具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物制品的提取制备技术领域，具体涉及具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽（Trp-Thr-Val-Ile-Leu环肽）提取和纯化。

背景技术

环色-苏-缬-异亮-亮肽是从一种蛙粪霉(

蛙粪霉(

抗真菌活性：有多种真菌是条件致病菌，当人们抵抗力下降时容易感染，特别是老人和病人容易发生真菌感染。目前世界老龄化日趋严重，同时由于环境污染等因素，人们的抵抗力呈下降趋势，真菌感染病例呈上升趋势，同时早期抗真菌药已出现耐药现象，因此开发新型抗真菌活性物质非常有意义。

清除自由基活性：自由基（free radical），从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中。

发明内容

本发明的目的是提供具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽及制备方法。

为寻找新型天然高效的具有抗真菌活性和清除自由基活性的物质，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从一种蛙粪霉中提取的环色-苏-缬-异亮-亮肽具有很强的抗白色链珠菌活性和清除自由基活性的作用。

具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

所述环色-苏-缬-异亮-亮肽是由色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽，为白色粉未；

所述环色-苏-缬-异亮-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；

对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC

具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的制备操作步骤如下：

（1）菌种培养

将蛙粪霉（

所述蛙粪霉（

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

进一步限定的制备技术方案如下：

所述步骤（1）的具体操作如下：

（1.1）斜面菌种培养

将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；

液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；

发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；

（1.4）四级培养

四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。

所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl

所述步骤（2）的具体操作如下：

（2.1）最终发酵物的预处理

将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000转/分钟条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；

或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；

（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化

（2.2.1）提取

将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（W:V）、超声波功率10～100KHz,提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；

（2.2.2）分离纯化

采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

本发明的分析研究说明如下：

1、筛选研究发现一种蛙粪霉（

（1）甲醇提取物对白色链珠菌的抑制活性测定：配制提取物浓度为1.0 mg/ml 20%DMSO溶液，以两性霉素B为阳性对照，以20% DMSO溶液为空白对照，进行抑制白色链珠菌试验，经计算得出提取物对白色链珠菌的平均抑菌圈直径11.53 mm。

（2）甲醇提取物的清除自由基活性测定： 配制提取物样品浓度为0.2、0.4、0.8、1.0、1.6 mg/ml甲醇溶液，于517 nm下测定其对0.5 mmol/L的DPPH自由基的清除活性，经计算得出其DPPH自由基的半数清除浓度 1.49 mg/mL。

由于甲醇提取物有效成分含量较低，因此需要进行有效成分的进一步提取和纯化。

2、用反相色谱的方法对甲醇提取物进行了进一步分离纯化，得到一个纯品，其生物活性如下：

（1）环色-苏-缬-异亮-亮肽对白色链珠菌的抑制活性测定：配制提取物浓度为0.2mg/ml 20% DMSO溶液，以两性霉素B为阳性对照，以20% DMSO溶液为空白对照，进行抑制白色链珠菌试验，经计算得出提取物对白色链珠菌的平均抑菌圈直径13.74 mm。

（2）环色-苏-缬-异亮-亮肽的清除自由基活性测定： 配制提取物样品浓度为0.2、0.4、0.8、1.0、1.6 mg/ml甲醇溶液，于517 nm下测定其对0.5 mmol/L的DPPH自由基的清除活性，经计算得出其DPPH自由基的半数清除浓度 1.31 mg/mL。

3、活性化合物的化学结构鉴定

高分辨液质联用分析显示纯化的活性化合物正离子585.3440(M+H

核磁共振分析数据见下表：

综合液质联用分析和核磁共振分析得出分离纯化出的活性化合物结构为环色-苏-缬-异亮-亮肽，见上述化学结构式。

本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：

1、本发明方法制备的环色-苏-缬-异亮-亮肽具有抑制白色链珠菌和清除自由基活性，开拓了蛙粪霉的一个新的应用领域。本发明首次发现蛙粪霉具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。

2、环色-苏-缬-异亮-亮肽是一新型骨架，可作为药物先导化合物进行衍生化改造，创造出活性更多更强的化合物。

3、本发明的环色-苏-缬-异亮-亮肽可用于制备白色链珠菌抑制剂和自由基清除剂。自由基清除剂往往有增白、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用，由环色-苏-缬-异亮-亮肽制备的白色链珠菌抑制剂可防治真菌感染。

4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和资源影响，易实现工业化、自动化，不受环境和自然资源的影响。

5、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1：

一种具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的制备操作步骤如下：

本实施例1所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉。

（1）菌株培养

（1.1）斜面种子培养

将蛙生蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25℃恒温、培养4d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

液体摇瓶培养基：葡萄糖25.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸出粉1.0g/L，氯化钾（KCl

在100 ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度25℃、转速150 rpm，培养3d，即得到二级菌种；

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种到5L的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，25℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；

发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。

（1.4）四级培养

四级培养采用液体培养：将三级菌种接种到50L的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，25℃恒温通气培养5天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

（2.1）最终发酵物的预处理

将液体的最终发酵物经0.20μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到20目备用。

（2.2）提取

将前述干燥菌丝，用甲醇提取；料液比为1:2（W:V）、超声波功率10KHz,提取时间为10分钟；提取结束后在转速2000转/分钟条件下离心，离心上清在温度100℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。

（2.3）分离纯化

采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用乙醇或甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

结构鉴定结果显示环色-苏-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

活性测定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC

实施例2

具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的制备操作步骤如下：

本实施例2所用的蛙粪霉为裂孢蛙粪霉；

（1）菌株培养

培养方法为液体培养，具体工序如下：

（1.1）斜面菌种培养

将裂孢蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于36℃恒温、培养8d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

液体摇瓶培养基：葡萄糖50.0 g/L，麦芽提取物30.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母浸出粉4.0 g/L，氯化钾（KCl

在1000 ml三角瓶中加入50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度36℃、转速250 rpm，培养7d，即得到二级菌种。

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种50L的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2MP，36℃恒温通气培养5天，得到三级菌种。

发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。

（1.4）四级培养

四级培养为液体培养：将三级菌种接种到大于等于500L的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2MP，36℃恒温通气培养15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

（2.1）最终发酵物的预处理

将液体的最终发酵物经1.0μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到120目备用。

（2.2）提取

将前述干燥菌丝用乙醇提取，料液比为1:20（W:V）、超声波功率100KHz,提取时间为200分钟；提取结束后在转速12000转/分钟条件下离心，离心上清在温度40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。

（2.3）分离纯化

采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为50微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在30℃温度以下浓缩到粘稠状，在-30℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

结构鉴定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

活性测定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC

实施例3

具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的制备操作步骤如下：

本实施例3所选用的蛙粪霉为固孢蛙粪霉。

（1）菌株培养

培养方法为液固混合培养，具体工序如下：

（1.1）斜面种子培养

将固孢蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于30℃恒温、培养6d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

液体摇瓶培养基：葡萄糖35.0 g/L，麦芽提取物20.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，酵母浸出粉2.0 g/L，氯化钾（KCl

在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种2支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃、转速200 rpm，培养5d，即得到二级菌种。

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种到50L的发酵罐，装液量为罐体积的60%，接种量6%，通气量按体积比1:1.5（v/v），压力0.15MP，30℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。

发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。

（1.4）四级培养

四级培养为固体培养：将三级菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3%，25℃恒温通气培养10天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基为：葡萄糖25.0 g/L，麦芽提取物10.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸出粉1.0 g/L，氯化钾（KCl

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

（2.1）最终发酵物的预处理

将固体的最终发酵物在30℃干燥到含水率等于20%，然后粉碎到20目备用。

（2.2）提取

将干燥粉碎的最终发酵物用乙醇提取；料液比为1:2（W:V）、超声波功率10KHz,提取时间为10分钟；提取结束后用0.20μm滤膜过滤；滤液在温度30℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；

（3.3）分离纯化

采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为25微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在40℃温度以下浓缩到粘稠状，在10℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

结构鉴定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

活性测定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC

实施例4：

具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽的制备操作步骤如下：

本实施例4所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉。

（1）菌株培养

培养方法为液体固体混合培养，具体工序如下：

（1.1）斜面种子培养

将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于29℃恒温、培养5d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

液体摇瓶培养基：葡萄糖40.0 g/L，麦芽提取物25.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母浸出粉3.0 g/L，氯化钾（KCl

在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃、转速180 rpm，培养4d，即得到二级菌种。

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种到30L的发酵罐，装液量为罐体积的65%，接种量6%，通气量按体积比1:1.2（v/v），压力0.12MP，32℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。

发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。

（1.4）四级培养

四级培养采用固体培养：将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的10%，36℃恒温通气培养8天，得到固体的最终发酵物；

固体培养基为：葡萄糖50.0 g/L，麦芽提取物30.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母浸出粉4.0 g/L，氯化钾（KCl

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

（2.1）最终发酵物的预处理

将固体的最终发酵物在130℃干燥到含水率10%，然后粉碎到120目备用。

（2.2）提取

将干燥粉碎的最终发酵物用甲醇提取，料液比为1:20（W:V）、超声波功率100KHz,提取时间为200分钟；提取结束后在用1.0μm滤膜过滤；滤液在40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。

（2.3）分离纯化

采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为10微米,色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-苏-缬-异亮-亮肽。

结构鉴定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

活性测定结果显示，环色-苏-缬-异亮-亮肽对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC