群体感应猝灭新菌及其培养筛选方法、应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种群体感应猝灭新菌及其培养筛选方法、应用。

背景技术

在污水处理中，膜生物反应器（MBR）由于占地面积小、处理效率高、分离效果好等优点，日益受到广泛的应用。然而，限制MBR应用的最大瓶颈就是膜污染问题。目前对MBR膜生物污染控制的研究有很多，如运行条件的优化、膜的改性、物理清洗、化学药剂清洗等。各种抗污染策略的使用，都对膜污染的控制有一定帮助，但这些物理化学措施并不能从根本上解决膜生物污染的控制问题，因为它们无法从生物学本质上将膜生物污染的形成机理解释清楚。

另外，膜的改性成本较高，不适用于大型工业应用；操作条件的改变可能影响出水COD，进而影响污水处理效果。通过向反应器内投加粉末活性炭（PAC）或混凝剂(无机、有机、生物)来改变污泥混合液的成分或性质有助于减少膜污染，但是添加剂的注人可能会改变污水的组成，影响溶液pH值及微生物降解能力等。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种群体感应猝灭新菌及其培养筛选方法、应用，该群体感应猝灭新菌经鉴定为皮特不动杆菌。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种群体感应猝灭新菌，其于2021年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 22535，保藏名称为皮特不动杆菌Acinetobacter pittii HITSZ001；其序列为SEQ ID NO.1所示。

经过鉴定，该菌株为Acinetobacter（不动杆菌属），推测为Acinetobacter pittii（皮特不动杆菌）。

该菌株的外形特征：将该菌株划线接种于LB培养基中，呈表面光滑、边缘整齐、中央突起的菌落, 圆形、乳白色、粘稠，为革兰氏阴性菌。

该群体感应猝灭新菌加入到膜生物反应器中，能够降解体系中的信号分子，有效对抗膜的生物污染。MBR中利用群体感应（Quorum Sensing，QS）减缓膜的生物污染是一种有效的膜污染控制途径。群体感应是指细菌之间能够通过自发产生、释放特定的信号分子，感知其浓度的变化，进而调节微生物的群体行为。当种群密度达到阈值时，信号分子的浓度也达到一定的水平， 激活特定靶基因的表达，调控包括生物发光、抗生素合成、生物膜形成等微生物群体的生理行为。因此对信号分子的破坏即群体猝灭（Quorum Quenching，QQ）可有效的抑制MBR的膜生物污染。

本发明还公开了如上所述的群体感应猝灭新菌的培养筛选方法，其包括：

取活性污泥样品，超声混匀后接种在以AHL（酰基高丝氨酸内酯）为唯一碳源的培养基中，在37℃条件下静态培养2d；

将1vol%的培养基转移到含有AHL的新的唯一碳源的培养基中，在37℃条件下继续静态培养2d；

上述转移过程重复至少两次以上；

将培养物取出涂布在LB琼脂上，分离出多个菌落；

对分离出的菌落进行QS功能鉴定培养，加入信号分子，通过猝灭效果对比，根据信号分子的降解量计算猝灭率，猝灭率最高的即为所述群体感应猝灭新菌。

作为本发明的进一步改进，培养基中，AHL的浓度为3 mM。

作为本发明的进一步改进，所述报告菌株为紫色杆菌CV026。

作为本发明的进一步改进，所述活性污泥样品取自再生水厂。

作为本发明的进一步改进，分离出多个菌落后，将筛选出的多株细菌培养24h，加入50um信号分子，24h后取1mL菌液测定其中信号分子的剩余浓度，根据24h内这6株菌对信号分子的降解量计算猝灭率。

本发明还公开了如上所述的群体感应猝灭新菌的应用，其用于膜生物反应器中对抗膜的生物污染，主要在于降解体系中的信号分子。

本发明还公开了一种控制膜生物反应器的膜污染的方法，在膜生物反应器内加入如上所述的群体感应猝灭新菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的技术方案的群体感应猝灭新菌，可以降解膜生物反应器体系中的信号分子，有效的对抗膜的生物污染，对于污水处理领域的发展具有重大的意义。

附图说明

图1是本发明实施例分离出的6株菌株的QQ功能对比结果。

图2是本发明实施例的皮特不动杆菌Acinetobacter pittii HITSZ001与铜绿假单胞菌PAO1、PA14混合培养与铜绿假单胞菌PAO1、PA14单独培养采用结晶紫染色法测得的生物膜量的对比图。

图3是本发明实施例的含有皮特不动杆菌Acinetobacter pittii HITSZ001的环境下PAO1、PA14静态培养24h与空白组的荧光显微镜照片对比图；其中（a）为PAO1-空球，（b）为PAO1-QQ球；（c）为PA14-空球，（d）为PAO1-QQ球。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

群体感应猝灭新菌，其于2021年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 22535，保藏名称为皮特不动杆菌Acinetobacterpittii HITSZ001；其序列为SEQ ID NO.1所示。

经过鉴定，该菌株为Acinetobacter（不动杆菌属），推测为Acinetobacter pittii（皮特不动杆菌）。

上述群体感应猝灭新菌通过如下方法培养得到：

步骤1：活性污泥样品取自深圳市南山区西丽再生水厂，将活性污泥样品超声混匀10min后，接种在以AHL（3 mM，C6-HSL）为唯一碳源的微量培养基中，37℃，在96孔板中静态培养2d然后，将1vol%的培养基转移到含有AHL的新的唯一碳源培养基中，在37℃条件下继续静态培养2d。这个转移过程重复三次，以确保分离出只能以AHL为碳源生存的细菌。然后将最后一次的培养物取10μL涂布在LB琼脂上，分离出多个菌落，本实施例为6株菌株。

其中，通过试验发现，若保持动态培养，因96孔板每孔容纳的培养基量有限，且孔面积较小，培养2d后极易发生培养基干涸现象，细菌无法存活，故选择静态培养。

步骤2：将步骤1中分离出的6株菌株进行QQ功能验证，具体包括将筛选出的6株细菌培养24h，加入50um信号分子，24h后取1mL菌液测定其中信号分子的剩余浓度。根据24h内这6株菌对信号分子的降解量计算猝灭率，6株菌的猝灭率如图1所示。

另外，将上述步骤分离出的6株菌株进行QS功能验证，发现它们均不能使报告菌株(紫色杆菌CV026)变色，则判定它们无法产生该报告菌株覆盖的AHL类信号分子。

将步骤2中猝灭效果最好的1号菌株进行鉴定，将该菌株划线接种于LB培养基中，呈表面光滑、边缘整齐、中央突起的菌落, 圆形、乳白色、粘稠，为革兰氏阴性菌。分析其生理生化鉴定结果和 16s-rRNA 测序结果。将测序结果在 NCBI 数据库中比对发现其16s-rDNA基因序列与Acinetobacter pittii(皮特不动杆菌)具有最大同一性，将其命名为Acinetobacter pittii HITSZ001。

下面采用上述培养筛选得到的皮特不动杆菌Acinetobacter pittii HITSZ001进行对膜污染的实际抑制效果的验证试验。

选取MBR系统中两种形成生物膜的主要细菌：铜绿假单胞菌PAO1和PA14为例，进行如下两项实验：

实验一：

1.将PAO1和PA14分别按1%（v/v）接种于LB液体培养中，同时加入1%（v/v）的Acinetobacter pittii HITSZ001菌液进行混合培养。

2.将PAO1和PA14分别按1%（v/v）单独接种于LB液体培养中，作为空白对照，实验在12孔板中进行。

3.在37℃条件下静态培养24h后，用结晶紫染色法测定孔板中生物膜量。具体测定方法为：培养后的培养板通过倒置去除每个孔内的液体培养基，采用 PBS 清洗 2 次，去除悬浮细菌。清洗后放入 60°C 烘箱中固定生物膜 30 min。固定后每个孔内分别加入 0.4mL结晶紫溶液（0.1%），避光染色30 min。染色后用超纯水洗去多余的染料，在每个孔内加入2 mL酒精（95%）用于萃取结晶紫染料。将培养板再次封好后放置于平板摇床，在转速为 100rpm 下萃取 2 h。萃取后分别取出0.5 mL的酒精萃取液置于新的 96 孔板内，分别稀释到200 μL，通过酶标仪测定其在 595 nm 波长下的吸光度。

实验结果如图2所示，表明Acinetobacter pittii HITSZ001对铜绿假单胞菌PAO1和PA14的生物膜形成起到了一定的抑制作用，能够明显减缓膜污染情况。

实验二：

1.将Acinetobacter pittii HITSZ001固定在海藻酸钠凝胶小球中，固定化方法如下：（1）配制4%(w/v)的海藻酸钠溶液，将培养好的菌液制成菌悬液后与海藻酸钠以一定比例混合，空白对照可用生理盐水代替菌悬液；（2）配制4%(w/v)的CaCl2溶液，并加入3%(w/v)的硼酸。通过蠕动泵和直径为1cm的软管将(1)中的混合液滴入CaCl2硼酸溶液中。4℃下交联4h，则形成固定化的凝胶小球（含有QQ菌的小球以下简称“QQ球”，不含QQ菌的空白对照以下简称“空球”）。

2.将滤膜剪成 1 cm×1 cm 的正方形膜片，采用酒精消毒，超纯水冲洗并浸泡超过12 h。

3.将PAO1和PA14分别按1%（v/v）单独接种于LB液体培养中，加入5颗QQ球（空白组加入5颗空球），并将 1 cm×1 cm 的膜片安置在 12 孔板中。

4.37℃静态培养24h，在荧光显微镜下观察膜表面污染情况。荧光显微镜分析是膜片通过荧光染色的方式观察膜表面生物膜的总细胞数量和死细胞数量。其具体操作方式如下：将污染的膜片用PBS 缓冲液轻微冲洗，去掉表面悬浮细胞；在避光环境内，采用 5μg/mLpropidium iodide（PI）染料对其染色 20 min，染色后用 PBS 缓冲液冲掉多余染料；采用1 μg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染料染色10-15 min；用 PBS 缓冲液清洗多余染料后，将膜片固定在载玻片和盖玻片中间，通过荧光显微镜（x100）观察膜表面细菌状态和数量。

实验结果如下图3所示，结果表明：当对照组实验培养24 h 后可以在膜表面看出明显的细菌聚集现象，而加入QQ球的样品中，膜表面细菌的数量明显减少。可见，QQ球对膜表面污染情况有良好的抑制作用。

通过上述实验可见，本发明技术方案的Acinetobacter pittii HITSZ001对膜表面污染情况具有良好的抑制作用，能够明显减缓膜污染情况。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学（深圳）

<120> 群体感应猝灭新菌及其培养筛选方法、应用

<141> 2021-06-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> Acinetobacter pittii HITSZ001

<400> 1

aggctcagat tgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcgg agagaggtag 60

cttgctactg atcttagcgg cggacgggtg agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg 120

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