一种基于Cas蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及一种利用Cas蛋白对用靶标核酸分子进行定量检测的方法。

背景技术

普遍存在于细菌和古细菌中的成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindrome repeats，CRISPR)和CRISPR相关核酸酶(CRISPR associated proteins，Cas)是细菌抵抗外源质粒或噬菌体感染的防御体系，现代科学家相继发现了多种Cas蛋白及其工作机制。Cas12a在CRISPR RNA(crRNA)引导下特异识别靶双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)并被激活，活化后的Cas12a既能特异地切割靶dsDNA分子，又能非特异地切割无关的单链DNA(single stranded DNA，ssDNA)，即附带切割活性。

利用Cas12a的附带切割活性检测靶dsDNA分子，现有技术方案原理：①根据待测靶dsDNA分子序列设计引物，通过PCR或等温扩增方法扩增靶dsDNA分子，如果靶dsDNA分子存在则扩增体系中将出现靶dsDNA分子的扩增产物，②根据待测靶dsDNA分子序列设计并合成crRNA，引导Cas12a识别靶dsDNA分子，③取扩增产物，与Cas12a、crRNA和探针ssDNA(荧光探针)共孵育，④孵育结束后通过仪器检测是否有荧光信号判断Cas12a是否被激活，从而对靶dsDNA分子进行定性检测。

Chen等将Cas12a与重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术结合，Li等将Cas12a与PCR技术结合，分别开发出基于Cas12a的核酸检测技术DETECTER和HOLMES，基本原理为：根据靶dsDNA设计crRNA，扩增后的靶dsDNA分子可被Cas12a-crRNA复合物特异识别，同时激活Cas12a，利用活化后Cas12a的附带切割活性切割ssDNA探针，探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团，探针被切割后释放荧光信号，通过读取探针切割后释放出的检测信号进而检测靶dsDNA(图1)

但基于Cas12a的核酸检测技术存在以下局限性：

1.原间隔子相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)的限制

Cas12a识别靶dsDNA的第一个前提条件是：靶dsDNA必须存在Cas12a所需的PAM序列(TTTN或TTN)。只有当PAM序列存在的条件下，才有可能在PAM序列3’下游设计出crRNA并进行检测(图2)。如果目标序列中无PAM序列时，则不能设计出crRNA，因而不能用Cas12a进行检测。PAM序列极大地限制了目标序列的选择范围和crRNA设计的灵活性。

2.crRNA的限制

Cas12a识别靶dsDNA的第二个前提条件是：靶dsDNA必须存在合适的crRNA识别区序列。crRNA是引导Cas12a识别并决定检测特异性的关键分子。即使检测的目标序列中存在PAM序列，但如果PAM序列下游无法设计出特异性高的crRNA(图2)，将不能进行检测或导致检测的特异性差。

3.局限于定性检测

现有的Cas12a核酸检测技术，大多数为定性检测，定性检测只能判断目标核酸分子的有无，但是不能判断目标核酸分子拷贝数的多少。仅有少数研究从概念上实现了定量检测

4.局限于病原体检测

病原体基因组序列相对较大，有望寻找到合适的PAM序列并设计出特异性较高的crRNA，因此目前已有多篇文献报道将Cas12a核酸检测技术运用于寨卡病毒、登革热病毒

理论上Cas12a核酸检测技术可用于人类遗传病检测，但是由于存在上述局限性，现有的Cas12a核酸检测技术在人类遗传病检测中面临2方面的困难。第一，对于点突变或小插入缺失而言，因其变异范围较小，局限于1个或几个碱基，其附近常缺少PAM序列或难以设计出合适的crRNA，故不能用现有的Cas12a核酸检测技术进行检测。第二，对于大片段的插入或缺失而言，通常需要对插入或缺失序列的拷贝数进行定量检测才能区分正常人、携带者和患者。

本领域技术人员所公知，正常人通常有2拷贝的SMN1基因7号外显子，SMA携带者的SMN1基因7号外显子发生杂合缺失(拷贝数＝1)，SMA患者的SMN1基因7号外显子发生纯合缺失(拷贝数＝0)，现有的Cas12a核酸检测技术可以通过定性检测区分SMA患者和非SMA患者(正常人或SMA携带者)，但不能进一步区分正常人和SMA携带者，因此，现有的Cas12a核酸检测技术存在诸多缺陷。

参考文献

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发明内容

本发明目的是通过探针连接的策略人工引入PAM序列和crRNA识别区，而不再依赖于靶dsDNA上的PAM序列和crRNA识别区，即使靶dsDNA上无PAM序列或难以设计特异的crRNA，也能对靶dsDNA进行检测。在探针连接的基础上，通过引入内参基因，对目的基因的拷贝数进行定量检测。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种基于Cas蛋白的检测方法，包括以下步骤：

S1、根据目的基因和内参基因的序列设计合成相应的连接探针，并根据连接探针设计合成扩增连接探针的PCR引物和识别连接探针的crRNA；

S2、分别将目的基因和内参基因与相应的连接探针杂交，杂交后的连接探针经DNA连接酶连接成单链DNA，再采用步骤S1中的PCR引物对单链DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；后用Cas蛋白、和步骤S1中的crRNA和荧光探针体系检测扩增产物，进而定量检测目的基因；

所述连接探针包含PAM序列和crRNA识别区序列。

根据目的基因或内参基因设计合成的连接探针一般是两条DNA序列，也有可能是多条，例如4条，连接探针与目的基因杂交之后形成的杂交后的连接探针一般是两条，也有可能是多条。

设计合成连接探针需要进行验证，验证有效性(能否连接成功)，特异性(能否特异识别靶序列)，最终使用有效且特异的连接探针。

优选的，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas12b或Cas14。

优选的，所述Cas蛋白为Cas12a。

Cas12a和Cas12b可以直接识别dsDNA，Cas13识别的靶核酸分子是单链RNA(singlestranded RNA，ssDNA，Cas14识别的靶核酸分子是ssDNA。应用实例中的靶核酸分子为dsDNA，可以用Cas12a或Cas12b直接识别。如果使用Cas13则需增加检测步骤，从靶dsDNA分子转录出ssRNA分子才能进行检测。如果使用Cas14也需增加检测步骤，需降解靶dsDNA分子其中1条链，形成ssDNA分子后才能进行检测。

优选的，所述步骤S2中利用DNA连接酶将杂交后的连接探针(F和R)连接成ssDNA。

优选的，所述DNA连接酶为耐热型DNA连接酶。

探针连接反应中，首先需对待测的dsDNA进行95℃孵育，使dsDNA解链成2条ssDNA，随后逐渐降温，连接探针(F和R)才能与ssDNA进行杂交。杂交完成后，连接探针(F和R)在连接酶作用下连接形成1条ssDNA。如果选用的DNA连接酶不耐热，为了避免DNA连接酶在95℃解链的过程中失活，配制连接反应体系时不能直接加入连接酶，需经过95℃解链和降温杂交后才能加入连接酶，增加了操作步骤和交叉污染的风险。耐热型DNA连接酶具有热稳定性，95℃条件下不会发生失活，配制连接反应体系时可以直接加入连接酶，反应过程中无需进行加样，一次完成连接反应。

优选的，所述耐热型DNA连接酶为HiFi Taq DNA Ligase。

HiFi Taq DNA Ligase不仅耐热，而且能识别连接探针与靶ssDNA间的错配碱基，尤其是当连接探针与靶ssDNA间的碱基错配位于上游探针的3’端或下游探针的5’端时，即使上下游连接探针已经与靶ssDNA杂交，也不会被连接。利用HiFi Taq DNA Ligase对碱基错配的敏感性，能提高检测的特异性。

优选的，所述步骤S2中将目的基因、内参基因与相应连接探针的连接反应在一个体系中进行。

目的基因、内参基因的连接反应在一个体系中完成既可以减少操作步骤，又能降低检测成本。

本发明还要求保护一种连接探针，所述连接探针的序列包含PAM序列和crRNA识别区序列。

优选的，所述PAM序列为TTTN(SEQ ID NO.16)或TTN(SEQ ID NO.17)。

优选的，所述crRNA识别区序列包含18-23个碱基。

本发明还要求保护一种试剂盒，所述试剂盒包含如上述所述的连接探针、扩增如上述连接探针的PCR引物和识别如上述的连接探针的crRNA。

本发明还要求保护上述试剂盒在制备检测SMN1基因7号外显子的试剂中的应用。

优选的，所述目的基因为SMN1基因7号外显子；所述内参基因为ALB。

所述ALB基因在人基因组中的拷贝数为2，且发生缺失或重复可能性小。

优选的，所述连接探针的序列如SEQ ID NO.1-4所示；扩增如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的PCR引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示；识别如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的crRNA的序列如SEQ ID NO.7-8所示，如表1所示。

表1 PCR引物、连接探针和crRNA序列信息

优选的，所述步骤S2中，将目的基因和内参基因与如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针杂交，并采用如SEQ ID NO.5-6所示的PCR引物进行PCR扩增，再利用如SEQ ID NO.7-8所示的crRNA进行检测进行PCR扩增。

本发明还提供了所述连接探针在制备检测SMN1基因7号外显子的试剂中的应用。

一种扩增如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的PCR引物，所述扩增如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的PCR引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示。

本发明还提供了所述扩增如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的PCR引物在制备检测SMN1基因7号外显子的试剂中的应用。

一种识别如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的crRNA，所述识别如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的crRNA的序列如SEQ ID NO.7-8所示。

本发明还提供了所述识别如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的crRNA在制备检测SMN1基因7号外显子的试剂中的应用。

一种试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针、扩增如SEQ IDNO.1-4所示的连接探针的PCR引物和识别如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针的crRNA。

优选的，所述试剂盒包含如SEQ ID NO.1-4所示的连接探针、如SEQ ID NO.5-6所示的PCR引物和如SEQ ID NO.7-8所示的crRNA。

本发明还提供了所述试剂盒在制备检测SMN1基因7号外显子的试剂中的应用。

优选的，所述连接反应体系为：

优选的，所述连接反应条件如图4所示，经过反应得到连接产物。

优选的，所述PCR扩增体系如下：

优选的，所述荧光检测目的基因和内参基因分两个体系进行，分别检测SMN1和ALB基因。

Cas12a在crRNA引导下一旦识别目标序列则被激活，活化后的Cas12a将非特异性的切割探针分子释放检测信号。前述的连接和扩增反应在1个体系中完成，连接扩增产物中既有目的基因的连接扩增产物，也有内参基因的连接扩增产物。两种产物的crRNA识别区序列不同，能在不同的crRNA引导下被Cas12a识别。当1个体系只有1种crRNA时，能分别检测目的基因和内参基因的连接扩增产物。当1个体系中有两种crRNA时，则不能特异性地检测目的基因和内参基因的连接扩增产物。

下面对本发明做进一步的解释：

不同样本中靶dsDNA拷贝数会因浓度不同而存在差异，为了避免样本浓度对检测结果的干扰，选取样本中的内参基因作为参照，消除浓度差异对检测结果的影响，从而实现对靶dsDNA的相对定量检测，并可以在不同样本间进行比较。

如果仅根据靶dsDNA和内参dsDNA序列设计合成PCR引物，可能因为引物序列、扩增片段长度等因素导致靶dsDNA和内参dsDNA扩增效率不同，出现扩增偏倚，最终影响相对定量结果的准确性。通过连接探针策略不仅可以引入相同的PCR扩增引物结合区，而且能控制扩增片段长度的差异，最终使靶dsDNA和内参dsDNA扩增效率相近，提高检测的精确度。更重要的是，通过连接探针策略还能起到定量检测的效果。

本发明的检测原理：

①SMN1基因7号外显子作为目的基因，人白蛋白基因(Albumin，ALB)作为内参基因。

②SMN1连接探针F/R的连接识别区与SMN1基因7号外显子完全互补，95℃解链后退火，SMN1连接探针F/R可与SMN1基因7号外显子杂交，在连接酶的作用下SMN1的连接探针F/R被连接成1条单链，单链2端为PCR引物F/R的结合区域，经PCR扩增后生成双链的连接扩增产物，双链连接扩增产物包含PAM序列和crRNA识别区序列。SMN1连接探针F的3’端碱基与SMN2基因7号外显子存在1个错配，SMN1连接探针F/R即使与SMN2基因7号外显子杂交，也不能被连接酶连接成单链，不能通过PCR扩增生成连接扩增产物。ALB连接探针的连接原理同SMN1，且ALB连接探针的连接扩增产物含有与SMN1连接扩增产物相同的PCR引物F/R的结合区域、PAM序列和crRNA识别区序列(图3a)。

③正常人携带2拷贝的SMN1基因7号外显子和2拷贝的内参基因ALB，经连接和扩增后，2个基因连接扩增产物的拷贝数近似相同，最终SMN1与ALB荧光信号的比值接近于1；SMA携带者的SMN1基因7号外显子发生杂合缺失，SMN1基因7号外显子的连接扩增产物的拷贝数约为内参基因ALB连接扩增产物的1/2，最终SMN1与ALB荧光信号的比值接近于1/2；SMA患者的SMN1基因7号外显子发生纯合缺失，无SMN1基因7号外显子的连接扩增产物，而内参基因ALB的连接扩增产物可正常生成，最终SMN1与ALB荧光信号的比值接近于0(图3b)。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

①突破了PAM序列和crRNA的限制，即使在待测突变位点附近无PAM序列或不能设计出合适crRNA的情况下，也能通过探针人工引入PAM序列和crRNA并进行检测。

②建立了定量检测的方法，能定量检测变异位点的拷贝数，拓展了Cas12a核酸检测技术在定量检测中的应用。

③基于探针连接的Cas12a定量检测，目的基因和内参基因的连接和扩增反应可在1个反应体系内完成，体现了多重检测的能力，有利于减少操作步骤，降低检测成本。

附图说明

图1是现有技术中基于Cas12a的核酸检测技术原理示意图；

图2是PAM序列和crRNA识别区示意图；

图3是本发明基于探针连接的Cas12a定量检测原理示意图；

图4是本发明探针连接反应条件；

图5是本发明PCR反应条件；

图6是本发明验证基于探针连接的SMA-Cas12a定量检测方法区分正常人和SMA患者的能力；

图7是本发明检测正常人、携带者和SMA患者(各1例)的荧光值曲线图；

图8是本发明检测正常人、SMA携带者和SMA患者的荧光值比值；

图9为不同的SMN1 crRNA的条件下现有SMA-Cas12a荧光检测方法区分正常人和SMA患者的能力；

图10为本发明筛选SMN1连接探针的结果；

图11为本发明筛选ALB连接探针的结果。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是常染色体隐性遗传病，由脊髓前角运动神经元变性而导致骨骼肌出现进行性的肌无力和肌萎缩，病情逐渐加重，出现吞咽和自主呼吸困难，最终因呼吸肌麻痹而死亡，其发病率为1/6000-1/10000。SMA属于严重致死、致残的遗传病，且人群中致病基因携带率高达1/40-1/50，给患者家庭和社会带来了沉重的负担，已构成严重的公共卫生问题。

SMA的致病基因是编码运动神经元存活蛋白(survival motor neuron，SMN)的SMN1基因。虽然人类基因组中存在与SMN1基因高度同源的拷贝——SMN2基因，但是SMN1和SMN2基因在7号外显子存在c.840C>T差异，导致SMN2基因不能代偿SMN1基因的功能。SMN1基因7号外显子缺失是导致SMA的热点突变，95％的SMA患者存在SMN1基因7号外显子纯合缺失。

基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测方法

1.方法

(1)根据SMN1基因7号外显子和内参ALB基因设计合成连接探针、连接探针PCR引物和探针crRNA，如表1所示：

表1 PCR引物、连接探针和crRNA序列信息

(2)基于探针连接的SMA-Cas12a检测方法识别SMN1基因7号外显子的特异性

①选取正常人、SMA患者的gDNA标本和空白对照(水)各1份，正常人和SMA患者的gDNA标本经MLPA检测验证SMN1基因7号外显子的拷贝数，正常人为2拷贝，SMA患者为0拷贝。

②SMN1的探针连接反应体系如下：

③反应体系配制完成后颠倒混匀30次，短暂离心，置于PCR仪进行探针连接。

探针连接反应如图4所示。

④取连接反应产物4μL作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如图5所示。

⑤取PCR产物进行SMA-Cas12a荧光探针检测，每份样本设3个复孔，检测使用的LbaCas12a(NEB，M0653T)浓度为100μM，先按10份配制混合体系，混合体系如下：

混匀后按18μL/管分装10管，每管再加入PCR扩增产物2μL，加盖后混匀，短暂离心后37℃孵育，反应开始读取初始荧光值，此后每1min读取1次荧光值。△荧光值＝终点荧光值(30min)-初始荧光值(0min)。比较正常人、SMA患者和空白对照(水)三者之间的荧光值差异。

结果为：在连接5次扩增30循环的条件下，正常人的荧光信号显著高于SMA患者和空白对照(水)，且正常人的荧光信号是SMA患者的35.39倍(图6)。结果表明：(1)正常人gDNA样本中含有SMN1基因7号外显子，探针识别SMN1基因7号外显子杂交，杂交后经DNA连接酶连接为单链DNA，单链DNA经PCR扩增生成大量的连接扩增产物。连接扩增产物中含有人工导入的PAM和crRNA识别区序列，被Cas12a/crRNA识别并激活Cas12a，活化后的Cas12a非特异切割荧光探针生成明显的荧光信号。(2)SMA患者和空白对照(水)中无SMN1基因7号外显子，探针不能被连接成单链，不能经PCR扩增生成连接扩增产物，无明显的荧光信号生成。(3)基于探针连接的SMA-Cas12a检测方法区分正常人和SMA患者的特异性较高，两者之间的荧光值差异达35.39倍。

(3)建立并验证基于探针连接的SMA-Cas12a定量检测方法

①选取正常人、SMA携带者和SMA患者gDNA标本各20份(共60份)，所有样本均经MLPA检测验证SMN1基因7号外显子的拷贝数，正常人为2拷贝，SMA携带者为1拷贝，SMA患者为0拷贝。

②测定样本的DNA初始浓度，取gDNA 10μL，加适量TE液稀释，终浓度在5-10ng/μL的范围内。稀释后的gDNA样本分批进行检测。每批检测10份样本，其中gDNA样本9份，空白对照(水)1份。

③SMN1和ALB的探针连接反应在1个体系中进行，按10份配制SMN1和ALB的探针连接混合体系。

SMN1和ALB探针连接混合体系

混合体系配制完成后，颠倒混匀，短暂离心。将SMN1和ALB的探针连接混合体系按22.5μL/管分装至10个PCR管中。

取稀释后的gDNA样品按2.5μL/管加入分装后的探针连接混合体系，每管总体积25μL，颠倒混匀30次，短暂离心，置于PCR仪进行探针连接。

探针连接反应条件如图4所示。

④PCR扩增在1个体系中进行，按10份配制SMN1和ALB的PCR扩增混合体系。

PCR扩增混合体系

混合体系配制完成后，混匀，短暂离心。将PCR扩增混合体系按16μL/管分装至10个PCR管中。取探针连接产物4μL加入PCR扩增混合体系中，每管总体积20μL。混匀后短暂离心，置于PCR仪进行扩增。

PCR反应条件如图5所示。

⑤SMA-Cas12a荧光探针检测分2体系进行，分别检测SMN1和ALB基因，SMN1管和ALB管分别设3个复孔。因为分别使用探针crRNA1检测SMN1基因，探针crRNA2检测ALB基因检测，所以分别按30份配制配制混合体系。检测使用的Lba Cas12a(NEB，M0653T)浓度为100μM。

SMN1混合体系如下：

ALB混合体系如下：

混合体系配制完成后颠倒混匀，短暂离心。

每份gDNA样本分别检测SMN1和ALB的荧光值，SMN1和ALB各设3个复孔，共60孔。将8连管置于预冷的PCR冰盒中，按18μL/孔将混合体系分装至60孔。同一份gDNA样本的连接扩增产物连接扩增产物按2μL/孔加至对应的3个复孔中(总体积20μL)。加盖后短暂离心，37℃孵育，反应开始读取初始荧光值，此后每1min读取1次荧光值。△荧光值＝终点荧光值(15min)-初始荧光值(0min)。通过计算SMN1△荧光值与ALB△荧光值的比值判断SMN1基因7号外显子的拷贝数。

结果如下：

①正常人SMN1基因7号外显子和内参ALB基因的荧光值曲线几乎重合，提示SMN1基因7号外显子与内参ALB基因的拷贝数相同(图7-a)。SMA携带者SMN1基因7号外显子的荧光值曲线在始终低于内参ALB基因的荧光值曲线，提示SMN1基因7号外显子的拷贝数小于内参ALB基因的拷贝数(图7-b)。SMA患者SMN1基因7号外显子的荧光值曲线处于基线附近，而内参ALB基因的荧光值曲线正常，提示SMN1基因7号外显子发生纯合缺失(图7-c)。结果表明：基于探针连接的SMA-Cas12a定量检测的检测原理可行；引入内参ALB基因一方面有利于对SMN1基因7号外显子拷贝数进行相对定量，另一方面可作为质控因素，以排除因连接、扩增和荧光检测失败导致的假阳性。

②60例样本的验证结果

正常人、携带者和SMA患者3组之间的荧光值比值仍存在显著性差异，正常人组的荧光值比值均数和标准差为1.02±0.09(理论值：1)，SMA携带者组的荧光值比值均数和标准差为0.67±0.06(理论值：0.5)，SMA患者组的荧光值比值均数和标准差为0.06±0.02(理论值：0)(图8)。结果表明：基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测可对SMN1基因7号外显子的拷贝数进行相对定量检测，能区分正常人、SMA携带者和SMA患者。

实施例2

对比实验方法——用现有的Cas12a检测方法和原理检测SMA

(1)根据SMN1基因7号外显子设计扩增引物和crRNA。

现有的Cas12a检测方法需从目标基因序列中寻找PAM序列和设计crRNA。因为人基因组存在与SMN1基因高度同源的SMN2基因，为避免SMN2基因对SMN1基因7号外显子检测的干扰，已将SMN1和SMN2基因c.840的差异碱基(C-T)包含在crRNA的识别区内，以特异性识别SMN1基因7号外显子。为进一步提高检测的特异性，通过引入错配碱基和改变crRNA识别区长度(18nt和23nt)等2个途径对crRNA进行优化验证，最终设计合成出SMN1 crRNA1、SMN1crRNA2、SMN1crRNA3和SMN1 crRNA4 4条crRNA。

表2 Cas12a检测方法的引物、探针和crRNA序列信息

(2)PCR扩增

①选取正常人、SMA患者的gDNA标本和空白对照(水)各1份，正常人和SMA患者的gDNA标本经MLPA检测验证SMN1基因7号外显子的拷贝数，正常人为2拷贝，SMA患者为0拷贝。用SMN1 PCR引物进行PCR扩增。扩增反应体系如下：

PCR反应条件如图5所示。

(3)Cas12a荧光探针检测

①因为设计合成4条crRNA，所以分4组进行检测。每组中除所使用的crRNA不同外，其余条件相同。

②取正常人、SMA患者和空白对照(水)的扩增产物PCR产物用Cas12a荧光探针检测(所使用的样本与基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测所使用的样本相同)，每份样本设3个复孔，检测使用的Lba Cas12a(NEB，M0653T)浓度为100μM，先按10份配制混合体系，混合体系如下(混合体系分4组，分别使用SMN1 crRNA1、SMN1 crRNA2、SMN1 crRNA3和SMN1crRNA4)：

混匀后按18μL/管分装10管，每管再加入PCR扩增产物2μL，加盖后混匀，短暂离心后37℃孵育，反应开始读取初始荧光值，此后每1min读取1次荧光值。△荧光值＝终点荧光值(30min)-初始荧光值(0min)。比较正常人、SMA患者和空白对照(水)三者之间的荧光值差异。

2.结果

(1)现有的Cas12a检测方法检测

首先SMN1 PCR引物F/R对正常人和SMA患者、gDNA样本和空白对照(水)进行PCR扩增，该对引物可同时扩增SMN1基因和SMN2基因。扩增产物分为4组，分别用4条crRNA进行SMA-Cas12a荧光探针检测。4个组中，正常人、SMA患者和空白对照的荧光值均存在差异，但是各组在区分正常人和SMA患者的能力上存在差异。SMN1 crRNA1组中，正常人荧光值是SMA患者荧光值的1.93倍，SMN1 crRNA2组中，正常人荧光值是SMA患者荧光值的3.90倍，SMN1crRNA3组中，正常人荧光值是SMA患者荧光值的2.51倍，SMN1 crRNA4组中，正常人荧光值是SMA患者荧光值的4.11倍(图9)。结果表明：利用SMN1基因和SMN2基因7号外显子天然的差异碱基能区分正常人和SMA患者，但区分的特异性明显低于本发明的方法。在天然差异碱基的基础上再人工引入1个错配碱基能进一步提高区分正常人和SMA患者的能力。

(2)基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测方法与现有SMA-Cas12a荧光检测方法的比较

①基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测方法中，正常人与SMA患者的荧光值差异为35.39倍，而现有的Cas12a检测方法中，该差异最高仅为4.11倍，表明基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测方法的特异性更高，区分正常人和SMA患者的能力更强。

②现有SMA-Cas12a荧光检测方法需依赖SMN1基因7号外显子的序列设计crRNA，crRNA设计的灵活性受限。即使通过引入错配碱基和改变识别区长度等方法设计4条crRNA，提高crRNA识别的特异性，但是特异性提高程度并不理想。

③基于探针连接的SMA-Cas12a荧光定量检测方法，PAM序列和crRNA识别区序列为人工引入，提高了设计的灵活性和选择性。因为本实例中使用高特异性的DNA连接酶(HiFiTaq DNA Ligase)，对探针与杂交模板之间的碱基错配敏感。当探针与SMN1基因杂交时，探针与模板之间无错配，DNA连接酶将上下游探针连接成单链。当探针与SMN2基因杂交时，探针与模板之间有错配，DNA连接酶不能将上下游探针连接成单链。

实施例3

(1)根据SMN1基因7号外显子和内参ALB基因设计合成另一对连接探针(F2-R2)、连接探针PCR引物和探针crRNA，如表3所示：

表3 PCR引物、连接探针和crRNA序列信息

(2)验证连接探针F2/R2的特异性、连接和扩增效率

①选取正常人、SMA患者的gDNA标本和空白对照(水)各1份，正常人和SMA患者的gDNA标本经MLPA检测验证SMN1基因7号外显子的拷贝数，正常人为2拷贝，SMA患者为0拷贝。

②SMN1的探针连接反应体系如下：

③反应体系配制完成后颠倒混匀30次，短暂离心，置于PCR仪进行探针连接。

探针连接反应如图4所示。

④取连接反应产物4μL作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如图5所示。

⑤取PCR产物进行SMA-Cas12a荧光探针检测，每份样本设3个复孔，检测使用的LbaCas12a(NEB，M0653T)浓度为100μM，先按10份配制混合体系，混合体系如下：

混匀后按18μL/管分装10管，每管再加入PCR扩增产物2μL，加盖后混匀，短暂离心后37℃孵育，反应开始读取初始荧光值，此后每1min读取1次荧光值。△荧光值＝终点荧光值(30min)-初始荧光值(0min)。比较正常人、SMA患者和空白对照(水)三者之间的荧光值差异。

结果为：将实施例1中SMN1连接探针F1/R1与F2/R2的数据做比较，如图10所示。

样本和检测条件相同的情况下，分别用2组连接探针检测正常人、SMA患者和空白对照(水)3份样本。SMN1连接探针F2/R2组中，正常人和SMA患者的荧光值差异仅为1.09倍，而SMN1连接探针F1/R1组中，正常人和SMA患者的荧光值差异为35.39倍。结果表明：SMN1连接探针F1/R1区分正常人和SMA患者的能力均优于SMN1连接探针F2/R2(图10)。优选SMN1连接探针F1/R1。

(3)验证ALB连接探针F2/R2的特异性、连接和扩增效率

①选取正常人gDNA、空白对照(水)各1份，正常人gDNA标本含ALB基因，空白对照无ALB基因。用ALB连接探针F2/R2进行连接反应。

②ALB的探针连接反应体系如下：

③反应体系配制完成后颠倒混匀30次，短暂离心，置于PCR仪进行探针连接。

探针连接反应条件如图4所示。

④取连接反应产物4μL作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如图5所示。

⑤取PCR产物进行SMA-Cas12a荧光探针检测，每份样本设3个复孔，检测使用的LbaCas12a(NEB，M0653T)浓度为100μM，先按10份配制混合体系，混合体系如下：

混匀后按18μL/管分装10管，每管再加入PCR扩增产物2μL，加盖后混匀，短暂离心后37℃孵育，反应开始读取初始荧光值，此后每1min读取1次荧光值。△荧光值＝终点荧光值(30min)-初始荧光值(0min)。比较正常人、SMA患者和空白对照(水)三者之间的荧光值差异。

结果如下：

将实施例1中ALB连接探针F1/R1与F2/R2的数据做比较，如图11所示。

样本和检测条件相同的情况下，正常人样本和空白对照(水)分别用SMN1连接探针F1/R1、ALB连接探针F1/R1和ALB连接探针F2/R2等3组探针检测。ALB连接探针F1/R1组和F2/R2组中，空白对照荧光值增长不明显，表明2组探针的特异性较好。正常人经ALB连接探针F1/R1检测后生成的荧光值高于ALB连接探针F2/R2，表明ALB连接探针F1/R1的连接和扩增效率高于ALB连接探针F2/R2。正常人样本分别经ALB连接探针F1/R1和SMN1连接探针F1/R1检测，目的基因和内参基因生成的荧光值接近，表明2组探针的连接和扩增效率接近，可用于目的基因和内参基因的定量检测(图11)。优选ALB连接探针F1/R1。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 一种基于Cas蛋白的检测方法

<130> 8

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工合成

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<210> 8

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<212> RNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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