一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，更具体地，涉及一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法。

背景技术

干细胞，是一种多功能细胞，具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。在成体的器官中，干细胞可以通过不断分裂来修复组织。

组织器官的损伤和功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题，完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、器官或肢体的伤残一直是人类的梦想，也是难以攻克的医学高峰。目前的治疗方案均难以完全修复受损的组织、器官或使其功能得以长期恢复。

干细胞是对疾病进行基因治疗的理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。

但是，干细胞在使用前，需要提前准备好并冻存处理，冻存是将细胞放在低温环境，减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其原理是将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候通过复苏细胞即可使用。细胞冻存时向细胞悬液中加入保护剂，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内水分渗透出细胞外，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冰冻过程中的损伤。

目前，干细胞冻存主要是采取-196℃液氮超低温条件下保存，细胞在超低温条件下，代谢功能停滞，细胞可长时间保存，当需要用细胞时，取出冻存的细胞在37℃水浴中快速解冻，即可恢复细胞的活性及功能。但是现有的干细胞冻存方法中，只解决了干细胞和肿瘤细胞的冻存，而干细胞冻存方法还未能很好地解决。由于干细胞的细胞结构和细胞特性，用以往的细胞冻存液及冻存方法冻存干细胞时，干细胞易受到冰晶损伤，复苏后细胞活率低，细胞增殖数量不足，细胞易老化，效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。

发明内容

为了克服现有技术中干细胞冻存方法存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种干细胞冻存液及用该冻存液冻存干细胞的方法，该干细胞冻存液能有效地保护干细胞，避免干细胞在冻存的过程中受到损伤，提高干细胞复苏后成活率，并保证干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，延长干细胞的存活期，减少干细胞表面抗原的丢失。

本发明的目的在于提供一种干细胞冻存冻及干细胞冻存方法，有效解决干细胞长期存储、长时间运输、使用灵活性等。

本发明的目的之一通过下述的方案实现：

一种干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；

15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；

1％～5％的磺基水杨酸；

5％～10％的乙酰胺；及

8％～12％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:2～1:10。

较好地，所述干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；

18％的人血白蛋白，浓度为25g/l；

2％的磺基水杨酸；

8％的乙酰胺；及

10％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:4。

本发明的目的之二在于提供一种干细胞冻存方法，其使用上述冻存液对干细胞进行冻存。

较好地，所述干细胞冻存方法中，需要用所述冻存液重悬干细胞，将干细胞的密度调至1.0×10

较好地，所述干细胞冻存方法中，干细胞冻存还包括如下步骤：

将装有所述干细胞的冻存管放入-80℃冷冻箱中，预冷冻12小时；

取出冻存管，转入液氮中永久保存。

较好地，所述干细胞冻存方法中，所述干细胞为间充质干细胞。

较好地，所述干细胞冻存方法中，所述间充质干细胞包括脐带干细胞、骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞。

本发明提供的干细胞冻存液具有以下优点：

1、不含有动物血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性；

2、含有磺基水杨酸和乙酰胺成分，磺基水杨酸是非渗透性冷冻保护剂，其本身不能渗透到细胞内，可以降低培养基中自由水的含量，进而减少细胞内冰晶形成，从而减低细胞破损；乙酰胺则属于渗透性冷冻保护剂，其与二甲基亚砜组合，一方面与细胞外溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，进而减少冰晶形成；另一方面，在细胞冷冻悬液完成凝固之前，渗透到细胞内，并在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，可以防止细胞内水分过度外渗，避免细胞过分脱水皱缩。

3、采用本发明干细胞冻存液冻存干细胞，室温下转至在-80℃下冻存几个小时后，直接转至液氮中进行永久冻存，中间省去由室温转至-20℃冻存几个小时后，在转存-80℃这个流程环节。采用这种干细胞冻存干细胞，操作简单，可以避免豁免减少细胞在转换冻存时的破损，提高了干细胞冻存效果，且可以保证细胞在接近冰点时细胞内水分不会结晶，保证复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响。

附图说明

图1a、1b、1c分别为人脐带干细胞冻存前后的形态图；其中，图1a为干细胞冻存前细胞形态图；图1b为采用实施例2配置的冻存液冻存一个月后复苏后的脐带干细胞形态图；图1c为采用对比例1配置的冻存液冻存一个月后复苏后的脐带干细胞形态图；显微镜放大倍数为100倍；

图2为脐带干细胞冻存前后细胞活性曲线图；

图3a、3b、3c分别实施例2和对比例1配置的冻存液冻存前后脐带干细胞对表面标志物的流式测试图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明的目的之一通过下述的方案实现：

本发明提供的一种干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有50％～60％的α-MEM基础培养基；

15％～20％的人血白蛋白，浓度为15～35g/l；

1％～5％的磺基水杨酸；

5％～10％的乙酰胺；及

8％～12％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为：1:2～1:10。

这种干细胞冻存液，采用无血清培养基，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性；培养基中的添加组分磺基水杨酸和乙酰胺成分。磺基水杨酸属于大分子组分，由于其本身不能渗透到细胞内，可以降低培养基中自由水的含量，进而减少细胞内冰晶形成，从而减低细胞破损；乙酰胺则可以与二甲基亚砜组合，一方面与细胞外溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，进而减少冰晶形成；另一方面，在细胞冷冻悬液完成凝固之前，渗透到细胞内，并在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，可以防止细胞内水分过度外渗，避免细胞过分脱水皱缩；因此，采用本发明干细胞冻存液冻存干细胞，室温下转至在-80℃下冻存几个小时后，直接转至液氮中进行永久冻存，中间省去由室温转至-20℃冻存几个小时后，在转存-80℃这个流程环节。采用这种干细胞冻存干细胞，操作简单，可以避免豁免减少细胞在转换冻存时的破损，提高了干细胞冻存效果，且可以保证细胞在接近冰点时细胞内水分不会结晶，保证复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响。

在一个较好实施例中，干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；

18％的人血白蛋白，浓度为25g/l；

2％的磺基水杨酸；

8％的乙酰胺；及

10％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:4。

在又一个较好实施例中，干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；

15％的人血白蛋白，浓度为25g/l；

1％的磺基水杨酸；

5％的乙酰胺；及

8％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:2。

又一个较好实施例中，干细胞冻存液，按照体积百分比含量计算，包括如下成分：

无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；

20％的人血白蛋白，浓度为25g/l；

1％的磺基水杨酸；

10％的乙酰胺；及

12％的二甲基亚砜；

其中，磺基水杨酸与乙酰胺的体积比为1:10。

一种干细胞冻存方法，其使用上述冻存液对干细胞进行冻存。

一个实施例中，在干细胞冻存时，需要用上述任一冻存液重悬干细胞，将干细胞的密度调至1.0×10

干细胞冻存的具体处理流程如下：

1)、取P3代的干细胞，将干细胞重悬混合均匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中，离心去除上清液，收集细胞沉淀；

2)、往离心管中加入冻存液重悬后分装在2ml的冻存管中，并控制干细胞数量约为至1.0×10

3)、将装有干细胞的冻存管放入细胞程序降温盒中放入-80℃冷冻箱，预冷冻12小时；

4)、取出细胞程序降温盒，将冻存管转入液氮中保存。

上述干细胞为间充质干细胞，如，脐带干细胞、骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞。

以下实施例中，以人脐带干细胞冻存为例进行说明

实施例1、人脐带干细胞培养

①、在生物安全柜或超净工作台内，取出脐带，连同脐带夹用置于10ml离心管或10cm培养皿中，用75％的酒精泡2min；

②、用酒精处理完，迅速将脐带移入装有PBS或生理盐水的容器中，浸泡清洗2次，每次2min即可；

③、剪掉脐带夹，把脐带剪成小段，每段2-3cm，用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带，用带齿镊子把脐静脉、脐动脉以及脐带包膜去除，防止杂细胞混入；

④、用剪刀剪碎脐带组织，0.1％Ⅱ型胶原酶(稀释液用DMEM/F12)2小时消化，37℃摇床消化；

⑤、用PBS或生理盐水多次冲洗，尽可能去掉附着在组织表面上的胶原酶；最后用完全培养基冲洗1-2次，去除PBS或生理盐水；

⑥、将清洗消化后的脐带组织倒入培养皿中，加入10ml培养基，放入37℃、5％CO

⑦、将细胞及培养液转入培养瓶中，继续添加6ml培养基进行P1代培养；

⑧、一两天后，细胞数量会有明显增加，分别移入两个50ml离心管中，加入PBS(或生理盐水)至50ml，混匀，2500rpm、6min离心，去除上清液，留下细胞沉淀；

⑨、用6ml完全培养基重悬细胞，1000rpm、6min离心，铺到培养瓶中，加入5ml完全培养基进行P2代培养。

⑩、三天后，将细胞及培养液转移至培养袋中，并添加4ml完全培养基继续P3代培养；之后每三天换液，直至长满，则获得P3代人脐带干细胞。

实施例2、冻存液配置一

市购无血清GT-T551H3培养基，该培养基中包含有55％的α-MEM基础培养基；往培养基中添加浓度为25g/l的人血白蛋白、磺基水杨酸、乙酰胺及二甲基亚砜，混合均匀；其中，在培养液中，人血白蛋白、磺基水杨酸、乙酰胺及二甲基亚砜的最终体积百分比含量分别是：18％、3％、8％及10％；如下表1。

表3冻存液组分配置表

实施例3、冻存液配置二

冻存液配置组分与实施例2相一致，只是配置比例不一样，见表3

表3冻存液组分配置表

实施例4、冻存液配置三

冻存液配置组分与实施例2相一致，只是配置比例不一样，见表2

表1冻存液组分配置表

实施例5、冻存液配置四

冻存液配置组分与实施例2相一致，只是配置比例不一样，见表4

表4冻存液组分配置表

实施例6、冻存液配置五

冻存液配置组分与实施例2相一致，只是配置比例不一样，见表5

表5冻存液组分配置表

实施例7、人脐带干细胞冻存

取实施例1中的脐带干细胞重悬混合均匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中，离心去除上清液，收集细胞沉淀。

往离心管中加入实施例2中配置的冻存液，重悬脐带干细胞后分装在多个2ml的冻存管中，每个冻存管中的干细胞数量控制为1.0×10

将装有脐带干细胞的冻存管放入细胞程序降温盒中，放入-80℃冷冻箱预冷冻12小时。

取出细胞程序降温盒，将脐带干细胞冻存管转入液氮中保存。

实施例8、人脐带干细胞复苏

实施例7中脐带干细胞液氮中保存1个月后，取出冻存干细胞，在37℃水水浴中快速复温3分钟；用PBS缓冲溶液洗涤脐带干细胞两次，取小样计数，测活率。

对比例1、常规冻存液配置

常规冻存液配置成分及比例，见表6

表6冻存液组分配置表

对比例2、人脐带干细胞冻存

取对比例1中的脐带干细胞重悬混合均匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中，离心去除上清液，收集细胞沉淀。

往离心管中加入对比例1中配置的冻存液，重悬脐带干细胞后分装在多个2ml的冻存管中，每个冻存管中的干细胞数量控制为1.0×10

将装有脐带干细胞的冻存管放入细胞程序降温盒中，放入-20℃冷冻箱预冷冻12小时；然后取出冻存盒快速放入-80℃冷冻箱中冷冻12小时。

取出细胞程序降温盒，将脐带干细胞冻存管转入液氮中保存。

对比例3、人脐带干细胞复苏

对比例2中脐带干细胞液氮中保存1个月后，取出冻存干细胞，在37℃水水浴中快速复温3分钟；用PBS缓冲溶液洗涤脐带干细胞两次，取小样计数，测活率。

以下是干细胞表征或测试结果分析

一、细胞活性检测

图1a为未冻存前的脐带干细胞形态图；图1b为采用实施例1制得的冻存液冻存一个月后脐带干细胞形态图；图1c为采用对比例1制得的冻存液冻存一个月后脐带干细胞形态图。显

冻存前，脐带干细胞成杂乱无章的排列分布；冻存液冻存一个月复苏后，脐带干细胞则成旋涡状分布，表面细胞活性较好，旋涡状越明显，越规则，则表明细胞活性越强。图1b中，脐带干细胞复苏后，呈现非常明显的旋涡状排列，图1c中，脐带干细胞复苏后，也呈现旋涡状排列；但是，图1b中的旋涡状明显优于图1c中的旋涡状，因此，相对于对比例中常规的冻存液，本发明配置的冻存液冻存脐带干细胞，其复苏后细胞的活性较好。

另外，脐带干细胞冻存复苏后，其细胞形态一般为梭型状态；图1b中，脐带干细胞梭型状态较明显，且大小、长短相对均一；图1c中，虽然脐带干细胞的外形形态也显示为梭型状态，但是其大小、长短而言，均一性相对要差一些。梭形细胞的活性相对较好，有利于进一步生长、扩增增殖。

二、细胞成活率测试

如图2和表1所示，采用本发明冻存液和对比例冻存液冻存脐带干细胞前后，对细胞活性率进行检测。从图2和表1中可知，对脐带干细胞冻存前后数量测试，分别以1.0×10

表1脐带干细胞活性检测

三、细胞流式检测

图3a、3b、3c分别实施例2和对比例1配置的冻存液冻存前后脐带干细胞对表面标志物的流式测试图；其中，图3a是脐带干细胞冻存前对表面标志物的流式测试图；图3b为采用实施例2配置冻存液冻存脐带干细胞一个月复苏后细胞对表面标志物的流式测试图；图3c为采用对比1配置冻存液冻存脐带干细胞一个月复苏后细胞对表面标志物的流式测试图。

表2为实施例2和对比例1配置的冻存液冻存前后脐带干细胞对表面标志物的百分比数据。

表2为脐带干细胞对表面标志物的百分比数据

由表2可知，本发明配置的冻存液与对比例配置的冻存液，在冻存脐带干细胞前后比对中，细胞对表面标志物的影响。总体而言，本发明配置的冻存液冻存细胞复苏后，细胞对表面标志物基本上无影响；对比例配置的冻存液冻存细胞复苏后，细胞对表面标志物有一点影响。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。