L-草铵膦的制备方法

技术领域

本发明涉及一种L-草铵膦的制备方法。

背景技术

草铵膦作为具有渗透性的广谱除草剂被广泛使用，已知草铵膦的渗透性除草剂特性是由草铵膦的L-异构体(isomer)引起的作用。由此，已经研究了用于制备草铵膦L-异构体的各种方法。例如，使用了通过从D-异构体和L-异构体的外消旋混合物中选择性地分离L-异构体来制备草铵膦L-异构体的方法。这样的方法存在的问题是，L-异构体的收率降低了一半或更少，产生了作为过量副产物的不需要的D-异构体，需要分离剂(resolvingagent)、分离装置(resolving device)等进行L-异构体的分离，因此工序复杂。

因此，需要开发一种简单且高收率地制备高光学纯度草铵膦L-异构体的方法。

发明内容

所要解决的课题

本申请的目的是提供一种简单且高收率地制备具有高光学纯度的L-草铵膦的方法。

解决课题的方法

根据一方面，提供一种L-草铵膦的制备方法，其是由L-内酯衍生物化合物制备L-草铵膦的方法，包括：由以下化学式1的化合物制备以下化学式2的化合物的步骤(步骤a)；以及由上述化学式2的化合物制备以下化学式3的L-草铵膦的步骤(步骤b)。

<化学式1>

<化学式2>

<化学式3>

在上述式中，

R

R

R

上述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂芳基的取代基彼此独立地为选自由氢、卤素、羧基(-COOH)、氨基(-NH

发明效果

根据一种实施方式的L-草铵膦的制备方法能够通过使用新的中间体化合物和具备新的合成路线而简单地制造具有高光学纯度的L-草铵膦。

另外，可以通过简单方法以高收率制备L-草铵膦。

具体实施方式

在下文中，将更详细地描述根据一种实施方式的L-草铵膦的制备方法。

以下描述的本申请的发明构思可以以各种形式进行修改并且可以具有各种实施方式，因此将详细说明和描述具体实施方式。然而，所述实施方式并非旨在限制本申请的发明构思，而应当理解的是，本发明包括属于本申请的发明构思的技术范围的所有修改方案、等同方案和替换方案。

如本文所用，诸如第一、第二、第三、第四等术语可用于描述各种要素，但所述要素不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一种构成要素与另一种构成要素区分开来。

如本文所用，术语“L-草铵膦”是草铵膦的L-异构体。如本文所用，术语“D-草铵膦”是草铵膦的D-异构体。

术语“％对映体过量(％enantiomeric excess：％ee)”是指样品的对映体纯度，即样品中一种对映体的超出另一种对映体的百分比。例如，L-草铵膦的对映体过量是草铵膦中L-草铵膦的超出D-草铵膦的百分比。例如，L-草铵膦的对映体过量由以下等式1表示。

<等式1>

L-草铵膦对映体过量＝[(L-草铵膦含量-D-草铵膦含量)/(L-草铵膦含量+D-草铵膦含量)]×100

根据一种实施方式的L-草铵膦的制备方法是由L-内酯衍生物化合物制备L-草铵膦的方法，包括：由以下化学式1的化合物制备以下化学式2的化合物的步骤(步骤a)；以及由上述化学式2的化合物制备以下化学式3的L-草铵膦的步骤(步骤b)。

<化学式1>

<化学式2>

<化学式3>

在上述式中，

R

R

R

上述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂芳基的取代基彼此独立地为选自由氢、卤素、羧基(-COOH)、氨基(-NH

更具体地，步骤a可以包括通过使化学式1的化合物与卤化剂(halogenationagent)和至少一种R

<化学式4>

在上述式中，R

即，由化学式4表示的第一中间体化合物可以通过使化学式1的化合物与卤化剂和至少一种R

<化学式1>

<化学式4>

在化学式1的化合物和由化学式4表示的第一中间体化合物中，例如，R

化学式1的化合物可以例如由含有化学式1的化合物的前体(precursor)的发酵液制备。因此，可以通过使用由发酵过程中产生的化学式1的化合物的前体衍生的化学式1的化合物来有效地制备L-草铵膦。化学式1的化合物的前体例如可以是L-高丝氨酸衍生物。L-高丝氨酸衍生物例如可以是O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸等，它们是L-高丝氨酸的O-取代形式。例如，可以从发酵液中分离作为第一中间体化合物的前体的L-高丝氨酸衍生物，并且可以使分离的L-高丝氨酸衍生物进行成环反应以制备化学式1的化合物。

此外，通过使用衍生自O-取代的L-高丝氨酸衍生物的中间体化合物，不需要使用另外的材料来引入氨基保护基团，并且L-草铵膦可以以一锅(one pot)法制备，在一锅法中，所有反应都在一个反应器中进行，因此是高效的。

如本文所用，术语“含有化学式1的化合物的前体的发酵液”可以是含有由发酵过程产生的化学式的1化合物的前体的发酵液。发酵液可以是通过在含有糖的培养基中培养微生物而获得的发酵液，或者可替代地，可以是通过酶促转化通过培养微生物获得的发酵液而获得的发酵液。例如，含有化学式1的化合物的前体的发酵液可以是在含有糖的培养基中培养微生物而直接产生化学式1的化合物的前体的发酵液，或通过酶促转化在含糖培养基中培养微生物所产生的氨基酸而获得的含有化学式1的化合物的前体的发酵液。用于制备含有化学式1的化合物的前体的发酵液的微生物种类没有特别限制，可以使用本技术领域中能够通过直接发酵或酶促转化而产生L-高丝氨酸衍生物的任何微生物。含有L-高丝氨酸衍生物的发酵液可以是，例如，通过发酵含有KR10-2014-0116010的实施例2中所公开的O-琥珀酰-L-高丝氨酸生产菌株CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL(保藏号：KCCM-10872)或O-乙酰-L-高丝氨酸生产菌株CJM-BTJA/pCJ-MetX-CL(保藏号：KCCM-10873)的培养基而获得的发酵液。

卤化剂可以包含选自由例如SOCl

基于1当量的由化学式1表示的化合物，卤化剂的含量可以是例如1至10当量、1至5当量、1至4当量、1至3当量、1至2当量、1至1.5当量、0.1至1.3当量或1至1.1当量。

至少一种R

R

基于1当量的化学式1的化合物，R

有机溶剂可以是例如醇、甲苯、苯、四氢呋喃、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙腈等，但不限于此，可以使用本技术领域中与卤化剂一起使用的任何溶剂。醇例如是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等，但不限于此。

在制备第一中间体化合物的步骤中，卤化反应(halogenation)/开环反应在例如20至100℃、20至80℃、30至70℃或40至60℃的温度下进行。在制备第一中间体化合物的步骤中，开环反应和/或取代反应可以进行例如0.1至30小时、1至30小时、5至30小时、10至30小时、15至25小时、17至23小时或18至20小时。由于在上述温度范围和时间范围内进行卤化反应和开环反应，可以更容易地制备第一中间体化合物。

在制备第一中间体化合物的步骤中，第一中间体化合物的收率可以为例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。

在制备第一中间体化合物的步骤中，具有L型的第一中间体化合物的对映体过量可以是例如10％ee或更高、20％ee或更高、30％ee或更高、40％ee或更高、50％ee或更高、60％ee或更高、70％ee或更高、80％ee或更高、90％ee或更高、91％ee或更高、92％ee或更高、93％ee或更高、94％ee或更高、95％ee或更高、96％ee或更高、97％ee或更高、98％ee或更高、或99％ee或更高。

然后，步骤a可以包括在步骤c后通过使化学式4的化合物与以下化学式5的化合物反应来制备化学式2的化合物的步骤(步骤d)。

<化学式5>

在上述式中，R

接下来，在制备由化学式2表示的第二中间体化合物的步骤中，通过使第一中间体化合物和第一酸与由以下化学式5表示的磷系化合物反应，或通过使第一中间体化合物与由化学式5表示的磷系化合物在没有第一酸的情况下反应，可以制备由以下化学式4表示的第二中间体化合物。即，由化学式2表示的第二中间体化合物可以通过使化学式4的化合物与磷系化合物反应来制备。

<化学式4>

<化学式5>

<化学式2>

在由化学式4表示的第一中间体化合物、由化学式5表示的磷系化合物和由化学式2表示的第二中间体化合物中，例如，R

由化学式5表示的磷系化合物尤其可以是甲基亚膦酸烷基酯(alkylmethylphosphonite)，例如甲基亚膦酸二乙酯(diethylmethylphosphonite，DMP)、或甲基亚膦酸乙酯(ethylmethylphosphinate，EMP)、或甲基亚膦酸丁酯(butylmethylphosphinate，BMP)。

基于1当量的由化学式4表示的第一中间体化合物，可以以0.5至10当量、0.7至8当量、0.9至7当量或1至6当量的量使用由化学式5表示的磷系化合物。

第一酸例如是路易斯酸，路易斯酸可以是例如选自KF+Al

基于100重量份的由化学式4表示的化合物，第一酸的含量可以是例如0.1至100重量份、0.1至50重量份、0.1至40重量份、0.1至30重量份、0.1至20重量份、0.1至10重量份、0.1至5重量份或0.1至2重量份。第一酸的含量过低时，可能对反应速率的影响很小，而第一酸的含量过高时，副产物可能增加。

通过使用第一酸，可以以进一步改善的收率获得第二中间体化合物。在制备第二中间体化合物的步骤中，反应可以在例如80至180℃、80至160℃、90至160℃、90至150℃、100至160℃、100至150℃、100至140℃、110至160℃、110至150℃、110至160℃、110至140℃、120至160℃、120至150℃或120至140℃的温度下进行。另一方面，当添加酸时，反应温度可以是例如80至160℃，而当不添加酸时，反应时间可以增加，反应温度可以升高。例如，当不使用酸时，反应温度可以是120至180℃。在制备第二中间体化合物的步骤中，反应可以进行例如0.1至20小时、1至20小时、1至18小时、5至15小时、6至14小时、8至14小时、10至14小时或11至13小时。由于反应在上述温度范围和时间范围内进行，可以更容易地制备第二中间体化合物。

在制备第二中间体化合物的步骤中，第二中间体化合物的收率可以为例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。

在制备第二中间体化合物的步骤中，具有L型的第二中间体化合物的对映体过量可以是例如10％ee或更高、20％ee或更高、30％ee或更高、40％ee或更高、50％ee或更高、60％ee或更高、70％ee或更高、80％ee或更高、90％ee或更高、91％ee或更高、92％ee或更高、93％ee或更高、94％ee或更高、95％ee或更高、96％ee或更高、97％ee或更高、98％ee或更高、或99％ee或更高。

根据一种实施方式，步骤a可以包括通过使化学式1的化合物与卤化剂、至少一种R

<化学式5>

在上述式中，R

具体地，R

由化学式5表示的磷系化合物尤其可以是甲基亚膦酸烷基酯，例如甲基亚膦酸二乙酯(DMP)、或甲基亚膦酸乙酯(EMP)、或甲基亚膦酸丁酯(BMP)。

基于1当量的化学式1的化合物，可以以0.5至10当量、0.7至8当量、0.9至7当量或1至6当量的量使用由化学式5表示的磷系化合物。

卤化剂可以包含例如选自由HCl、HBr、HI、碳酰氯、SOCl

在通过使化学式1的化合物与卤化剂、至少一种R

至少一种R

R

基于1当量的化学式1的化合物，R

当使用化学式1的化合物、卤化剂和化学式5的磷系化合物制备由化学式2表示的第二中间体化合物时，反应可以在例如80至180℃、80至160℃、90至160℃、90至150℃、100至160℃、100至150℃、100至140℃、110至160℃、110至150℃、110至160℃、110至140℃、120至160℃、120至150℃或120至140℃的温度下进行。反应具体可以进行0.1至20小时。

具体的反应条件参考由上述化学式1的化合物制备由化学式2表示的第二中间体化合物的步骤。

在制备第二中间体化合物的步骤中，第二中间体化合物的收率和具有L型的第二中间体化合物的对映体过量与上述相同。

根据一种实施方式，由化学式2的化合物制备化学式3的L-草铵膦的步骤b可以通过在酸催化剂下使化学式2的化合物水解来进行。即，化学式4的第二中间体化合物可以与第二酸(酸催化剂)反应以通过水解(hydrolysis)除去末端官能团，从而制备由化学式3表示的L-草铵膦。

第二酸例如可以为选自由HCl、H

基于100重量份的由化学式2表示的第二中间体化合物，第二酸的含量可以是例如0.1至100重量份、0.1至50重量份、0.1至40重量份、0.1至30重量份、0.1至20重量份、0.1至10重量份、0.1至5重量份或0.1至2重量份。第二酸的含量过低时，可能对反应速率的影响很小，而第二酸的含量过高时，副产物可能增加。

当使用第二酸时溶剂为水时，含水水溶液的pH值可以为1至3。即，在制备第四中间体化合物的步骤中，反应溶液可以为pH值为1至3的酸性水溶液。由于反应溶液的pH值在该范围内，可以更容易地制备第四中间体化合物。

在制备L-草铵膦的步骤中，水解反应可以在例如20至150℃、40至140℃、60至130℃、80至120℃或90至110℃的温度下进行。在制备L-草铵膦的步骤中，水解反应可以进行例如0.1至30小时、1至20小时、1至15小时、3至13小时、4至12小时、5至11小时、6至10小时、7至9小时、10至30小时、12至24小时、15至20小时或15至18小时。由于水解反应在上述温度范围和时间范围内进行，可以更容易制备L-草铵膦。

在制备L-草铵膦的步骤中，L-草铵膦的收率可以为例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。

制备的L-草铵膦的对映体过量可以为例如10％ee或更高、20％ee或更高、30％ee或更高、40％ee或更高、50％ee或更高、60％ee或更高、70％ee或更高、80％ee或更高、90％ee或更高、91％ee或更高、92％ee或更高、93％ee或更高、94％ee或更高、95％ee或更高、96％ee或更高、97％ee或更高、98％ee或更高、或99％ee或更高。例如，由于L-草铵膦具有这样的改善的光学纯度，因此可以提供进一步改善的除草剂效果。

在本发明中，L-草铵膦可包括其盐形式。具体地，L-草铵膦的盐可以是例如L-草铵膦的盐酸盐、L-草铵膦的硫酸盐、L-草铵膦的碳酸盐、L-草铵膦的铵盐等，但不必须限于此，可以没有限制地使用该盐，只要其是通过上述草铵膦制备方法获得的L-草铵膦的盐。

根据本发明，通过使用化学式1的第一中间体化合物的合成路线，可以简单且高收率地制备具有高光学纯度的L-草铵膦。

此外，化学式1的化合物可以通过以下过程制备：使由以下化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物与第一碱反应以制备由以下式7表示的第三中间体化合物，然后使第三中间体化合物与第三酸反应。即，在步骤a或步骤a-1之前，该方法还可以包括通过使以下化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物与第一碱反应制备化学式7表示的第三中间体化合物的步骤；以及通过使第三中间体化合物与第三酸反应以制备化学式1的化合物的步骤。

更具体地，由以下化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物可以与第一碱反应，以制备由以下化学式7表示的第三中间体化合物。

在由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物中，由R

<化学式6>

<化学式7>

在上述式中，

R

在由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物中，例如，R

由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物可以例如由含有L-高丝氨酸衍生物的发酵液制备。因此，可以通过使用发酵过程中产生的由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物来有效地制备L-草铵膦。

如本文所用，术语“含有L-高丝氨酸衍生物的发酵液”可以是含有由发酵过程产生的L-高丝氨酸衍生物的发酵液。关于发酵，可以与上述内容相同。

第一碱例如可以是选自NH

第一碱尤其可以是氢氧化钠。基于100重量份的由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物，第一碱的含量可为例如0.1至100重量份、0.1至50重量份、0.1至40重量份、0.1至30重量份、0.1至20重量份、0.1至10重量份、0.1至5重量份或0.1至2重量份。当第一碱的含量过低时，对反应速率的影响可能很小，而当第一碱的含量过多时，副产物可能会增加。制备化学式7的第三中间体化合物的步骤可以在溶剂下进行。溶剂可以是水或有机溶剂。当使用第一碱且溶剂为水时，含水的水溶液的pH值可以为9至14、10至14、或12至14。由于反应溶液的pH值在该范围内，可以更容易地制备L-高丝氨酸系化合物。在制备L-高丝氨酸系化合物的步骤中，官能团转移反应可以在例如20至150℃的温度下进行。在制备L-高丝氨酸系化合物的步骤中，官能团转移反应可以进行例如0.1至20小时。由于在上述温度范围和时间范围内进行官能团转移反应，可以更容易地制备第三中间体化合物。

在制备第三中间体化合物的步骤中，第三中间体化合物的收率可以为例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。

在制备第三中间体化合物的步骤中，第三中间体化合物的对映体过量可以是例如10％ee或更高、20％ee或更高、30％ee或更高、40％ee或更高、50％ee或更高、60％ee或更高、70％ee或更高、80％ee或更高、90％ee或更高、91％ee或更高、92％ee或更高、93％ee或更高、94％ee或更高、95％ee或更高、96％ee或更高、97％ee或更高、98％ee或更高、或99％ee或更高。

接下来，由化学式7表示的第三中间体化合物可以与第三酸反应以制备由化学式1表示的化合物。

即，由化学式7表示的第三中间体化合物可以与第三酸反应而内酯化以制备由以下化学式1表示的内酯化合物。例如，由化学式7表示的第三中间体化合物可以通过第三酸形成内酯环。

<化学式7>

<化学式1>

第三酸可以是例如选自由乙酸、HCl、H

第三酸的含量可以根据使用的酸的类型适当地选择。例如，相对于由化学式4表示的第一中间体化合物，可以以0.1当量或更多的量使用第三酸。具体而言，在盐酸或硫酸的情况下，其可以为0.1至2当量、0.3至1.8当量、或0.5至1.5当量，而在乙酸的情况下，其可以为10当量或更多、20当量或更多、10当量至50当量、或20至40当量。当第三酸的含量过低时，对反应速率的影响可能很小，当第三酸的含量过高时，副产物可能增加。

制备化学式1的化合物的步骤可以在溶剂存在下进行，或者可以在无溶剂的纯净条件下进行。溶剂可以是水或有机溶剂。

在制备化学式1的化合物的步骤中，内酯形成反应可以在例如20至150℃的温度下进行。在制备第一中间体化合物的步骤中，内酯形成反应可以进行例如0.1至20小时。由于内酯形成反应在上述温度范围和时间范围内进行，可以更容易地制备化学式1的化合物。

在制备化学式1的化合物的步骤，化学式1的化合物的收率可以为例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。

在制备化学式1的化合物的步骤中，具有L型的第一中间体化合物的对映体过量可以是例如10％ee或更高、20％ee或更高、30％ee或更高、40％ee或更高、50％ee或更高、60％ee或更高、70％ee或更高、80％ee或更高、90％ee或更高、91％ee或更高、92％ee或更高、93％ee或更高、94％ee或更高、95％ee或更高、96％ee或更高、97％ee或更高、98％ee或更高、或99％ee或更高。

以下结合实施例和比较例对本申请作更详细的说明。但是，这些实施例仅用于说明目的，本申请的范围并不限于此。

(步骤1-1：制备2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯)

在0℃下向4g(28mmol)N-乙酰-L-高丝氨酸内酯溶于60mL乙醇而成的溶液中缓慢添加亚硫酰氯(6.6g，56mmol)，制备反应溶液。将制备的反应溶液在80℃下搅拌3小时。然后，向反应完成的溶液中添加1N NaOH(aq)进行中和，然后减压浓缩以制备浓缩液。将制备的浓缩液用乙酸乙酯稀释，然后用盐水洗涤一次。有机层用无水硫酸镁(MgSO

通过柱色谱法(流动相，己烷:乙酸乙酯＝1:1)分离所得残余物，得到5.12g(收率88％)2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯，其为无色油。

(步骤1-2：制备2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯)

溶解2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯(2.6g，12.6mmol)和甲基亚膦酸二乙酯(3.4g，25.2mmol，2当量)后，通入氮气，120℃下搅拌12小时。反应完成后，在80℃和1mmHg的减压下除去未反应的甲基亚膦酸二乙酯。通过柱色谱法(流动相，乙酸乙酯:异丙醇＝4:1体积比)分离所得残余物，得到2.25g(收率64％)2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯，其为无色油。

(步骤1-3：L-草铵膦(L-膦丝菌素)盐酸盐的制备)

将2g(7.17mmol)2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯溶于20mL的6NHCl后，放入密封管(Seal tube)中，在120℃下搅拌15小时。水解反应完成后，减压除去溶剂，得到1.49g白色L-草铵膦盐酸盐(收率96％；步骤1-1至1-3的总收率61％)。

向O-乙酰-L-高丝氨酸(II)(1g，6.2mmol)溶于30mL水而成的水溶液中，缓慢添加作为碱催化剂的NaOH(40wt.％水溶液)以制备pH为9的反应溶液。然后，将制备的反应溶液在25℃下搅拌30分钟。然后，将反应溶液加热至50℃后，在50℃下搅拌5小时。然后，向反应完成的溶液中添加1N HCl(aq)进行中和，然后减压浓缩以制备浓缩液。将制备的浓缩液冷却至0℃后，向其中加入乙醇，将混合物搅拌，减压过滤，得到0.98g(收率98％)N-乙酰-L-高丝氨酸(III-1)，其为白色固体。

在O-乙酰-L-高丝氨酸(1g，6.2mmol)溶于30mL水而成的水溶液中，缓慢加入c-HCl(浓盐酸)作为酸，制备pH为2的反应溶液。将制备的反应溶液在25℃下搅拌30分钟。然后，将反应溶液加热至60℃，然后在60℃下搅拌3小时。然后，向反应完成的溶液中添加1N NaOH(aq)进行中和，然后减压浓缩以制备浓缩液。将制备的浓缩液冷却至0℃，然后向其中添加异丙醇，将混合物搅拌，减压过滤，得到0.87g(收率98％)N-乙酰-L-高丝氨酸内酯，其为白色固体。

(步骤2-1：制备2-(琥珀酰氨基)-4-氯丁酸乙酯)

使用N-琥珀酰-L-高丝氨酸内酯，以与实施例1相同的方法制备2-(琥珀酰氨基)-4-氯丁酸乙酯。

随后，由2-(琥珀酰氨基)-4-氯丁酸乙酯，以与实施例1相同的方法得到白色L-草铵膦盐酸盐(4步骤(步骤1-2和步骤1-3)的总收率51％)。

向O-琥珀酰-L-高丝氨酸(1g，4.57mmol)溶于30mL水而成的水溶液中，缓慢添加NaOH(40wt.％水溶液)以制备pH为9的反应溶液。

然后，将制备的反应溶液在25℃下搅拌30分钟。然后，将反应溶液加热至50℃后，在50℃下搅拌5小时。然后，向反应完成的溶液中添加1N HCl(aq)进行中和，然后减压浓缩以制备浓缩液。将制备的浓缩液冷却至0℃后，向其中添加乙醇，将混合物搅拌，减压过滤。由此，获得0.98g(收率98％)N-琥珀酰-L-高丝氨酸，其为白色固体。

在N-琥珀酰-L-高丝氨酸(1g)溶于30mL水而成的水溶液中，缓慢加入c-HCl(浓盐酸)作为酸，制备pH为2的反应溶液。将制备的反应溶液在25℃下搅拌30分钟。然后，将反应溶液加热至60℃，然后在60℃下搅拌3小时。然后，向反应完成的溶液中添加1N NaOH(aq)进行中和，然后减压浓缩以制备浓缩液。将制备的浓缩液冷却至0℃，向其中加入乙醇，将混合物搅拌，减压过滤，得到(收率98％)N-琥珀酰-L-高丝氨酸内酯，其为白色固体。

(步骤3-1：制备2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯)

将1.8g(12.6mmol)N-乙酰基-L-高丝氨酸内酯溶解在20mL乙醇中，然后将甲基亚膦酸二乙酯(3.4g，25.2mmol，2当量)和三甲基碘硅烷(5.0g，25.2mmol，2当量)放入密封管中，通入氮气，然后140℃下搅拌14小时。

反应完成后，在80℃和1mmHg的减压下除去未反应的甲基亚膦酸二乙酯。通过柱色谱法(流动相，乙酸乙酯:异丙醇＝4:1体积比)分离所得残余物，得到4.42g(收率62.8％)2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯，其为无色油。

(步骤3-2：L-草铵膦(L-膦丝菌素)盐酸盐的制备)

将2g(7.17mmol)2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯溶于20mL的6NHCl后，放入密封管中，在120℃下搅拌15小时。水解反应完成后，减压除去溶剂，得到1.49g(收率96％)白色L-草铵膦盐酸盐。

(步骤4-1：制备2-(琥珀酰氨基)-4(乙氧基氧膦基)丁酸乙酯)

使用N-琥珀酰-L-高丝氨酸内酯，以与实施例1相同的方法制备2-(琥珀酰氨基)-4-(乙氧基氧膦基)丁酸乙酯。

随后，以与实施例1中相同的方法水解2-(琥珀酰氨基)-4-(乙氧基氧膦基)丁酸乙酯以获得白色L-草铵膦盐酸盐(收率96％)。

根据USP 6,359,162的实施例1中公开的方法制备草铵膦。制备的草铵膦是外消旋混合物(racemic mixture)。

为了比较在高丝氨酸内酯中引入保护基团的L-草铵膦制备方法和反应结果，按照以下反应方案1制备L-草铵膦。

[反应方案1]

各反应步骤的反应条件和反应结果见下表1。

[表1]

(OAHS：O-乙酰高丝氨酸，HSL：高丝氨酸内酯，NecHSL：N-乙氧基羰基高丝氨酸内酯，Cl-NecHSL-OEt：2-(乙氧基羰基氨基)-4-氯丁酸乙酯，P-NecHSL-OEt：2-(乙氧基羰基氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯)

如表1所示，当使用盐酸由L-高丝氨酸衍生物制备内酯化合物时，得到反应方案1所示的高丝氨酸内酯。得到上述高丝氨酸内酯，用乙氧基羰基保护高丝氨酸内酯中的胺基后，用卤化剂卤化，与磷系化合物结合后，水解制备L-草铵膦。由此，确认到以低收率获得L-草铵膦。

使用手性HPLC测定实施例1至4和比较例1中合成的L-草铵膦的对映体过量，结果示于下表2中。

参考J.Chromatogr.368,413(1986)中公开的方法进行手性HPLC分析。

使用Sumichiral OA6100(4.6×150mm)、

[表2]

如表2所示，在实施例1至4中制备的草铵膦的情况下，与比较例1中制备的草铵膦相比，L-草铵膦的对映体过量是显著的，因此，通过包含本发明中间体化合物的制备方法，可以简单地以高纯度制备L-草铵膦。

确认了由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物制备由化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物的根据pH的获得情况。通过使用L-高丝氨酸衍生物O-乙酰-L-高丝氨酸作为起始物料，以与参考例1(步骤1-4)的制备方法相同的方法获得L-高丝氨酸系化合物N-乙酰-L-高丝氨酸，条件是反应过程中的pH分别变成8.2、9.2、10.2、12.7和13.4，结果见下表3。

[表3]

(OAHS：O-乙酰-L-高丝氨酸，NAHS：N-乙酰-L-高丝氨酸)

如表3所示，当由化学式6表示的L-高丝氨酸衍生物制备化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物时，N-乙酰-L-高丝氨酸的收率随着pH的增加而增加，特别是当pH为9或更高时，以高收率获得N-乙酰-L-高丝氨酸。

确认了由化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物制备化学式1表示的内酯化合物的根据反应条件的获得情况。通过使用N-乙酰-L-高丝氨酸作为高丝氨酸系化合物，以与参考例1(步骤1-5)的制备方法相同的方法获得由化学式1表示的化合物N-乙酰-L-高丝氨酸内酯，条件是反应过程中酸的当量和反应温度分别如表4至表6所示改变，结果如下表4至表6所示。

[表4]

(NAHS：N-乙酰-L-高丝氨酸，NAHSL：N-乙酰-L-高丝氨酸内酯)

如表4所示，当使用乙酸由化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物制备化学式1表示的化合物时，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率随着乙酸当量的增加而增加，特别是当乙酸当量为2.6或更大时，以高收率获得N-乙酰-L-高丝氨酸内酯。

随着反应温度的升高，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率增加，特别是当反应温度为40℃或更高时，以高收率获得N-乙酰-L-高丝氨酸内酯。

[表5]

如表5所示，当使用盐酸由化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物制备化学式1的化合物时，随着盐酸当量的增加至1.0，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率增加，而当施加1.5当量或更多的盐酸时，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率则逐渐下降。

[表6]

如表6所示，当使用硫酸由化学式7表示的L-高丝氨酸系化合物制备化学式1的化合物时，随着硫酸当量的增加至1.0，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率增加，而当施加1.5当量或更多的硫酸时，N-乙酰-L-高丝氨酸内酯的收率则逐渐下降。

确认了由化学式1的化合物制备化学式4表示的第一中间体化合物的根据反应条件的获得情况。通过使用N-乙酰-L-高丝氨酸内酯作为化学式1的化合物，以与实施例1(步骤1-1)相同的方法获得了第一中间体化合物2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯或2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯，条件是反应过程中乙醇或甲醇的当量和反应温度分别如下表7和8所示，结果也如下表7和8所示。

[表7]

(NAHSL：N-乙酰-L-高丝氨酸内酯，Cl-NAHS-OEt：2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯)

如表7所示，当使用乙醇由化学式1的化合物制备化学式4表示的第一中间体化合物时，2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯的收率随着乙醇当量的增加而增加，特别是当乙醇当量为3至10当量时，以高收率得到2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯。

随着反应温度的升高，2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯的收率增加，特别是当反应温度为40℃或更高时，以高收率得到2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯。

[表8]

(NAHSL：N-乙酰-L-高丝氨酸内酯，Cl-NAHS-OMe：2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯)

如表8所示，当使用甲醇由化学式1的化合物制备化学式4表示的第一中间体化合物时，2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯的收率随着甲醇当量的增加而增加，特别是当甲醇当量为3至10当量时，以高收率得到2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯。

随着反应温度的升高，2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯的收率增加，特别是当反应温度为40℃或更高时，以高收率得到2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸甲酯。

确认了由化学式4表示的第一中间体化合物制备化学式2表示的第二中间体化合物的根据反应条件的获得情况。以与实施例1(步骤1-2)的制备方法相同的方法获得第二中间体化合物，不同之处在于使用2-(乙酰氨基)-4-氯丁酸乙酯作为第一中间体化合物，条件是反应过程中的磷系化合物的当量及类型和反应温度分别如表9所示地变化，结果也示于表9中。

[表9]

(DMP：甲基亚膦酸二乙酯，EMP：甲基亚膦酸乙酯，BMP：甲基亚膦酸丁酯，P-NAHS-Oet：2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯)

如表9所示，使用AMP(甲基亚膦酸烷基酯)(例如DMP或EMP或BMP)作为磷系化合物，可以由化学式4表示的第一中间体化合物制备由化学式2表示的第二中间体化合物，并且当使用1当量或更多的DMP或AMP时，收率进一步增加。随着反应温度升高，收率进一步增加，特别是在120℃或更高的情况下，以高收率获得2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯。

确认了由化学式1的化合物制备化学式2表示的第二中间体化合物的根据反应条件的获得情况。通过使用N-乙酰-L-高丝氨酸内酯作为式1的化合物，以与实施例2(步骤2-1)的制备方法相同的方法获得第二中间体化合物，条件是反应过程中的卤化剂的当量及类型和反应温度分别如表10至12所示地变化，结果也示于表10至12中。

[表10]

[表11]

[表12]

(TMSI：三甲基碘硅烷，TMSBr：三甲基溴硅烷，TMSCl：三甲基氯硅烷，P-NAHS-Oet：2-(乙酰氨基)-4(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯)

如表10至12所示，可以使用三甲基硅卤化物(例如TMSI、TMSBr或TMSCl)或NaI作为卤化剂，由化学式1的化合物制备化学式2表示的第二中间体化合物。当使用0.5当量或更多的三甲基硅卤化物时，收率进一步增加。随着反应温度升高，收率进一步增加，特别是在100℃或更高的情况下，以高收率获得2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯。

在三甲基硅卤化物中，TMSI的反应性最强，并且反应性按TMSBr和TMSCl的顺序趋于更低，但都可以得到2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯。

确认了由化学式2表示的第二中间体化合物的根据反应条件的获得情况。通过使用2-(乙酰氨基)-4-(乙氧基甲基氧膦基)丁酸乙酯作为第二中间体化合物，以与实施例1(步骤1-3)的制备方法相同的方法获得L-草铵膦，条件是所用的酸、反应温度和反应时间分别如下表13所示改变，并且结果如表13所示。

[表13]

如表13所示，通过使用6N盐酸作为酸，可以在120℃下由化学式2表示的第二种中间体化合物制备L-草铵膦，随着反应时间的增加，收率有进一步增加的趋势。另外，确认反应进行15小时以上时，随着反应温度的升高，收率进一步增加。