化时间延长至90分钟以确保完全转化；对于M1BULK样品，该文库在第4步骤中仅需要6个循环，而其他文库则需要11个循环；

d)测序：

所有文库均使用Illumina Xten平台进行测序，产生150bp双端reads；

e)采用全外显子测序(WES)分析人类肿瘤干细胞(CSC)的关键遗传变化，采用全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)分析人类肿瘤干细胞(CSC)的少量的关键表观遗传变化；所述的人类肿瘤干细胞(CSC)的少量的关键表观遗传变化为DNA甲基化变化。

进一步的，所述的步骤e中采用全外显子测序(WES)比较肿瘤干细胞(CSC)、肿瘤实质细胞、癌旁细胞的关键遗传变化。

进一步的，所述的步骤e中采用全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)比较肿瘤干细胞(CSC)、肿瘤实质细胞、癌旁细胞的DNA甲基化变化。

本发明使用免疫组织化学(IHC)，激光捕获显微切割(LCM)和单细胞测序技术相结合的方法(CIL-seq)，首先从混合型肝细胞癌-胆管癌(mixed HCC-CCA)患者中选择具有干细胞表型的标本，来研究与肝脏CSC(LCSC)相关的遗传和DNA甲基化变化。我们发现，与肿瘤组织相比，LCSC在遗传和表观遗传模式上与癌旁组织更相似。我们使用CIL-seq方法或其他方法在其他肝癌样本中进一步证实了这些结果。

本发明的有益效果在于：

本发明开发了一种结合免疫组织化学，激光显微切割和单细胞测序技术的方法(CIL-seq)，来研究人类CSC的遗传和DNA甲基化变化。我们发现来自患者的LCSC具有很强的空间遗传和表观遗传异质性。更有趣的是，尽管LCSCs在其基因组中有一些潜在的关键变化，但与其他肿瘤实质细胞相比，它们的体细胞单核苷酸变异(SNV)，拷贝数变化(CNA)和甲基化差异区域要少得多。SNV，CNA，DNA甲基化模式和空间转录组的聚类分析均清楚地表明，LCSC与癌旁的肝细胞聚在一起。此外，LCSC还和癌旁肝细胞之间的DNA胞嘧啶修饰(包括5mC，5hmC和5fC)的总体水平相似。因此，在人肝LCSC中仅发生了微小的遗传和表观遗传变化。我们推测靶向CSC的关键变化，而不仅仅是大量肿瘤细胞中发生的变化，对于人类癌症治疗也许会更有效。

本发明发现，与癌旁组织相比，尽管肝癌组织中存在广泛的遗传和表观遗传变化，但肝癌组织中的肝癌干细胞只存在少量但关键的遗传和表观遗传变化。针对这些肿瘤干细胞中发生的关键的遗传和表观遗传变化的治疗，对癌症的治疗效果可能会更好。本发明为肝癌的治疗提供了新的靶标发现方法。

附图说明

图1.肝癌患者CIL-seq方法的开发和细胞样品的特征。(A)本研究开发的实验设计和CIL-seq方法(另请参见材料和方法)。(B)样品P2中LCSC和HCC或CCA细胞(EpCAM免疫染色)交界处的代表性移行区。比例尺，50μm。(C)散点图显示了50名具有明显LCSC的PLC患者的四种细胞类型中Ki-67阳性细胞的百分比(表3)。每个点代表来自一名患者的五个随机选择的相等IHC图像的平均值。NCT：非CSC肿瘤细胞。数据表示为平均值±SD。***，Wilcoxon配对的秩检验，P<0.001。(D)用于WES和WGBS分析的患者P2样品的位置和名称。从两个冷冻切片收集样品，这些切片用EpCAM染色，彼此之间的空间距离大于500μm。虚线表示肿瘤和癌旁之间的边界。

图2.与HCC和CCA细胞相比，LCSC中只发生了很少的遗传改变。(A)来自P2的16个测序样品的SNV聚类分析。(B)维恩图显示LCSC与其他类型细胞之间的SNV重叠。(C)在不同细胞类型中鉴定出的错义突变(MM)和终止密码子变化(SC)的数量。LC，覆盖率低；NM，无突变。(D)热图显示了不同样本中染色体上扩增的CNA区域(log2R>0)的分布模式。(E)在所示样品中CNA中基因扩增的聚类进化分析。WES覆盖率较低的样品未在(D)和(E)中显示。

图3.与HCC和CCA细胞相比，LCSC只发生了很少的DNA甲基化改变。(A)5种不同类型细胞的总体DNA甲基化水平。每个点代表一个样本。(B)所有WGBS样品的DNA甲基化模式的聚类分析。(C)不同细胞类型之间的DMR频率。(D)在不同的染色质状态下显著DMR分布。如文献[Kundaje,A.,et al.,Integrative analysis of 111reference humanepigenomes.Nature,2015.518(7539):p.317-30.]所显示，我们使用了一个由8个活跃状态和7个抑制状态组成的总计15个状态的模型。红色表示后一种细胞类型中高甲基化或低甲基化DMR的显著富集(Q值<0.01)。

图4.LCSC中的DNA甲基化变化对应于染色质抑制状态。(A)在不同染色质状态下不同细胞类型之间的DMR频率。显示了在染色质状态10_TssBiv，11_BivFlnk，12_EnhBiv和13_ReprPC中两种指示的细胞类型之间的低甲基化和高甲基化DMR频率。DMR频率＝某种染色质状态的DMR tiles/两种细胞类型之间所有共同的鉴定到的tiles数×100％。符号*表示在后一种细胞类型中显著的DMR富集的低甲基化或高甲基化，如图3D所示。(B)对应于染色质状态10_TssBiv和13_ReprPC中PDR和LCSC之间的高甲基化DMR的基因的功能。

图5.肝癌患者LCSC的微小遗传和表观遗传变化。(A)来自P7的不同类型细胞样品的SNV聚类分析。(B)对来自P7的WGBS样品的DNA甲基化模式进行聚类分析。(C)具有LCSC的肝癌样品的代表性5hmC免疫染色。将切片用抗EpCAM(红色)和抗5hmC(深紫色)双重染色。绿色，蓝色，黄色和红色箭头分别表示PDR，PL，LCSC和HCC细胞。比例尺，50μm。(D)肝癌样品的5hmC和5fC染色的统计分析。NCT：非CSC肿瘤细胞。对于5hmC，n＝65；对于5fC，n＝34.数据显示为小提琴图，水平条表示平均值±SD。***，Wilcoxon配对符号秩检验的P<0.001；ns，不显著。(E)对ST进行P7冷冻组织切片的H&E染色和ST spot的无偏聚类分析(K-Means聚类分析，K＝10)。(F)PL，PDR，LCSC和HCC细胞spot的代表性H&E(直接来自ST spot)和IHC(EpCAM)染色。(G)聚类分析所选基因在如图21A不同spot中的表达模式。

图6.肝癌中肝干细胞和癌干细胞的分化。该图显示癌旁肝干细胞或胆管反应(PDR)细胞可以分化为肝细胞和胆管细胞，而肝CSCs可以分化为肝细胞癌(HCC)和胆管癌(CCA)细胞，它们是HCC，CCA或混合型HCC-CCA的成分。

图7.P2样本中的五种细胞样品。肝癌切除样品的代表性苏木精和伊红(H&E)染色和IHC(抗EpCAM，OV6，SALL4，CK19，GPC3和Ki-67)染色，包括癌旁中的两种肝实质细胞：PL细胞，PDR细胞；肿瘤中的三种实质细胞：LCSCs，HCC细胞和CCA细胞。比例尺，50μm。

图8.P2肿瘤中的三种肿瘤实质细胞。肿瘤几个不同部位的代表性H&E染色。图中的虚线表示不同的肿瘤实质细胞的边界线。

图9.用于测序的P2样品。(A)LCM切割的示例。(B)与图1D相关的不同细胞类型中样品名称的总结。除了两个LCSC样本(E1BULK和M1BULK)是大约10个LCSC克隆的混合物之外，每个肝细胞样本都有一个克隆或具有20-40个细胞的簇，这些样本之间存在一定的空间距离(>200μm)。

图10.样品E3A的WES数据可重复性。(A)两个技术重复样本(E3A-1和E3A-2)的生殖系突变比较。(B)两个重复之间的等位基因替代频率的相关图。

图11.在P2的不同细胞类型中识别出的SNV。(A)突变特征。(B)在不同细胞样品中鉴定出的错义突变(MM)和终止密码子变化(SC)的数量。LC，覆盖率低；NM，无突变。(C)不同LCSC样本之间共享的SNV。

图12.不同样品中的CNA基因扩增。红色代表扩增。

图13.不同样本中包含MYC基因8q区域的扩增模式。(A)热图说明了染色体8q的拷贝数比率(log

图14.肿瘤细胞中的DNA甲基化异质性。(A)两种肿瘤细胞类型之间的DMR。显示了每个样品中DMR中的DNA甲基化状态。(B)6个LCSC细胞样品的DNA甲基化图谱。每行是一个300bp的窗口，在3个以上的样本中至少有3个碱基覆盖。(A)和(B)中的灰色代表未覆盖的区域。

图15.FFPE混合型HCC-CCA样品P4的WGBS分析。从样品P4的FFPE切片捕获不同类型的细胞，并通过CIL-seq进行WGBS。(A)样品的位置和名称。切片在LCM前用EpCAM免疫染色。图中的虚线表示肿瘤和癌旁之间的边界。(B)6种不同类型细胞的总体DNA甲基化水平，每个点代表一个样本。(C)所有WGBS样品的DNA甲基化模式的聚类分析。

图16.不同染色质状态下不同细胞类型之间的DMR频率。类似于图4A，显示了在所有15个染色质状态中任意两个指示的细胞类型之间的甲基化过低和甲基化过高的DMR频率，除了状态10_TssBiv，11_BivFlnk，12_EnhBiv和13_ReprPC(如图4A所示)。DMR频率＝染色质状态的DMR tiles/两种细胞类型之间所有共同的鉴定tiles×100％。符号*表示如图3D所示，在后一种细胞类型中，显著DMR富含低甲基化或高甲基化。

图17.P7标本中的LCSC。(A)来自患者P7的HCC标本冷冻切片的代表性H&E和IHC(抗EpCAM和CK19)染色。比例尺，50μm。(B)用于CIL-seq的样本的位置和名称。用EpCAM免疫染色后，通过LCM从样品P7的冷冻切片中捕获不同类型的细胞。图中的虚线表示肿瘤和癌旁之间的边界。

图18.P7患者LCSC中的较小遗传和DNA甲基化变化。(A)在不同细胞类型中鉴定出的错义突变(MM)和终止密码子变化(SC)的数量。NM，无突变。(B)不同细胞样品中的CNV扩增。未显示低WES覆盖范围的一个样本(EHCC2)。(C)6种不同类型细胞的总体DNA甲基化水平。每个点代表一个样本(两个HCC样品的水平相似)。(D)6个细胞样品的DNA甲基化谱。每行是一个300bp的窗口，在所有样本中至少覆盖3个碱基(覆盖率≥3)。

图19.肝癌样品中DNA修饰的IHC染色。(A)P2，P4和P7 FFPE切片样品的代表性IHC染色(抗EpCAM，5mC，5hmC和5fC)。绿色和黄色箭头分别表示PDR和LCSC细胞。比例尺，50μm。(B)对65份肝癌样本(包括30份HCC-CCA样本和35份HCC样本)进行5mC染色的统计分析。NCT：非CSC肿瘤细胞。数据显示为小提琴图，水平条表示平均值±SD。***，Wilcoxon配对的符号秩检验，P<0.001。ns，不显著。

图20.空间转录组学揭示了P7病人癌与癌旁之间RNA表达谱的差异。(A)P7样本的K均值聚类分析(K＝2)。(B)在癌与癌旁之间的前200个显著上调或下调的基因的GO气泡图。

图21.对所选spot的RNA表达谱进行聚类分析。(A)LCSCspot以及所选用于分析的其他细胞spot。(B)对(A)中spot的全局RNA表达谱的聚类分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

一、材料和方法

1.临床标本的收集

新鲜的原发性肝癌组织和配对癌旁组织取自上海东方肝胆外科医院(EHBH)接受外科手术切除的患者。每个组织标本均用OCT包埋，然后立即在由液氮预冷的异戊烷中冷冻，最后在-80℃冰箱中保存直至进一步处理。在手术切除后，进行冰冻切片的每个标本在30分钟内包埋。所有患者的档案均通过EHBH档案系统收集，并获得了患者的知情同意，并且所有程序均得到EHBH伦理委员会的批准。

2.免疫组织化学(IHC)

简而言之，对于冷冻切片IHC，将OCT包埋的冷冻组织切成8μm厚的切片；内源过氧化物酶通过在0.3％H

对于福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)的IHC，将组织在4％PFA中固定过夜，包埋在石蜡中，并切成4μm的连续切片。脱蜡后，用柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠，0.05％Tween-20，pH 6)进行抗原修复(对于H&E，省略此步骤，随后通过苏木精和伊红标准染色操作流程进行)。以下步骤与上述冷冻切片部分相同。此处使用的第一抗体如下：SALL4(1：100，SantaCruz Biotechnology，sc-101147)，CK19(1：100，Abcam，ab9221)和Ki-67(1：1000，Abcam，ab15580)。

对于5mC，5hmC或5fC免疫染色，DNA需要在室温下用2N HCl变性15分钟，然后在室温下用100mM Tris-HCl(pH 8.0)中和10分钟。使用的一抗如下：5mC(1：5000，CellSignaling Technology，Cat#：28692)，5hmC(1：10000；Active Motif，Cat#：39999)；和5fC(1：1000；Active Motif，Cat#：61227)。对于EpCAM和5hmC双染，首先将抗5hmC一抗(兔)在4℃下孵育16小时，然后使用基于碱性磷酸酶的链霉亲和素/生物素化连接系统进行可视化，以显示深紫色细胞核。然后将EpCAM抗体(小鼠)在室温下孵育2小时，使用辣根过氧化物酶/AEC系统进行检测以可视化红色的细胞膜。特别的是，最后将载玻片用甘油水性封固剂密封，而不用苏木精复染。对于EpCAM和5fC双重染色，我们无法获得良好的结果，这可能是因为细胞中5fC含量较低，因此通常对5fC的染色较弱。为了对5hmC和5fC染色进行统计分析，我们设置了标准评估规则：在同一名患者中，最强的染色区域定义为3分。具体来说，强阳性，得分＝3；中度阳性，得分＝2；弱阳性，得分＝1；无信号，得分＝0。分析了每种细胞类型的五个随机选择的相等视野(400×)的IHC图像。

3.CIL-seq

1)IHC和LCM。将OCT包埋的冷冻组织切成10μm厚的切片，然后贴在PEN膜载玻片(Leica)上。EpCAM的IHC(参见上文)后，通过在50ml无菌离心管中增加乙醇浓度(分别为50、75、85、95、100和100％乙醇，每次60s)使组织脱水。当膜片完全干燥后，根据制造商的说明书，用Leica LMD7000激光显微切割系统启动LCM程序。所有捕获的样品收集在0.2ml PCR管中。最后，膜片经过二甲苯透明，封片后长期保存。尽可能使用经认证的不含RNase/DNase的材料。

2)遗传文库。通过Quick-DNA Microprep Plus试剂盒(Zymo Research)从LCM样品中提取超低DNA，然后使用REPLI-g单细胞试剂盒(Qiagen)，基于单细胞多重置换扩增(MDA)技术，对微量DNA进行扩增。获得高质量的全基因组DNA扩增产物后，根据制造商说明，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行全基因组外显子捕获和文库构建。全基因组文库由QIAseq FX单细胞DNA文库试剂盒(Qiagen)构建。

3)全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)文库。利用EZ DNA甲基化直接试剂盒(ZymoResearch)，用1mg/ml蛋白酶K将LCM的组织样品消化长达4小时。彻底消化后，将显微切割收集的细胞立即用Pico Methyl-Seq文库制备试剂盒(Zymo Research)，根据根据制造商的说明书，进行超低量DNA文库的构建，并稍作调整：将亚硫酸氢盐转化时间延长至90分钟以确保完全转化；对于M1BULK样品，该文库在第4步骤中仅需要6个循环，而其他文库则需要11个循环。

4)测序。所有文库均使用Illumina Xten平台进行测序，产生150bp双端reads。

4.全基因组测序(WGS)和全外显子测序(WES)数据分析

用Trimmomatic过滤原始读数，以除去接头序列和低质量的碱基[Bolger,A.M.,M.Lohse,and B.Usadel,Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequencedata.Bioinformatics,2014.30(15):p.2114-20.]。过滤好的序列通过BWA算法与人类基因组(hg38)比对[Li,H.and R.Durbin,Fast and accurate short read alignment withBurrows-Wheeler transform.Bioinformatics,2009.25(14):p.1754-60.]。比对后，将重复序列删除。使用GATK[Van der Auwera,G.A.,et al.,From FastQ data to highconfidence variant calls:the Genome Analysis Toolkit best practicespipeline.Curr Protoc Bioinformatics,2013.43:p.11 10 1-11 10 33.]进行生殖突变分析。

5.体细胞突变

以大量免疫浸润细胞为对照，使用muTect和varScan从BAM文件中识别出体细胞突变[Cibulskis,K.,et al.,Sensitive detection of somatic point mutations inimpure and heterogeneous cancer samples.Nat Biotechnol,2013.31(3):p.213-9.Koboldt,D.C.,et al.,VarScan 2:somatic mutation and copy number alterationdiscovery in cancer by exome sequencing.Genome Res,2012.22(3):p.568-76.]。通过应用以下过滤标准可获得高质量的体细胞单核苷酸变异(SNV)：1)去除dbSNP中记录的潜在生殖突变或等位基因频率大于群体中1％的变异[Genomes Project,C.,et al.,A globalreference for human genetic variation.Nature,2015.526(7571):p.68-74.Sherry,S.T.,et al.,dbSNP:the NCBI database of genetic variation.Nucleic Acids Res,2001.29(1):p.308-11.]；2)去除位于10bp距离内的变异，这很可能是在文库制备过程中引入的错误；3)去除仅通过一种算法识别的突变；4)样品j和对照样品中突变位点的深度应大于10；5)样品j中至少有2个序列支持替代等位基因，且等位基因频率大于5％，并且在对照样品中没有序列替代等位基因；6)由于P2中的样本比P7中的样本多，因此仅分析多于一个P2样本中发生的突变以提高质量。该过滤标准不适用于P7。

体细胞SNV的功能序列由ANNOVAR注释[Wang,K.,M.Li,and H.Hakonarson,ANNOVAR:functional annotation of genetic variants from high-throughputsequencing data.Nucleic Acids Res,2010.38(16):p.e164.]。将所有样品的体细胞SNV转换为0-1矩阵(M)，其中1表示具有突变。为减少等位基因缺失的影响，当样本中位点i的覆盖率较低(≤5倍)时，仅根据同一样本组的其他样本对M_ij进行调整。如果更多样品带有突变，则M_ij＝0.9；如果更多样品是野生型，则M_ij＝0.1。从M计算配对样本之间的euclidean距离，并对样本进行层次聚类。

6.拷贝数改变

WES数据的拷贝数改变由CNVkit识别[Talevich,E.,et al.,CNVkit:Genome-WideCopy Number Detection and Visualization from Targeted DNA Sequencing.PLoSComput Biol,2016.12(4):p.e1004873.]。在CNA分析中，去除了覆盖目标区域<50％的样品。为了避免未覆盖区域的影响，缺失突变被忽略。log2(CN/2)≥1的片段和基因被视为扩增。为了减少扩增基因的假阳性，我们仅分析了≥5％的TCGA肝癌患者(https://www.cancer.gov/tcga)中扩增的基因，以及在肿瘤样品中比在癌旁样品中扩增了三倍以上的基因。从扩增的基因计算出Euclidean距离，并使用层次聚类法绘制聚类树。

7.WGBS数据分析

用Trimmomatic过滤原始数据，以除去接头序列和低质量的碱基[Bolger,A.M.,M.Lohse,and B.Usadel,Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequencedata.Bioinformatics,2014.30(15):p.2114-20.]。用Bismark[Krueger,F.andS.R.Andrews,Bismark:a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.Bioinformatics,2011.27(11):p.1571-2.]将过滤后的序列与人类基因组(hg38)进行比对，去除潜在的PCR重复序列。亚硫酸氢盐转化率用甲基化的非CpGs总数与总非CpG位点之间的比率估算。

R包methylKit用于生成和分析甲基化基质[Akalin,A.,et al.,methylKit:acomprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylationprofiles.Genome Biol,2012.13(10):p.R87.]。测序覆盖度大于500倍或小于3倍的碱基被丢弃。对于新鲜冷冻的样品，将基因组分成300bp的窗口，step size为300bp。对于FFPE样品，将基因组分为1Mb窗口，step size为1Mb。覆盖少于3个碱基的窗口被舍弃。配对样本之间的相似性通过Pearson相关系数进行计算。层次聚类用于样本的聚类分析。为了进行两组之间的甲基化差异分析，使用卡方检验比较每组至少两个样品所覆盖的窗口。差异甲基化区域(DMR)是满足Q值<0.05和绝对差>0.25的窗口。DMR用了胚胎干细胞系H9的基因组背景和15种染色质状态(可从Roadmap Epigenomics Project下载)注释[Kundaje,A.,et al.,Integrative analysis of 111reference human epigenomes.Nature,2015.518(7539):p.317-30.]。注释富集分析是通过Fisher精确检验进行的。Q值<0.01的注释被认为是显著的。

8.基因本体论(GO)富集分析

对感兴趣的基因用Metascape网站[Zhou,Y.,et al.,Metascape provides abiologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets.NatCommun,2019.10(1):p.1523.]进行GO分析。使用默认设置执行Metascape分析。P<0.05的值被认为具有统计学意义。

9.空间转录组

空间转录组学(ST)实验是根据Visium空间基因表达试剂盒(10x Genomics)的用户指南进行。简而言之，用预冷的PBS轻轻清洗HCC组织，并在适当的模具中充满OCT，然后在冷冻的异戊烷中速冻。将10μm厚的冷冻切片黏附在具有ST空间条形码的阵列上，并将相邻的连续冷冻切片(8μm厚)黏附在用于IHC染色(EpCAM或其他标记物)的常规载玻片上。为了进行下一步处理，将组织在-20℃预冷的甲醇中固定30分钟，然后进行H&E染色。最后，将切片以40倍分辨率在Leica SCN400 F全片扫描仪上拍摄、扫片。捕获理想的组织形态信息并确保RNA不降解(RIN≥7)后，立即通过Visium Spatial Tissue Optimization Kit试剂盒(10x Genomics)进行组织通透性和逆转录实验。最终，通过第二链合成和变性制备了ST文库，并通过NovaSeq 6000(Illumina)进行了测序。印在阵列上的每个spot的直径为50μm，从中心到中心的直径为100μm，覆盖面积为6.5×6.5mm

ST的原始序列使用Space Ranger分析软件(版本1.0.0，10x Genomics)，按照标准分析规则比对到GRCH38基因组，进行处理。将每个spot的UMI计数归一化，并通过所有spot的中位数转录本计数进行归一化。聚类分析基于Space Ranger软件中的K-Means算法。

10.数据获得

原始测序数据已保存在National Omics Data Encyclopedia中，登录号为OEP000991。

二、结果

1.CIL-seq方法的开发

本发明选择了用于标记肝干细胞或LCSC的上皮细胞粘附分子(EpCAM)作为肝干细胞的标记分子[Huch,M.,et al.,Long-term culture of genome-stable bipotent stemcells from adult human liver.Cell,2015.160(1-2):p.299-312.Aizarani,N.,et al.,A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelialprogenitors.Nature,2019.572(7768):p.199-204.Yamashita,T.,et al.,EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.Gastroenterology,2009.136(3):p.1012-24.Yamashita,T.,et al.,Discrete nature of EpCAM+and CD90+cancer stem cells in humanhepatocellular carcinoma.Hepatology,2013.57(4):p.1484-97.Matsumoto,T.,et al.,Proliferating EpCAM-Positive Ductal Cells in the Inflamed Liver Give Rise toHepatocellular Carcinoma.Cancer Res,2017.77(22):p.6131-6143.]。为了探索肿瘤和癌旁组织中LCSC和其他EpCAM染色标记的细胞之间的遗传和表观遗传差异，我们开发了结合IHC，LCM和单细胞测序技术的CIL-seq方法(图1A和材料与方法)。首先，为了更好地获得LCSC供进一步研究，我们对冷冻切片进行了EpCAM IHC染色。其次，我们使用LCM在多个空间区域中更精确，更直观地捕获所需细胞，这有助于研究肿瘤生物学和异质性[Rozenblatt-Rosen,O.,et al.,The Human Tumor Atlas Network:Charting Tumor Transitionsacross Space and Time at Single-Cell Resolution.Cell,2020.181(2):p.236-249.Zhai,W.,et al.,The spatial organization of intra-tumour heterogeneity andevolutionary trajectories of metastases in hepatocellular carcinoma.NatCommun,2017.8:p.4565.]。然后，为了测试IHC过程是否会破坏基因组DNA的完整性，我们分别选取了约40个聚在一起的同类型的纯的一团细胞(HCC细胞或癌旁肝实质细胞(PL)，进行基于单细胞技术的WGS建库分析。几个相同类型细胞的同时测序可以尽可能减少由单细胞的全基因组扩增引起的固有的单碱基假阳性。最后，WGS结果显示令人满意的覆盖率；在15倍的平均测序深度下，WGS以≥1倍的覆盖率覆盖了约78％至80％的基因组(表1)，证实了基因组DNA的完整性。

表1.基于单细胞技术的全基因组，WES和WGBS文库测序分析质控结果

2.肝癌患者LCSC的特征

混合型HCC-CCA是原发性肝癌(PLC)的一种罕见类型(少于5％)，具有混合分化特点(图6)，其诊断取决于术后组织病理学。混合型HCC-CCA中的某些癌细胞具有干细胞特性[Brunt,E.,et al.,cHCC-CCA:Consensus terminology for primary liver carcinomaswith both hepatocytic and cholangiocytic differentation.Hepatology,2018.68(1):p.113-126.Munoz-Garrido,P.and P.M.Rodrigues,The jigsaw of dualhepatocellular-intrahepatic cholangiocarcinoma tumours.Nat Rev GastroenterolHepatol,2019.16(11):p.653-655.]。因此，这种类型的肝癌可以给我们提供一种很好的直接来自于实际病人肿瘤的研究对象，来研究人类CSC并比较同一肝癌样品中LCSC与HCC或CCA细胞之间的异同。我们收集了手术切除的、术前诊断为原发性肝癌的肝癌样品。根据临床病理诊断，在总共收集到的35例病例(表3)中鉴定出1例混合型HCC-CCA病例(患者P2，表2)。幸运的是，这种混合型HCC-CCA标本是干细胞特征类型，这正是我们所需要研究的确切类型。病理组织细胞学检查(图7)显示肿瘤组织中共存三种不同类型的实质细胞：HCC细胞，CCA细胞和表达肝干细胞标志物的LCSC，包括EpCAM，细胞角蛋白19(CK19)，OV6和Sal样蛋白4(SALL4)，约占整个肿瘤组织的10％(图8)。一些LCSCs成克隆样成簇生长，并每个克隆内的细胞形态在显微镜下差别不明显(图7)。

表2.本研究中患者P2的临床病理特征

通过联合EpCAM染色和细胞形态，可以将癌旁组织中的肝实质细胞进一步细分为两种类型：最常见的类型是EpCAM阴性细胞，即普通PL细胞，另一种类型是EpCAM阳性细胞，对应于癌旁胆管反应(paratumor ductular reaction，PDR)细胞(图7)。在PDR细胞中，通常认为每个克隆都包含一部分肝干细胞[Sato,K.,et al.,Ductular Reaction in LiverDiseases:Pathological Mechanisms and Translational Significances.Hepatology,2019.69(1):p.420-430.]。因此，EpCAM免疫染色结合细胞形态学特征可以清楚地区分癌旁组织中的两种肝实质细胞和肿瘤组织中的三种实质细胞。在LCSC与HCC细胞或CCA细胞之间的交界处，可以清楚地观察到一些移行区域(图1B)，这暗示了HCC和CCA细胞可能源自LCSC。

LCSC和PDR细胞具有相似的特征标志物，例如EpCAM，CK19，OV6和SALL4(图7)。因此，LCSC在组织形态学和关键的肝干细胞的标志物方面都与PDR细胞极为相似。我们调查了2017年至2019年接受手术切除治疗的12603例PLC患者的病理切片。其中，278例(2.2％)被病理诊断为HCC-CCA。在HCC-CCA病例中，在58例中观察到如患者P2那样的LCSC。我们还调查了265例HCC患者，发现可以观察到35例有这样LCSC的肝癌，但LCSC克隆的数量远少于HCC-CCA。然而，值得注意的是，LCSC的Ki-67阳性染色明显多于PDR细胞(图1C和图7)，表明LCSC的增殖活性更高。

3.全外显子测序(WES)分析显示LCSC只有很少的关键遗传变化

我们基于CIL-seq对样本P2进行了WES分析。根据上述EpCAM染色，我们从冰冻切片中分离出5种类型的细胞样品(图1D和图9)，包括肿瘤中的三个成分：LCSC(3个样品)，CCA细胞(4个样品)和HCC细胞(2个样本)；还包括了来自配对癌旁的两个成分：PDR细胞(3个样品)和PL细胞(4个样品)。另外，我们使用该患者癌旁组织(图1D和图9)中的大量免疫浸润细胞(约500个细胞)作为正常的基因组参考。总的来说，我们对共计17个样品制备了WES文库并进行测序。对17个样品之一的E3A进行了技术重复测序，结果显示出良好的测序一致性(图10)。每种类型的至少两个样本具有良好的覆盖度(平均目标深度>62x)(表1)。

我们利用两种算法来识别体细胞单核苷酸变异(SNV)，并通过常用的过滤器(材料和方法)去除了假阳性。最终，我们在所有样品中检测到125个SNV，Sanger测序进一步证实了SNV检测的准确性。它们主要是C到T的转换(图11A)，与先前报道的相似[Marquardt,J.U.,J.B.Andersen,and S.S.Thorgeirsson,Functional and genetic deconstructionof the cellular origin in liver cancer.Nat.Rev.Cancer,2015.15(11):p.653-67.Blokzijl,F.,et al.,Tissue-specific mutation accumulation in human adultstem cells during life.Nature,2016.538(7624):p.260-264.Zhu,M.,et al.,SomaticMutations Increase Hepatic Clonal Fitness and Regeneration in Chronic LiverDisease.Cell,2019.177(3):p.608-621.e12.]。通过对125个SNV进行聚类分析，可以清楚地看到，各类细胞的不同样品聚在一起。有趣的是，LCSC样本与癌旁样本而非HCC或CCA样本聚集在一起(图2A)。

其中大部分SNV在HCC、CCA样品中检测到(分别为73/125和70/125)，并且SNV的数量与以前在HCC或混合型HCC-CCA样品中发现的数量一致[Schulze,K.,et al.,Exomesequencing of hepatocellular carcinomas identifies new mutational signaturesand potential therapeutic targets.Nat Genet,2015.47(5):p.505-511.Lin,D.C.,etal.,Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.CancerRes,2017.77(9):p.2255-2265.Wang,A.,et al.,Whole-exome sequencing reveals theorigin and evolution of hepato-cholangiocarcinoma.Nat Commun,2018.9(1):p.894.Xue,R.,et al.,Genomic and Transcriptomic Profiling of CombinedHepatocellular and Intrahepatic Cholangiocarcinoma Reveals Distinct MolecularSubtypes.Cancer Cell,2019.35(6):p.932-947.e8.]。值得注意的是，在LCSC中仅检测到少量的SNV(总共28个)，并且在样品之间各自拥有较多独立的SNV(图11，B和C)，提示LCSC具有很强的异质性。HCC和CCA细胞共享52个SNV(图2B)，表明是单克隆起源，这与以前关于混合型HCC-CCA单克隆起源的报道一致。LCSC中超过一半的突变(17/28)与HCC和CCA细胞中的突变重合(图2B)，提示LCSC和HCC或CCA细胞的相同起源。先前的报道显示正常或肝硬化肝细胞中存在大量SNV[Brunner,S.F.,et al.,Somatic mutations and clonal dynamicsin healthy and cirrhotic human liver.Nature,2019.574(7779):p.538-542.]。与这些发现一致，我们在PL细胞中发现了许多SNV(总数为43)。但是，PL细胞中的SNV数量远多于LCSC，并且与LCSC中的SNV重叠较少(图2B)，这表明LCSC不太可能起源于PL细胞。

在具有错义突变或终止密码子变化的69个基因中，LCSC中仅检测到了这些SNV的一小部分(图2C)。我们发现有3个基因(DHX9，ERBB4，FAM46D)是报道的299个驱动基因中的[Bailey,M.H.,et al.,Comprehensive Characterization of Cancer Driver Genes andMutations.Cell,2018.173(2):p.371-385.e18.]，一个(ZFHX4)在HCC的161个驱动基因中。这些驱动基因突变仅在HCC或CCA细胞中检测到了。综上所述，这些结果表明，HCC和CCA中发生了对肿瘤生长十分重要的基因的突变。然而，在LCSC中发生的突变明显较少。

接下来，我们使用WES数据分析了拷贝数改变(CNA)。由于某些样品的覆盖度低，我们的分析仅集中在扩增的基因座上。我们在癌中发现了许多CNA扩增区域，但大多数集中在HCC和CCA细胞中，包括肝癌中常常被检测到的染色体8q的扩增，而CNA区域却很少在LCSCs中检测到(图2D)。我们还分析了扩增的基因，总体而言，与CNA扩增区域一致，在基因水平上，LCSC的扩增基因也明显少于HCC和CCA细胞(图12)。聚类进化树分析清楚的看到，与SNV类似，LCSC与癌旁而不是HCC、CCA更接近(图2E)，并且该分析还表明HCC和CCA细胞可能源自LCSC，这也符合前述的这些细胞之间的组织学特点(图1B)。有趣的是，其中一些扩增基因是原癌基因，例如MYC，它也在一个LCSC样品中被扩增(图13)，而MYC的激活被认为与肝脏中CSC的形成有关[Marquardt,J.U.,J.B.Andersen,and S.S.Thorgeirsson,Functional andgenetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer.Nat.Rev.Cancer,2015.15(11):p.653-67.Chow,E.K.,et al.,Oncogene-specific formation ofchemoresistant murine hepatic cancer stem cells.Hepatology,2012.56(4):p.1331-41.]。总之，WES数据显示，与HCC和CCA细胞相比，LCSC仅具有少量SNV和CAN，但是可能存在一些关键的变化，例如原癌基因MYC的扩增。

4.全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)分析揭示了LCSC的少量的关键表观遗传变化

表观遗传畸变在癌症发展中起着重要作用，我们的WES数据显示，LCSC在遗传方面变化不显著。我们想知道LCSF细胞在表观遗传方面具有什么变化，使它们成为癌而不是正常细胞。考虑到我们所研究样品的实际情况，我们主要对这些样品的DNA甲基化进行了研究，其它表观遗传研究学内容比如组蛋白修饰、染色质可接近性等与这个流程不太合适。但是，DNA甲基化是最重要的DNA修饰，并且与其他表观遗传研究内容密切相关。我们使用CIL-seq对样本P2中捕获的不同细胞克隆(图1D和图9)进行了WGBS分析。大多数样品的亚硫酸氢盐转化效率大于98％，并且大多数样品的CpG覆盖度(表1)高于以往的报道的单细胞全基因组甲基化测序[Smallwood,S.A.,et al.,Single-cell genome-wide bisulfitesequencing for assessing epigenetic heterogeneity.Nat Methods,2014.11(8):p.817-820.Gravina,S.,et al.,Single-cell genome-wide bisulfite sequencinguncovers extensive heterogeneity in the mouse liver methylome.Genome Biol,2016.17(1):p.150.Linker,S.M.,et al.,Combined single-cell profiling ofexpression and DNA methylation reveals splicing regulation andheterogeneity.Genome Biol,2019.20(1):p.30.]。

大体上，与癌旁细胞相比，HCC和CCA细胞发生了很大的DNA去甲基化(图3A)。但是，LCSC的总体甲基化水平变化不大(图3A)，表明与癌旁细胞之间的关系更接近。此外，肿瘤细胞中存在广泛的DNA甲基化异质性(图14A)，与以往报道一致[Mazor,T.,et al.,Intratumoral Heterogeneity of the Epigenome.Cancer Cell,2016.29(4):p.440-451.Zhang,Q.,et al.,Integrated multiomic analysis reveals comprehensivetumour heterogeneity and novel immunophenotypic classification inhepatocellular carcinomas.Gut,2019.68(11):p.2019-2031.Marusyk,A.,M.Janiszewska,and K.Polyak,Intratumor Heterogeneity:The Rosetta Stone ofTherapy Resistance.Cancer Cell,2020.37(4):p.471-484.]。值得注意的是，LCSC样品之间也同样存在明显的DNA甲基化异质性(图14B)。DNA甲基化模式的聚类分析(图3B)清楚地表明，HCC和CCA细胞聚在一起，而癌旁细胞聚在一起。有趣的是，LCSCs与癌旁细胞聚在一起，因此，在甲基化谱上，与WES的数据(图2，A和E)类似，比于HCC和CCA，LCSC更接近癌旁细胞。

通过比较不同样品类型的差异甲基化区域(DMR)，我们发现LCSC与癌旁细胞之间具有的差别最少，但与HCC和CCA细胞的差别很大，这与总体DNA甲基化水平一致(图3B)。具体而言，LCSC与PDR细胞之间发现了10.1％的DMR，而在LCSC与HCC或CCA细胞之间发现了27.1％或32.3％的DMR(图3C和表3)。

表3.P2不同类型样品之间的DMR

福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)的样品来源比冷冻组织丰富得多。我们选择了一个FFPE的HCC-CCA样品(P4)，并基于CIL-seq方法(图15)进行了WGBS分析。尽管测序数据的质量远低于冷冻组织的质量(表1)，但我们仍然可以看到LCSC的总体甲基化水平和DNA甲基化模式与PDR细胞相似(图15)，这与P2的结果一致。综上所述，这些结果表明，在整体的DNA甲基化水平中，与癌旁细胞相比，HCC和CCA细胞发生了很大的甲基化变化，而LCSC与癌旁细胞之间的DNA甲基化水平差异较小。

接下来，我们探究了P2样品基因组中DMR的分布区域。总体而言，LCSC中发生的显著甲基化变化区域明显少于HCC和CCA细胞(图3D)。根据染色质的15种状态模型，HCC和CCA细胞发生的显著甲基化变化与在正常细胞中15种染色质状态的甲基化密切相关。显著的去甲基化都发生在那些原本在正常细胞中处于高甲基化状态的染色体状态，包括9_Het和15_Quies染色质状态，而高甲基化则都发生在那些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的染色体状态，包括1_TssA，10_TssBiv，11_BivFlnk和12_EnhBiv状态(图3D，4A和图16)。但是，在LCSC中，这些染色质状态中发生的甲基化变化明显较少，这与LCSC中总体甲基化水平的较小变化一致(图3A)。

值得注意的是，我们发现LCSC中的少数重要染色质区域具有与HCC和CCA细胞相同的DNA甲基化趋势。HCC和CCA细胞中发生了显著的PcG-marked区域(包括ES_10_TssBiv；ES_11_BivFlnk；12_EnhBiv；ES_13_ReprPC)的高甲基化变化(图3D和4A)，与先前的发现一致，即在胚胎和成年祖细胞系统中，PcG标记的基因在癌症中发生甲基化的可能性更高[Easwaran,H.,et al.,A DNA hypermethylation module for the stem/progenitorcell signature of cancer.Genome Res,2012.22(5):p.837-49.].。此外，我们还发现，与PDR细胞相比，这些PcG标记区域中的两个在LCSC中已经发生了明显变化，包括二价染色质状态10_TssBiv和染色质状态13_ReprPC(图4A)。LCSC中这些高甲基化区域相对应的那些基因的功能主要涉及细胞分化和命运决定(图4B)，它们中一半以上(20/32)也对应于人胚肝中的二价基因[Yan,L.,et al.,Epigenomic Landscape of Human Fetal Brain,Heart,and Liver.J Biol Chem,2016.291(9):p.4386-98.]，例如APC2，它是肿瘤抑制因子APC的同源物。因此，LCSCs中这些区域的高甲基化变化可能会导致染色质状态受到限制，从而阻碍分化程序。综上所述，这些结果表明，尽管相比HCC和CCA中发生的显著甲基化变化，LCSC中的DNA甲基化变化很少，但LCSC的变化可能会导致染色质的限制性状态，这可能与肿瘤起始相关。

5.肝癌患者LCSC的微小遗传和表观遗传变化

HCC是PLC的主要类型。我们收集了一些冰冻组织，并从28例PLC病例中准备了冰冻切片。其中一名患者P7，经病理诊断为HCC，并具有明显的EpCAM+LCSC(图17)。我们使用CIL-seq(表1)对此样本进行了WES和WGBS分析。结果表明，LCSC和PDR细胞之间的遗传(SNV和CNV)差异和DNA甲基化模式差异很小(图5，A和B，以及图18)，与患者P2和P4的分析结果一致。有趣的是，在LCSC的微小遗传变化中，我们在驱动基因MGA中发现了一个stop gain突变，该突变也出现在HCC样本中。MGA在肺腺癌中显著突变，并参与MYC的负调控[Llabata,P.,et al.,Multi-Omics Analysis Identifies MGA as a Negative Regulator of theMYC Pathway in Lung Adenocarcinoma.Mol Cancer Res,2020.18(4):p.574-584.]。

癌症发展过程中，一个重要的表观遗传学变化就是DNA的整体去甲基化。我们发现，在哺乳动物细胞中，5-甲基胞嘧啶(5mC)可被氧化为去甲基化中间体5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。最近，我们发现在肝癌的早期阶段，5hmC和5fC的总体含量有所下降[Liu,J.,et al.,Global DNA 5-Hydroxymethylcytosineand 5-Formylcytosine Contents Are Decreased in the Early Stage ofHepatocellular Carcinoma.Hepatology,2019.69(1):p.196-208.]，但尚不清楚LCSCs是否有这种变化。我们对P7以及P2和P4的FFPE切片样品进行了5mC，5hmC和5fC的免疫组化染色。结果显示，大多数LCSC与其他肿瘤实质细胞明显不同，后者的5hmC和5fC染色明显降低(图5C和图19A)。LCSC和PDR细胞之间在5mC，5hmC或5fC染色中几乎没有差异(图5C和图19A)。对65个具有明显LCSC的样品进行了检查(包括35例来自HCC患者的样品)，也显示了一致的结果(图5D和图19B)，这表明LCSC并未发生广泛的DNA去甲基化。总之，这些结果与WGBS分析的结果一致，都表明LCSC中发生了微小的DNA甲基化变化。

最后，由于LCSCs的遗传和表观遗传学变化并不显着，我们旨在确定肝LCSCs的RNA表达谱是否与癌旁细胞的RNA表达谱相似，于是对P7冷冻组织进行了空间转录组(ST)分析。我们获得了了4493个spot的转录组(图5E)，其平均深度为14455UMIS/spot，4064个基因/spot，它们可以清楚地区分肿瘤和癌旁细胞(图20)。进一步的聚类分析表明，肿瘤细胞具有广泛的异质性(图5E)。由于LCSC的比例很小，我们手动选择了肿瘤组织中的所有LCSC spot和癌旁组织中的PDR spot(图5F和图21A)。此外，我们随机选择了一些肿瘤或癌旁实质细胞的spot。整个表达谱的聚类分析表明，LCSC和PDR细胞聚在一起(图21B)。这些spot的11个肝相关基因的表达谱的聚类分析显示了相似的结果(图5G)，表明LCSC和PDR细胞之间的RNA表达模式只有很小的差异，与遗传和表观遗传变化的结果一致。

三、讨论

本研究的患者LCSC具有CSC特征，这些特征包括：具有肝干细胞标志，相比PDR细胞具有更高的增殖能力，组织病理学和遗传学证据显示LCSC细胞可能是HCC、CCA两类细胞的共同起源。然而，与同一患者中的HCC或CCA细胞相比，LCSC具有明显的遗传和表观遗传差异。我们的数据显示，HCC和CCA细胞已经发生了我们通常在人类癌症中看到的显著的遗传和表观遗传变化，但是LCSC仅发生了微小的遗传和表观遗传变化。

在一些混合型HCC-CCA中，CSC的比例通常比其他类型的肿瘤高得多。因此，这种混合型HCC-CCA可以为我们提供一个完美的肿瘤研究对象，以帮助研究人类CSC。此外，由于混合型HCC-CCA中的CSC可以分化为两种肿瘤实质细胞，因此更容易识别它们。然而，目前混合型HCC-CCA只能通过手术后的病理学检查来诊断，并且PLC中混合型HCC-CCA的比例很低，因此冷冻混合型HCC-CCA样本的收集十分困难。

我们在这项研究中开发的CIL-seq方法结合了IHC，LCM和单细胞测序技术，适用于稀少CSC的研究，尤其是考虑到空间异质性时。要获得单克隆CSC，原位捕获(例如LCM)是一种直接有效的方法。如果使用诸如细胞分选的方法，则无法获得有关细胞空间位置的信息。由于FFPE组织细胞中DNA的断裂，此类样品通常不适合用于基于单细胞的遗传和表观遗传测序研究。如本研究所示，冷冻切片结果要好得多。

当前对整个肿瘤组织的遗传和表观遗传学变化的检测无法反映CSC中发生的情况，因为来自大量肿瘤标本的信号主要由大量的肿瘤实质细胞占据，从而使得稀少的CSC无法检测到。因此，靶向这类肿瘤中那些大多数的遗传和表观遗传学变化的治疗方法可能对CSCs无效，因为CSCs可能不具有这些变化，这可能是治疗耐药和癌症复发的最重要原因之一。

总之，我们在肝癌患者的CSC中仅发现了少数的遗传和表观遗传变化。当然，这种情况是否在其他类型的癌症患者中普遍存在，还需要更深入的研究。识别每个特定癌症患者的CSC和其他肿瘤实质细胞中的微小但关键的遗传和表观遗传变化，例如本研究中患者P2中的MYC扩增或患者P7中的MGA突变，可能会更有效地指导人类癌症的治疗。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。