一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条及其制备方法、试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医学检测技术领域，更具体地说，它涉及一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条及其制备方法、试剂盒。

背景技术

SARS-CoV-2是一种β属的新型冠状病毒，呈圆形或椭圆形，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状，可感染哺乳动物和人。研究结果显示其传染性及致病性强，目前没有特异性抗SARS-CoV-2感染的临床药物。为此，从源头切断传染源，抑制病毒传播以及推进疫苗的研发与接种是目前有效控制病毒传播的有效途径，而及时有效地检出机体中有无新型冠状病毒以及保证疫苗有效性是实行上述途径的关键。

众所周知，机体在遇到病毒刺激时会产生具有保护作用的抗体，其可以分为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五类，其中IgM机体抗感染免疫的“先头部队”，而IgG是机体抗感染的“主力军”，两者均是重要的保护性抗体，常被用于判断机体中有无新型冠状病毒。

而中和抗体是病毒在侵入机体时，机体中的B淋巴细胞受到病毒刺激而产生的保护性抗体。其中，SARS-CoV-2的中和抗体能够与冠状病毒S蛋白受体结合域（receptorbindingdomain，RBD）结合，阻止SARS-CoV-2与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin- convertingenzyme 2，ACE2）结合而侵入细胞，从而发挥抗病毒作用。因此，中和抗体是判断疫苗接种有效性的重要指标。

目前，因IgG/IgM与中和抗体的检测原理存在差异，市面上只有单独检测IgG/IgM的试纸条以及单独检测中和抗体的试纸条。检测人员若需要确定机体中抗体的产生是由于病毒感染还是疫苗接种，则需要先使用IgG/IgM试纸条删选出具有IgG/IgM的机体，再对这部分机体进行中和抗体检测，其操作繁琐、检测时间长，进而使得检测人员的检测效率较低。

发明内容

为了能同时准确检测机体中的IgG、IgM和中和抗体，本申请提供一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条及其制备方法、试剂盒，其主要将IgG和IgM的检测结果与中和抗体的检测结果联合在一起，能在现场进行高准确度快检，检测人员只需要使用一个试纸条就可以准确检测机体中是否含有IgG、IgM和中和抗体，提高了检测人员的检测效率。

第一方面，本申请提供一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条，采用如下的技术方案：

一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条，包括第一检测部和第二检测部，所述第一检测部和第二检测部均包括有底板以及设置在底板上并依次连接的样品垫、结合垫和检测垫；

所述第一检测部的结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原，所述第一检测部的检测垫上设有第一检测线和第二检测线，所述第一检测线上包被有抗人IgM，所述第二检测线上包被有抗人IgG；

所述第二检测部的样品垫上包被有SARS-CoV-2 ACE2，所述第二检测部的结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，所述第二检测部的检测垫上设置有第三检测线，所述第三检测线上包被有适于与SARS-CoV-2中和抗体结合的检测蛋白。

本申请将SARS-CoV-2 IgG/IgM检测和SARS-CoV-2 中和抗体检测合并在一起。其中，对于SARS-CoV-2 IgG/IgM检测，本申请设置两条检测线进行测定。若待测样品中含有IgM，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原与IgM结合，形成胶体金-N抗原-IgM复合物和胶体金-S抗原-IgM复合物，该复合物能与第一检测线上的抗人IgM结合，使得第一检测线显色。若待测样品中含有IgG，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原与IgG结合，形成胶体金-N抗原-IgG复合物和胶体金-S抗原-IgG复合物，该复合物能与第二检测线上的抗人IgG结合，使得第二检测线显色。

对于SARS-CoV-2 中和抗体检测，本申请在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度。若待检样品中不含有中和抗体，样品垫中的ACE2会与结合垫中的S-RBD抗原结合，检测线不会显色。若待检样品中含有中和抗体，中和抗体会阻断样品垫中ACE2与结合垫中的S-RBD抗原结合，检测线上会产生胶体金标记的S-RBD、中和抗体、检测蛋白形成的复合物，表现为检测线显色。待检样品中的抗体含量与检测线的显色强度呈正比，整个检测耗时在8min以内，反应结束后，直接可以肉眼观察显色情况。

由于机体中IgG和IgM的滴度与其感染SARS-CoV-2的时间息息相关，本申请同时对IgG和IgM进行测定能更好地防止漏检，再配合中和抗体的测定，有助于检测人员判断机体是感染病毒产生了抗体还是接种疫苗产生了中和抗体，有效减轻了检测人员的检测工作。

综上，本申请的试纸条对IgG、IgM和中和抗体进行联合检测，检测人员只需要使用一个试纸条就可以准确检测机体中是否含有IgG、IgM和中和抗体。其相对于对IgG、IgM和中和抗体分别检测，能有效简化检测人员的检测操作工序，提高检测效率。此外，本申请利用夹心法检测中和抗体能有效缩短其检测时间，使得检测可在8min内得到可靠结果，且不需要配套相关仪器设备，便于在不同场景进行现场高准确度快检。

优选的，所述胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原以及所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原中，所述胶体金的粒径为13-60nm。

通过采用上述技术方案，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响各检测线的显色深浅。两者均会影响检测人员对检测结果的读取，降低试纸条的检测准确度。本申请选用粒径为13-60nm的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。

优选的，所述胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述第一检测部的结合垫上；所述抗人IgG和抗人IgM按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量分别固定于所述第一检测线和所述第二检测线上。

机体在感染SARS-CoV-2初期IgG和IgM浓度较低，若胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原的浓度过高，其会增加原料投入成本；若胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原的浓度过低，则会存在IgG和IgM捕获不完全的情况，使得第一检测线和/或第二检测线上显色较浅。其中，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原需多余检测垫上固定的抗人IgG和抗人IgM，这是为了检测线上的抗人IgG和抗人IgM都能对应与IgG和IgM结合并进行显色，便于检测人员观察显色情况。本申请按上述包被量固定时，其获得的第一检测部具有更高的检测准确性，因此将其作为优选。

优选的，所述检测蛋白为SARS-CoV-2 S-RBD抗原。

通过采用上述技术方案，本申请在测定中和抗体时，其夹心法形成的复合物为“胶体金标记的S-RBD抗原-中和抗体-S-RBD抗原”，其结合原理仅为S-RBD抗原与中和抗体的特异性结合，其相对于“胶体金标记的S-RBD抗原-中和抗体-中和抗体二抗”等其他复合物需要多种特异性结合的方式，具有更好的专一性。

优选的，所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述第二检测部的结合垫上；所述检测蛋白按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述第三检测线上。

通常接种人群体内的中和抗体浓度较低，若S-RBD抗原的浓度过高，其会增加原料投入成本；若S-RBD抗原的浓度过低，则会存在中和抗体结合不完全，在检测线上显色较浅；其中，胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原需多余检测垫上固定的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，这是为了检测线上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原都能结合上中和抗体并进行显色，便于检测人员观察显色情况。本申请按上述包被量固定时，其获得的第二检测部具有更高的检测准确性，因此将其作为优选。

优选的，所述第一检测部和所述第二检测部的结合垫上均包被有胶体金标记的鸡IgY，所述第一检测部和所述第二检测部的检测垫上均设置有质控线，所述质控线上包被有羊抗鸡二抗。

通过采用上述技术方案，由于鸡IgY相对于哺乳动物的IgG，无需进行采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得，因此其能有效降低试纸条的生产成本；由于鸡IgY与中和抗体存在较大的种系发生距离，两者之间不会发生交叉血清学反应，进而使得试纸条的检测更加准确，有效减少其在检测过程中产生假阴性或假阳性结果。羊抗鸡二抗能有效与鸡IgY特异性结合，由此使质控线显色，保证试纸条的检测有效性。

优选的，所述胶体金标记的鸡IgY中胶体金的粒径为13-60nm。

通过采用上述技术方案，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金标记的鸡IgY在检测垫上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响质控线的显色深浅，本申请选用粒径为13-60nm的胶体金，保证质控线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度。

优选的，所述胶体金标记的鸡IgY按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述第一检测部和所述第二检测部的结合垫上；所述羊抗鸡二抗浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述第一检测部和所述第二检测部的质控线上。

通过采用上述技术方案，本申请在上述浓度足以在质控线上进行显色以便于检测人员的观察。

第二方面，本申请提供一种试纸条的制备方法的制备方法，采用如下的技术方案：

一种试纸条的制备方法，包括以下步骤：

①、预处理：

将样品垫置于第一处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，于35-40℃干燥1-6h，保存备用；将结合垫浸泡在第二处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，于35-40℃干燥1-6h，保存备用；

其中，所述第一处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖和0.1wt%P300；所述第二处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖、0.5wt%吐温和0.1wt%P300；

②、喷涂固定：

取一预处理后的结合垫，将胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原按设定量包被在所述结合垫上；

取一预处理后的样品垫，将SARS-CoV-2 ACE2按设定量包被在所述样品垫上；另取一预处理后的结合垫，将胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原按设定量包被在所述结合垫上；

③、基线制作：

取一检测垫，将抗人IgG和抗人IgM按设定量分别包被在所述检测垫上，所述抗人IgM形成第一检测线，所述抗人IgG形成第二检测线；

另取一检测垫，将适于与SARS-CoV-2中和抗体结合的检测蛋白按设定量包被在所述检测垫上，形成第三检测线；

④、试纸条组装：

取一底板，将预处理后的样品垫、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原的结合垫以及包被有抗人IgM和抗人IgG的检测垫设置在所述底板上并依次连接，形成第一检测部；

另取一底板，将包被有SARS-CoV-2 ACE2的样品垫、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原的结合垫以及包被有检测蛋白的检测垫设置在所述底板上并依次连接，形成第二检测部；

将所述第一检测部和所述第二检测部进行组装，由此获得所述试纸条。

通过采用上述技术方案，本申请对样品垫和结合垫均进行预处理，有助于胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原更好地对应固定在样品垫和/或结合垫上，保证试纸条的检测准确性。

第三方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：

一种试剂盒，包括上述的试纸条。该试剂盒与上述试纸条相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

本申请将IgG和IgM的检测结果与中和抗体的检测结果联合在一起，检测人员只需要使用一个试纸条就可以准确测得两个结果，同时能实现现场高准确度快检，可以快速判断机体是感染了病毒还是接种疫苗产生了中和抗体，有效减轻了检测人员的检测工作。

附图说明

图1是本申请实施例1中试纸条的结构示意图。

图2是本申请应用例8中试剂盒的结构示意图。

图中，1、第一检测部；2、第二检测部；3、连接件；4、底板；5、样品垫；6、结合垫；7、检测垫；71、第一检测线；72、第二检测线；73、第三检测线；74、质控线；8、吸水垫；9、外壳；91、底壳；92、顶盖；921、上样孔；922、观测孔。

具体实施方式

原料和/或中间体的制备例

本申请中的原料可以使用市售产品，下列来源仅为示例，并不代表其为指定原料。

鸡IgY购自上海延慕实业有限公司，货号为FK-025。

羊抗鸡二抗购自洛阳市佰泰科生物技术有限公司，mg/mL效价测定（ELISA）＞1:10万，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度＞96％；储存缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含0.14mol/L氯化钠，pH7.4。

抗人IgG购自上海江莱生物科技有限公司，货号为AbM59504-10-PU。

抗人IgM购自默克抗人抗人IgM（μ-链特异性）山羊抗，货号为10759。

SARS-CoV-2 N抗原购自南京申基生物科技有限公司，货号为AG0085。

SARS-CoV-2 S抗原购自南京申基生物科技有限公司，货号为AG0091。

SARS-CoV-2 S-RBD抗原购自南京申基生物科技有限公司，蛋白质构建为编码SARS-CoV-2（2019-nCoV）棘突蛋白RBD区域（Gln321-Ser591）的DNA序列，表达宿主为HEK293Cells，通过SDS-PAGE 确定纯度＞95%，通过LAL方法测定的每微克蛋白质<1.0EU，重组SARS-CoV-2 (2019-nCoV)棘突蛋白（RBD）由271个氨基酸组成，预测分子量为30.3kDa，储存缓冲液为150mM NaCl, 20mM NaHCO

SARS-CoV-2 ACE2购自南京申基生物科技有限公司，抗原来自哺乳动物细胞，融合his标签种属为人源，纯度＞90%（R250染色的SDS-PAGE胶），储存缓冲液为1×PBS，pH7.4。

制备例1

胶体金的制备

本申请中胶体金的制备方法，采用柠檬酸钠还原法制备胶体纳米颗粒，包括以下步骤：

（1）取99mL超纯水和1mL 1wt%的三氯金酸水溶液，混匀后，磁力搅拌煮沸；

（2）快速加入1.8mL1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸；

（3）当胶体金溶液颜色由浅黄色变为蓝黑色，最后变为酒红色后，继续加热煮沸8min；

（4）当制备好的胶体金溶液的温度降至室温时，将制备好的胶体金溶液定容到100mL；

（5）最后，将制备好的胶体金溶液放于干净的玻璃瓶中，并于4℃环境条件下存放备用。

制备例2

胶体金标记的SARS-COV-2 N抗原的制备

（1）取制备例1制备好的胶体金溶液2ml，用0.1M K

（2）逐滴加入200μL浓度为0.1μg/μL的SARS-COV-2 N抗原，室温条件下磁力搅拌反应2h；

（3）逐滴加入10wt%的BSA溶液，使其终浓度为0.5wt%，室温条件下磁力搅拌反应30min：

（4）逐滴加入10wt%的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2wt%，室温条件下磁力搅拌30min；

（5）12000rpm离心力30min，弃掉上清，留下胶体金沉淀；

向沉淀中加入1wt%的BSA溶液重悬胶体金，然后12000rpm离心，重复进行三次后，用胶体金重悬液（20mM PBS，2.5wt%蔗糖，0.5wt%吐温-20，0.02wt%PEG20000）重悬沉淀至原体积的1/10，制得胶体金标记的SARS-COV-2 N抗原。

制备例3

在制备例2的基础上，将SARS-COV-2 N抗原替换为SARS-COV-2 S抗原，制得胶体金标记的SARS-COV-2 S抗原。

制备例4

在制备例2的基础上，将SARS-COV-2 N抗原替换为SARS-CoV-2 S-RBD抗原，制得胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原。

制备例5

在制备例2的基础上，将SARS-COV-2 N抗原替换为鸡IgY，制得胶体金标记的鸡IgY。

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

一种联合检测IgG、IgM和中和抗体的试纸条，参见图1，包括第一检测部1和第二检测部2，第一检测部1和第二检测部2可以独立设置，也可以通过通过连接件3相连。其中的连接件3主要用于隔断第一检测部1和第二检测部2，阻止待测样品在两者之间发生交叉而影响检测结果，但连接件3的结构不限，其可根据需要进行不同设计。本实施例中连接件3为一隔板，第一检测部1和第二检测部2分别位于隔板的相对两侧。

第一检测部1和第二检测部2均包括有底板4以及设置在底板4上并依次连接的样品垫5、结合垫6、检测垫7和吸水垫8。本实施例中，底板4的尺寸可以根据需要进行调整，其宽度通常为2.5-5.0mm，长度通常为4-8cm，本实施例中具体以宽3.0mm、长6cm为例进行说明。吸水垫8压住检测垫7的一端，检测垫7的另一端被结合垫6压住，样品垫5压住结合垫6远离检测垫7的一端。其采用压住的方式能使得相邻两个垫之间存在上下重叠部分，增加其两者之间的接触面积，待测样品在结合垫6与检测垫7的连接处以及检测垫7与吸水垫8的连接处能快速渗透，加快待测样品的渗透速率，进而能在一定程度上加快试纸条的检测效率。

其中的上下重叠部分的长度可以根据需要进行调整，本实施例中具体以2mm为例进行说明，即检测垫7的一端被吸水垫8压住2mm，检测垫7的另一端被结合垫6压住2mm，而结合垫6在检测垫7的一端被样品垫5压住2mm。由此，结合垫6和吸水垫8压在检测垫7相对两侧的顶部，其能增加检测垫7的结构稳定性，使得结合垫6和吸水垫8在检测垫7的相对两侧高起，由于待测样品在试纸条通常水平流动，因此待测样品检测垫7处汇集，提高试纸条的检测准确度。

另外，本实施例中的样品垫5和结合垫6均采用玻璃纤维素膜，由于玻璃纤维素膜具有毛细限位结构，能吸附比同等纤维素更多的水分，且流速块，可以快速吸收待测样品并输送至检测垫7中。检测垫7使用NC膜，具体为Sartorius CN95。这是由于Sartorius CN95膜为具有衬垫物的硝酸纤维素膜，其孔径比CN150和CN140更大，因此排放速度也更快，能较快清除胶体金颗粒，阻止胶体金在检测垫7上产生底色，进而便于检测人员对检测结果的观察。吸水垫8采用滤纸纤维，其同样具有良好的吸水效果，能将多余的待测样品进行吸附，保证试纸条在检测过程中的整洁。

第一检测部1的结合垫6上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原，第一检测部1的检测垫7上设有第一检测线71、第二检测线72和质控线74，第一检测线71上包被有抗人IgM，第二检测线72上包被有抗人IgG。第二检测部2的样品垫5上包被有SARS-CoV-2 ACE2，第二检测部2的结合垫6上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，第二检测部2的检测垫7上设置有第三检测线73和质控线74，第三检测线73上包被有适于与SARS-CoV-2中和抗体结合的检测蛋白。

另外，第一检测部1和第二检测部2的结合垫6上均包被有胶体金标记的鸡IgY，第一检测部1和第二检测部2的检测垫7上均设置有质控线74，质控线74上包被有羊抗鸡二抗。由于鸡IgY相对于哺乳动物的IgG，无需进行采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得，因此其能有效降低试纸条的生产成本。本实施例利用羊抗鸡二抗能有效与鸡IgY特异性结合的特点，再结合鸡IgY与中和抗体存在较大的种系发生距离，两者之间不会发生交叉血清学反应，进而使得试纸条的检测更加准确，有效减少其在检测过程中产生假阴性或假阳性结果，因此使用鸡IgY和羊抗鸡二抗进行质控，能有效使质控线74显色，保证试纸条的检测有效性。

对于SARS-CoV-2 IgG/IgM检测，本实施例设置两条检测线，若待测样品中含有IgM，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原与IgM结合，形成胶体金-N抗原-IgM复合物和胶体金-S抗原-IgM复合物，该复合物能与第一检测线71上的抗人IgM结合，使得第一检测线71显色。若待测样品中含有IgG，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原与IgG结合，形成胶体金-N抗原-IgG复合物和胶体金-S抗原-IgG复合物，该复合物能与第二检测线72上的抗人IgG结合，使得第二检测线72显色。

对于SARS-CoV-2 中和抗体检测，本实施例在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度，若待检样品中不含有中和抗体，样品垫5中的ACE2会与结合垫6中的S-RBD抗原结合，检测线不会显色；若待检样品中含有中和抗体，中和抗体会阻断样品垫5中ACE2与结合垫6中的S-RBD抗原结合，检测线上会产生胶体金标记的S-RBD、中和抗体、检测蛋白形成的复合物，表现为检测线显色，待检样品中的抗体含量与检测线的显色强度呈正比，整个检测耗时在10min以内，反应结束后，直接可以肉眼观察显色情况。

由于机体中IgG和IgM的滴度与其感染SARS-CoV-2的时间息息相关，本申请同时对IgG和IgM进行测定能更好地防止漏检，再配合中和抗体的测定，有助于检测人员判断机体是感染病毒产生了抗体还是接种疫苗产生了中和抗体，有效减轻了检测人员的检测工作。

由此，本实施例将SARS-CoV-2 IgG/IgM检测和SARS-CoV-2 中和抗体检测合并在一起，检测人员只需要使用一个试纸条就可以准确测定机体中IgG、IgM和中和抗体。其相对于对IgG、IgM和中和抗体分别检测，能有效简化检测人员的检测操作工序，此外，本申请利用夹心法检测中和抗体能有效缩短其检测时间，使得检测可在8min内得到可靠结果，且不需要配套相关仪器设备，便于在不同场景进行现场高准确度快检。

本实施例在第一检测部1中，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原和胶体金标记的鸡IgY按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于第一检测部1的结合垫6上；抗人IgG、抗人IgM和羊抗鸡二抗按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量分别固定于第一检测线71、第二检测线72、质控线74上。

这是由于机体在感染SARS-CoV-2初期IgG和IgM浓度较低，而胶体金标记的鸡IgY用于验证检测的有效性，若胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原和胶体金标记的鸡IgY的浓度过高，其会增加原料投入成本；若浓度过低，则会存在IgG、IgM以及羊抗鸡二抗捕获不完全的情况，使得第一检测线71、第二检测线72和/或质控线74上显色较浅。

其中，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原需多余检测垫7上固定的抗人IgG和抗人IgM，这是为了检测线上的抗人IgG和抗人IgM都能对应与IgG和IgM结合并进行显色，便于检测人员观察显色情况。本申请按上述包被量固定时，其获得的第一检测部1具有更高的检测准确性，且区间内的检测准确性相差较小，因此将其作为优选。本实施例中胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原具体按浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量，抗人IgG、抗人IgM和羊抗鸡二抗具体按浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量为例进行说明。

本实施例中适于与SARS-CoV-2中和抗体结合的检测蛋白为SARS-CoV-2 S-RBD抗原。在测定中和抗体时，其夹心法形成的复合物为“胶体金标记的S-RBD抗原-中和抗体-S-RBD抗原”，其结合原理仅为S-RBD抗原与中和抗体的特异性结合，其相对于“胶体金标记的S-RBD抗原-中和抗体-中和抗体二抗”等其他复合物需要多种特异性结合的方式，具有更好的专一性。

本实施例在第二检测部2中，SARS-CoV-2 ACE2按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于样品垫5上，胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY均按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于结合垫6上；SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于第三检测线73上。这是由于通常接种人群体内的中和抗体浓度较低，若胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的浓度过高，其会增加原料投入成本；若浓度过低，则会存在中和抗体和羊抗鸡二抗结合不完全，在检测线上显色较浅，不利于检测人员进行挂不能观察。

其中，第二检测部2的样品垫5中的SARS-CoV-2 ACE2用于配合胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，因此其包被量通常与胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原的包被量相关。胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原的包被量需多于检测垫7上固定的SARS-CoV-2 S-RBD抗原的包被量，胶体金标记的鸡IgY的包被量需多于质控线74上固定的羊抗鸡二抗的包被量，这是为了检测线上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原都能结合上中和抗体并进行显色，质控线74上的羊抗鸡二抗都能结合上胶体金标记的鸡IgY并进行显色，便于检测人员观察显色情况。

本申请按上述包被量固定时，其获得的第二检测部2具有更高的检测准确性，且区间内的检测准确性相差较小，因此将其作为优选。本实施例中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY具体按浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量，SARS-CoV-2 S-RBD抗原具体按浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量为例进行说明。

本实施例中，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫7上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响检测线的显色深浅。因此，本本实施例中，胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原以及胶体金标记的鸡IgY中，胶体金的粒径选用13-60nm，其能在保证检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度。进一步优选为粒径均值为40nm的胶体金。

本实施例试纸条的使用原理为：

将待测样品分别滴加在第一检测部1和第二检测部2的样品垫5上，待测样品自样品垫5向吸水垫8方向流动，在第一检测部1查看有无SARS-CoV-2 IgG/IgM，在第二检测部2查看有无SARS-CoV-2中和抗体。

若待测样品中含有SARS-CoV-2 IgG和/或SARS-CoV-2 IgM，该IgG和/或IgM与第一检测部1的结合垫6中胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原结合，随后固定在第一检测线71和/或第二检测线72上，使得第一检测线71和/或第二检测线72显色。

若待测样品中不含有SARS-CoV-2 IgG和IgM，第一检测部1的结合垫6中胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原无法固定在第一检测线71和/或第二检测线72上，因此第一检测线71和/或第二检测线72均不显色。

若待检样品中不含有中和抗体，第二检测部2的样品垫5中的SARS-CoV-2 ACE2会与结合垫6中的胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原结合，形成的ACE2-S-RBD抗原复合物进而被吸水垫8吸附，检测线不会显色。

若待检样品中含有中和抗体，中和抗体会阻断样品垫5中的SARS-CoV-2 ACE2与结合垫6中的胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原结合，检测线上会产生胶体金标记的S-RBD、中和抗体、检测线上包被的S-RBD形成的复合物，表现为检测线显色，待检样品中的抗体含量与检测线的显色强度呈正比。

与此同时，第一检测部1和第二检测部2的结合垫6中的胶体金标记的鸡IgY与质控线74上的羊抗鸡二抗结合，使得胶体金标记的鸡IgY固定在质控线74上，进而使得质控线74显色，以保证检测结果有效。

实施例2

一种试纸条的制备方法，包括以下步骤：

①、预处理：

将样品垫5置于第一处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，本实施例具体37℃孵育30min，随后用PBS洗净第一处理液，于35-40℃烘箱内干燥1-6h，具体在37℃干燥5h，保存备用；将结合垫6浸泡在第二处理液中，于35-40℃恒温水浴箱中孵育25-40min，本实施例中具体37℃孵育30min，随后用PBS洗净第二处理液，于35-40℃烘箱内干燥1-6h，具体在37℃干燥2h，保存备用；

其中，第一处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖和0.1wt%P300；第二处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖、0.5wt%吐温和0.1wt%P300；

②、喷涂固定：

取一预处理后的结合垫6，将胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原和胶体金标记的鸡IgY均以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量喷涂在该结合垫6上；

取一预处理后的样品垫5，将SARS-CoV-2 ACE2以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量涂覆在该样品垫5上；另取一预处理后的结合垫6，将胶体金标记的SARS-CoV-2RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY均以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量涂覆在该结合垫6上；

③、基线制作：

取一检测垫7，将抗人IgG、抗人IgM和羊抗鸡二抗均以浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量涂覆在该检测垫7上，抗人IgM形成第一检测线71，抗人IgG形成第二检测线72，羊抗鸡二抗形成质控线74；

另取一检测垫7，将SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗均以浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量涂覆在该检测垫7上，SARS-CoV-2 S-RBD抗原形成第三检测线73，羊抗鸡二抗形成质控线74；

④、试纸条组装：

取一底板4，将预处理后的样品垫5、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原和胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原的结合垫6、包被有抗人IgG和抗人IgM的检测垫7以及吸水垫8设置在底板4上并依次连接，形成第一检测部1；

另取一底板4，将包被有SARS-CoV-2 ACE2的样品垫5、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原的结合垫6、包被有检测蛋白的检测垫7以及吸水垫8设置在底板4上并依次连接，形成第二检测部2；

将第一检测部1和第二检测部2进行组装，由此获得试纸条。

实施例3-4

实施例3-4在实施例2的基础上，对试纸条上的SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原、胶体金标记的鸡IgY、SARS-CoV-2 S-RBD抗原以及羊抗鸡二抗的包被量进行调整。

实施例3中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为0.5μL/cm。

实施例4中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为3.0μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm。

实施例5

本实施例在实施例2的基础上，将胶体金标记的鸡IgY更改为胶体金标记的人IgG，胶体金标记的人IgG的制备方法参考制备例3。同时将羊抗鸡二抗更换为抗人IgG抗体。

实施例6-7

实施例6-7在实施例2的基础上，将胶体金的粒径进行调整。其中，实施例6中胶体金的粒径均值为8nm；实施例7中胶体金的粒径均值为80nm。

实施例8

本实施例在实施例2的基础上，将第二检测部中第三检测线上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原更改为抗人IgG抗体。

实施例9

本实施例在实施例2的基础上，样品垫和结合垫未进行预处理。

性能检测试验

SARS-COV-2 IgG/IgM 和SARS-COV-2 中和抗体符合性测试

收集200个IgG阳性血清样本和200个IgG阴性血清样本作为待测样品，对IgG符合性能进行评价，将该400个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-9的试纸条进行检测，测试结果参见下表一。

表一 IgG检测结果

收集200个IgM阳性血清样本和200个IgM阴性血清样本作为待测样品，对IgM符合性能进行评价，将该400个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-9的试纸条进行检测，测试结果参见下表二。

表二 IgM检测结果

收集200个接种疫苗人员血清样本和200个未接种疫苗血清样本作为待测样品，对中和抗体符合性能进行评价，将该400个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-9的试纸条进行检测，测试结果参见下表三。

表三 发光中和抗体检测结果

结果显示为：本申请实施例中IgG的阳性率为97.5-99.5%，阴性率为95.0-99.5%；IgM的阳性率为97.0-100%，阴性率为95.5-99.5%；中和抗体的阳性率为95.0-100%，阴性率为96.5-100%，因此可以判断本发明的免疫层析试纸条具有很高的特异性。其中，实施例2的检测准确度最高，因此本申请将其作为优选实施例。

和SARS-COV-2 中和抗体检测时长测试

收集IgG阳性血清样本、IgG阴性血清样本、IgM阳性血清样本、IgM阴性血清样本各3个作为待测样品，将该12个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-9的试纸条的第一检测部进行 IgG/IgM检测；收集接种疫苗人员血清样本和未接种疫苗血清样本各6个作为待测样品，将该12个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-9的试纸条的第二检测部进行中和抗体检测；记录每个实施例的试纸条在准确测定待测样品时的平均最短检测时长（以试纸条显示结果与待测样品实际结果一致为准），测试结果参见下表四。

表四 实施例2-9的试纸条的检测时长

由表四可得，本申请的纸质条的检测时长均在8min内，能较好地应用于不同场景的现场快检。虽然实施例3、4和6的试纸条的检测时长与实施例2的相同，但综合考虑试纸条的检测准确度，实施例2的综合性能更优，因此本申请以实施例2为优选实施例。

参见表一至表四的检测结果，将实施例2-4的检测结果进行比较，若相关抗原/抗体的包被量过多，则会增加原料投入成本，若包被量过少，其会影响试纸条的显色，造成检测准确度降低。本申请将SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量以浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.2-1.8μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量以浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm制备试纸条时，其制得的试纸条显色更为清晰以便于检测人员的读取，其具有更为优异的检测准确性。

将实施例2与实施例5的检测结果进行比较，可以得到，本申请使用胶体金标记的鸡IgY和羊抗鸡二抗作为质控，能有效减少试纸条在检测过程中产生假阴性或假阳性结果。

将实施例2与实施例6-7的检测结果进行比较，可以得到，粒径为13-60nm的胶体金，其不但能稳定结合在第一检测线71、第二检测线72、第三检测线73和/或质控线74上，使相应检测线以及质控线74上的显色清晰可见，其还能在检测垫7上快速流通，使未被结合的胶体金能快速流向吸水垫8，有效减少其滞留在检测垫7而影响试纸条检测结果的读取。

将实施例2与实施例8的检测结果进行比较，可以得到，本申请在测定中和抗体时，其夹心法形成的复合物为“胶体金标记的S-RBD抗原-中和抗体-S-RBD抗原”，具有更好的专一性，由此对中和抗体的检测准确度更高。

将实施例2与实施例9的检测结果进行比较，可以得到，本申请对样品垫和结合垫均进行预处理，有助于胶体金标记的SARS-CoV-2 N抗原、胶体金标记的SARS-CoV-2 S抗原、SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原更好地对应固定在样品垫和/或结合垫上，保证试纸条的检测准确性。

应用例

本申请基于中和抗体竞争性胶体金检测试纸条的基础上，具体可以基于实施例2-9任一个实施例中的试纸条，进行试剂盒的开发，该试剂盒可以定性或半定性检测样本中的SARS-CoV-2IgG/IgM和中和抗体含量，可以实现是否感染新冠病毒和中和抗体含量的测试。

本应用例具体为基于实施例2的试纸条所开发的试剂盒，参见图1和图2，该试剂盒包括外壳9以及实施例2的试纸条，SARS-CoV-2中和抗体试纸条安装在外壳9内。外壳9能对试纸条进行防护，保证试纸条的平整性，便于待测样品更好地在试纸条上进行流动。

该外壳9通常由塑料制成，为方便试纸条的安装，外壳9具体由底壳91和顶盖92卡接固定而成。外壳9的顶盖92在试纸条的第一检测部1和第二检测部2的样品垫5处分别开设有至少一个上样孔921，本应用例中分别开设有一个，其用于待测样品进行定点加入，使得检测人员集中在同一部位进行加样，由此减少检测人员之间的检测差异性。外壳9的顶盖92在试纸条的第一检测部1和第二检测部2的检测垫7处分别开设有至少一个观测孔922，本应用例中分别开设有一个，由此便于检测人员更为直观地对检测结果进行读取。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。