一种测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒及其测定方法

技术领域

本申请涉及医学检验测定技术领域，更具体地，涉及一种测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒及其测定方法。

背景技术

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)有三种主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB，CK-BB。肌肉型(MM)主要存在于各种肌肉细胞中，脑型(BB)主要存在于脑细胞中，杂化型(MB)主要存在于心肌细胞中，肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)是心肌酶谱中最有特异性的酶。肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)由于主要分布于心肌中其含量变化可反映心肌状态，可用于急性心肌梗死(AMI)的诊断和预后，心肌炎诊断和预后，肌肉疾病的诊断，脑疾病如脑梗死、脑膜炎、脑炎等疾病的诊断等。正常人血清中绝大部分为CK-MM(肌酸激酶的主要活性部分)的活性，只有少量的CK-MB，CK-MB占CK总活力小于5％，绝对值不超过25U/L，而且CK-MB的测定值随CK的测定值增高而上升。当炎症或者梗死等原因引起心肌细胞受损或坏死，使得大量的CK释放到血液中，这时血清中CK-MB占CK总活力＞5％为阳性，最高值达12％～38％。急性心肌梗塞发病后3小时，血清内CK-MB即可升高，12～24小时达峰值。因此CK-MB活性增高是心肌损伤的特异指标，对心肌梗塞早期诊断和确定有无心肌坏死具有重要价值。

现在主流肌酸激酶同工酶的方法，为试剂含有与血清样本中的肌酸激酶的M亚单位结合的抗体，因而能够抑制M亚单位的活性。酶的B亚单位仍然游离，能够作用于R2中存在的底物。肌酸激酶同工酶能够可逆地催化磷酸基从磷酸肌酸转移到二磷酸腺苷(ADP)，产生肌酸和三磷酸腺苷(ATP)。所形成的ATP用于使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸和ADP。这一反应由己糖激酶(HK)催化，需要镁离子才能达到最大活性。在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的作用下，葡萄糖-6-磷酸被氧化，同时还原辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，产生NADPH和6-磷酸葡萄糖酸酯。由于NADPH形成导致的340nm吸光率的增长率与样本中肌酸激酶的同工酶(CK-MB)的活性成正比。原理反应图如下：

由于肌酸激酶的同工酶(CK-MB)在正常人血清中含量较低，为满足临床使用的灵敏度要求，一般加大样本量来提高检测的灵敏度，而加大样本量后随之带来的干扰因素增加，影响准确度，此外，NADPH的摩尔吸光系数较低，测定其变化率不明显，也会导致测定方法灵敏度较低。

附图说明

为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本申请的肌酸激酶同工酶活性的测定方法的一个实施例的流程图。

发明内容

本申请实施例所要解决的技术问题是相关技术中通过增大样本量来提高检测灵敏度，造成检测准确度降低。

为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

第一试剂和第二试剂；

所述第一试剂的组分包括第一缓冲液、二磷酸腺苷、乙二胺四乙酸二钠、乙酸镁、激活剂、一磷酸腺苷、抗人CK-MM抗体、AP5A、葡萄糖、NAD(P)+和第一防腐剂；

所述第二试剂的组分包括第二缓冲液、磷酸肌酸、乙酸镁、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、四唑盐、黄递酶和第二防腐剂。

进一步的，所述第一缓冲液为咪唑缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液及1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液中的一种。

进一步的，所述激活剂为巯基甘油、N-乙酰-L-半胱氨酸及L-半胱氨酸中的一种。

进一步的，所述第一防腐剂为叠氮钠、甲基异噻唑啉酮及Proclin系列防腐剂中的一种。

进一步的，所述第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、咪唑缓冲液及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的一种。

进一步的，所述四唑盐为WST-1或者WST-3。

进一步的，所述第二防腐剂为叠氮钠、甲基异噻唑啉酮及Proclin系列防腐剂中的一种。

进一步的，所述第一试剂采用如下工艺制得：

按照所述第一试剂对应的配方比例，将纯化水分别加入所述第一试剂的各组分中进行混合搅匀，调节pH值，制得所述第一试剂。

进一步的，所述第二试剂采用如下工艺制得：

按照所述第二试剂对应的配方比例，将纯化水分别加入所述第二试剂的各组分中进行混合搅匀，调节pH值，制得所述第二试剂。

为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种肌酸激酶同工酶活性的测定方法，应用如上所述的测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

准备肌酸激酶同工酶的样本；

将所述试剂盒中的第一试剂加入所述样本中混合均匀，并在37℃孵育5min，获得混合样本；

将所述试剂盒中的第二试剂加入孵育后的所述混合样本中，混合均匀，延迟1.5min，获得待测样本；

在检测仪的测定波长下，连续监测所述待测样品2～3min吸光度变化率，通过计算所述吸光度变化率获得肌酸激酶同工酶活性。

与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

本申请在抗人肌酸激酶CK-M抗体作用下，肌酸激酶的同工酶(CK-MB)催化磷酸基从磷酸肌酸转移到二磷酸腺苷(ADP)，产生肌酸和三磷酸腺苷(ATP)。所形成的ATP用于使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸和ADP。这一反应由己糖激酶(HK)催化，需要镁离子才能达到最大活性。在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的作用下，葡萄糖-6-磷酸被氧化，同时还原辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，产生NADPH和6-磷酸葡萄糖酸酯，NADPH在四唑盐和黄递酶作用下，生成甲臜和NADP+，在特定波长测定甲臜生成速率可间接反映肌酸激酶的同工酶活性。相比现有的测定方法，测试灵敏度较高3～4倍以上。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本申请实施例提供一种测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒，包括第一试剂R1和第二试剂R2，其中，第一试剂R1的组分包括第一缓冲液、二磷酸腺苷、乙二胺四乙酸二钠、乙酸镁、激活剂、一磷酸腺苷、抗人CK-MM抗体、AP5A、葡萄糖、NAD(P)+和第一防腐剂，第二试剂R2的组分包括第二缓冲液、磷酸肌酸、乙酸镁、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、四唑盐、黄递酶和第二防腐剂。

在本实施例的一些可选的实现方式中，试剂盒中第一试剂R1和第二试剂R2的组分和浓度可以参见表1所示。

表1

针对上述试剂盒，本申请所采用的技术原理为：在抗人肌酸激酶CK-M抗体作用下，肌酸激酶的同工酶(CK-MB)催化磷酸基从磷酸肌酸转移到二磷酸腺苷(ADP)，产生肌酸和三磷酸腺苷(ATP)。所形成的ATP用于使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸和ADP。这一反应由己糖激酶(HK)催化，需要镁离子才能达到最大活性。在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的作用下，葡萄糖-6-磷酸被氧化，同时还原辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，产生NADPH和6-磷酸葡萄糖酸酯，NADPH在四唑盐和黄递酶作用下，生成甲臜和NADP+，在特定波长测定甲臜生成速率，可间接反映出肌酸激酶同工酶的活性。原理反应式如下：

甲臜的摩尔吸光系数较高，测定其吸光变化率，可以提高检测的灵敏度。

在本实施例中，第一试剂R1中第一缓冲液的缓冲液类型可以为咪唑缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液及1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液中的一种，优选为咪唑缓冲液。

在本实施例中，第一试剂R1中的激活剂可以为巯基甘油、N-乙酰-L-半胱氨酸及L-半胱氨酸中的一种，优选为巯基甘油。

在本实施例中，第一试剂R1中的防腐剂可以为叠氮钠、甲基异噻唑啉酮及Proclin系列防腐剂中的一种，优选为叠氮钠。

在本实施例中，第二试剂R2的第二缓冲液的缓冲液类型可以为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、咪唑缓冲液及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的一种，优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

在本实施例中，第二试剂R2的四唑盐为WST-1或者WST-3。

WST(水溶性四唑盐)是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

在本实施例中，第二试剂R2的黄递酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusnegaterium)。

在本实施例中，第二试剂R2的防腐剂可以为叠氮钠、甲基异噻唑啉酮及Proclin系列防腐剂中的一种，优选为叠氮钠。

在本实施例中，第一试剂R1和第二试剂R2的配制方法为常规方法，即按照上述表1的配方比例，将纯化水分别加入第一试剂R1和第二试剂R2的各组分中至预定浓度，并各自进行混合搅匀，调节pH值。

本申请还提供一种肌酸激酶同工酶活性的测定方法，其测试条件如下：

温度为37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长400～480nm，副波长700nm。

应用本申请的肌酸激酶同工酶测定试剂盒测定样本中肌酸激酶的同工酶(CK-MB)活性的方法如下：

步骤S10，准备肌酸激酶同工酶的样本；

步骤S20，将试剂盒中的第一试剂加入样本中混合均匀，并在37℃孵育5min，获得混合样本；

步骤S30，将试剂盒中的第二试剂加入孵育后的样品中混合均匀，延迟1.5min，获得待测样本；

步骤S40，在检测仪的测定波长下，连续监测待测样品2～3min吸光度变化率，通过计算吸光度变化率获得肌酸激酶同工酶活性。

在本实施例中，准备12μL肌酸激酶同工酶的样本放入样品管，同时准备校准管和空白管，其中，校准管以校准品作为样品，空白管以纯化水作为样品。将160μL第一试剂R1分别加入样品管、校准管和空白管中混匀，37℃孵育5min后，往样品管、校准管和空白管中分别加入40μL第二试剂R2混匀，延迟1.5min，在检测仪的测定波长下，连续监测2～3min吸光度变化率，并计算出吸光度变化率△A/min，通过计算出的吸光度变化率得到肌酸激酶同工酶活性。

本申请的试剂盒测定样品中肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性按以下公式进行计算：

其中，ΔA

需要说明，本申请试剂盒适用于日立7600/7180、迈瑞BS800、迪瑞CS600、东芝TBA40FR、奥林巴斯AU2700、贝克曼680/5800、西门子ADVIA2400、罗氏P800等全自动生化分析仪。

实施例1

本实施例按照下列表2中各组分和浓度配制第一试剂R1和第二试剂R2。

表2第一试剂R1、第二试剂R2的组分及浓度表

上述试剂的配制方法为常规方法，即试剂所述组分分别加入纯化水后各自混合搅匀，并调节pH即可。

实施例2

本实施例按照下列表3中的各组分和浓度配制第一试剂R1和第二试剂R2。

表3第一试剂R1、第二试剂R2的组分及浓度表

上述试剂的配制方法为常规方法，即试剂所述组分分别加入纯化水后各自混合搅匀，并调节pH即可。

本申请还设置一组对照例，按照下列表4的各组分和浓度配制对照例的试剂R1和试剂R2。

表4第一试剂R1、第二试剂R2的组分及浓度表

对照例试剂盒成分相对实施例1黄递酶和四唑盐，制备方法同实施例1。

上述实施例1和实施例2的测定方法如下：

温度为37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长450nm，副波长700nm。

准备12μL肌酸激酶同工酶的样品放入样品管，同时准备校准管和空白管，其中，校准管以校准品作为样品，空白管以纯化水作为样品。将160μL第一试剂R1分别加入样品管、校准管和空白管中混匀，37℃孵育5min后，往样品管、校准管和空白管中分别加入40μL第二试剂R2混匀，延迟1.5min，在测定波长下，连续监测2～3min吸光度变化率，并计算出吸光度变化率ΔA/min。

对照例的测定参数：温度为37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长340nm，副波长700nm，准备样品管，放入12μL样品，并准备校准管和空白管，其中，校准管以校准品作为样品，空白管以纯化水作为样品，将160μL试剂R1分别加入样品管、校准管和空白管混匀，37℃孵育5min后，加入40μL试剂R2混匀，延迟1.5min，在测定波长下，连续监测2～3min吸光度变化率，计算△A/min。

实施例1～2与对照例上机参数样本量与试剂量相同。

按照上述测定设置，在日立7180全自动生化分析仪上进行测定，记录40例临床样本的△A/min值，结果如表5所示。

表5实施例1～2和对照例40例临床样本△A/min值

以上结果表明实施例1和2测定△A/min值是分别是对照例的3倍、4倍以上，肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性测定灵敏度得到显著提高。

综上，本申请的测定肌酸激酶同工酶活性的试剂盒，通过在特定波长测定甲臜生成速率可间接反映肌酸激酶的同工酶活性，相比现有的测定方法，测试灵敏度较高3～4倍以上。

显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。