防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于对虾养殖和中草药制剂技术领域，尤其涉及一种防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂及其制备方法。

背景技术

对虾适应能力较强、生长速度快、肉质鲜美、出肉率高、离水存活时间长，适温范围广，可在18～32℃生长，适盐范围也广，可在盐度1～40‰条件下生长，是一种优良的淡化养殖品种，现已逐渐成为我国南方的主要养殖虾种，是我国发展速度最快，养殖产量最高的甲壳类养殖品种。

由于对虾的器官结构简单，易受到细菌、病毒、环境突然改变等多种因素的侵袭，引起一系列疾病的产生，给养殖户造成重大经济损失。其中，细菌性疾病以副溶血弧菌为主要病原，它是造成对虾早期死亡综合征、对虾急性肝胰腺坏死综合征的病原体。因此，副溶血弧菌感染对虾的防治显得尤为重要。以往，对虾养殖中防治病害常见的做法是使用抗生素，但长期添加抗生素不仅会通过食物链富集，危害人类的健康，也破坏了水产养殖环境中的微生物结构，甚至使病原体产生耐药性。中草药制剂具有无毒、副作用小、不易引起病原产生耐药性的特点，是一种可持续发展的防治病害产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种疗效良好、安全可靠且无毒副作用、不易引起耐药性的防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

中草药复方在制备防治对虾副溶血弧菌病药物中的应用，中草药复方主要由黄芩、连翘、大黄和黄药子组成。

中草药复方是由黄芩、连翘、大黄和黄药子按2～5:2～4:2～5:2～4配比经水提醇沉法制得的提取物。

防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂，包括由黄芩、连翘、大黄和黄药子按2～5:2～4:2～5:2～4配比经水提醇沉法制得的提取物。

提取物中黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别达到7.34mg/mL、3.39mg/mL和32.90μg/mL。

上述防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂的制备方法，采用水提法提取，经旋转蒸发浓缩后醇沉，即得。

上述防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂的制备方法，按配比称取黄芩、连翘、大黄和黄药子，加入蒸馏水充分浸泡，水浴；过滤，滤液离心，取上清液于旋转蒸发浓缩；加入95％食品级乙醇，醇沉过夜，取上清液，旋转蒸发浓缩，即得。

浸泡用蒸馏水量为中药材质量的10～20倍量，浸泡至少0.5h；水浴时间为0.5～1.5h，水浴后过滤，重复水浴过滤操作三次，收集滤液。

离心为将三次滤液混合后，离心30分钟，转速为3000转/分钟。

醇沉中乙醇的浓度为60％～80％，醇沉过夜为常温下静置24h。

旋转蒸发浓缩至上清液为总滤液体积的1/30。

针对对虾易感染副溶血弧菌疾病的问题，发明人研制了一种中草药复方，主要由黄芩、连翘、大黄和黄药子组成。据此，发明人制备了相关中草药复方制剂并建立了相应工艺，该工艺简单，成本较低，提取有效成分含量高。试验证明，该复方制剂可有效提高对虾生长性能、免疫和抗氧化功能，从而减少副溶血弧菌对对虾的胁迫作用，起到预防对虾感染副溶血弧菌，降低副溶血弧菌病危害。发明人进一步考察了不同添加量的中草药复方制剂对对虾生长指标的影响以及对其血液中非特异性免疫指标的影响，探讨其量效关系，最终确定了临床最佳给药剂量。总之，本发明原料来源天然，具有易制备、低残留、低成本、低耐药的特点，能够有效增强对虾免疫力，有效防治对虾副溶血弧菌病，从而减小感染副溶血弧菌的死亡率。

具体实施方式

一、防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂的制备

实施例1

按照处方配比(3:2:3:2.5)称取适量黄芩、连翘、大黄和黄药子等中草药，添加中药材质量的10倍量的蒸馏水将中药材浸泡0.5h，然后用100℃高温水浴0.5h，将其过滤，保留滤液。向滤渣中加相同体积的蒸馏水继续水浴，过滤后留下滤液，前面叙述的操作继续重复两次，将过滤三次获得的滤液混合，并以3000转每分的速度离心30分钟。取上清液，通过旋转蒸发仪将所取的上清液浓缩到总滤液体积的十分之一。将95％的食品级酒精倒入混合液中，使醇沉浓度达到60％，在常温的条件下存放24小时后，采用旋转蒸发仪浓缩上清液，将上清液浓缩到总滤液体积的1/30，制得中草药复方制剂。

实施例2

按照处方配比(3:2.5:2.5:2)称取适量黄芩、连翘、大黄和黄药子等中草药，添加中药材质量的15倍量的蒸馏水将中药材浸泡0.5h，然后用100℃高温水浴1h，将其过滤，保留滤液。向滤渣中加相同体积的蒸馏水继续水浴，过滤后留下滤液，前面叙述的操作继续重复两次，将过滤三次获得的滤液混合，并以3000转每分中的速度离心30分钟。取上清液，通过旋转蒸发仪将所取的上清液浓缩到总滤液体积的十分之一。将95％的食品级酒精倒入混合液中，使醇沉浓度达到70％，在常温的条件下存放24小时后，采用旋转蒸发仪浓缩上清液，将上清液浓缩到总滤液体积的1/30，制得中草药复方制剂。

实施例3

按照处方配比(3:2.5:2:2)称取适量黄芩、连翘、大黄和黄药子等中草药，添加中药材质量的20倍量的蒸馏水将中药材浸泡0.5h，然后用100℃高温水浴1.5h，将其过滤，保留滤液。向滤渣中加相同体积的蒸馏水继续水浴，过滤后留下滤液，前面叙述的操作继续重复两次，将过滤三次获得的滤液混合，并以3000转每分中的速度离心30分钟。取上清液，通过旋转蒸发仪将所取的上清液浓缩到总滤液体积的十分之一。将95％的食品级酒精倒入混合液中，使醇沉浓度达到80％，在常温的条件下存放24小时后，采用旋转蒸发仪浓缩上清液，将上清液浓缩到总滤液体积的1/30，制得中草药复方制剂。

经检测，实施例所得复方制剂中的主要有效成分黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别达到7.34mg/mL、3.39mg/mL和32.90μg/mL。

二、防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂的使用方法

将实施例制得的中草药复方制剂按照药物饲料比10mL/kg、20mL/kg、40mL/kg、60mL/kg、80mL/kg及100mL/kg，在药物中加入0.2％的饲料粘合剂，混合均匀，与饲料混合，充分搅拌，自然阴干，备用。将中草药复方制剂添加饲料每日按对虾体重的0.2％投料，每天投喂4次，试验期为35d，试验期间，每4d进行一次排换水，饲养期间不断充氧，溶氧≥6mg/L，水温为27～29℃，pH为8.0±0.2，自然光照。

三、中草药复方制剂预防南美白对虾副溶血弧菌感染的剂量筛选试验

方法：将适应性饲养后的南美白对虾随机分为8组，即空白对照组、感染对照组、10mL/kg、20mL/kg、40mL/kg、60mL/kg、80mL/kg及100mL/kg的含药饲料试验组，每组100尾，设3个重复，除空白对照组和感染对照组投喂不含任何药物的基础料外，其余各组分别投喂相应剂量的含该中草药复方制剂的饲料，每天投喂4次(分别8：00、12：00、16:00、20:00进行投喂)每次投喂量为南美白对虾总体重2％，投喂后0.5～1h观察摄食剩料情况，并随时根据南美白对虾的摄食和生长情况调整饲料的投喂量，连续给药35d后进行生化指标、脏器指数、免疫指标的测定。将每组每个重复随机选取40尾对虾，空腹24h后于第三腹节处肌肉注射0.1mL3*10

结果(见表1至表3)：与空白对照组相比，20mL/kg、40mL/kg、60mL/kg三个剂量组的对虾体长显著增长(P<0.05)；20mL/kg、60mL/kg、100mL/kg三个剂量的中草药复方制剂能够显著提高对虾体重(P<0.05)，80mL/kg、100mL/kg两个剂量组肝胰腺显著增重(P<0.05)，10mL/kg、20mL/kg、60mL/kg、100mL/kg剂量组的增重率显著增高(P<0.05)，20mL/kg剂量组的增长率显著增高(P<0.05)，40mL/kg、60mL/kg、80mL/kg、100mL/kg剂量组的肝体比显著增大(P<0.05)。中草药复方制剂剂量组与空白对照组相比，能够显著提高虾血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化能力(P<0.05)，其中20mL/kg剂量组的免疫指标远高于其他组。在副溶血弧菌急性胁迫下，20mL/kg、40mL/kg、60mL/kg、80mL/kg剂量的中草药复方制剂能够不同程度的减小致死率，其中以40mL/kg剂量组保护效果最佳(致死率减小到39.2％)。

中草药复方制剂中的含有黄芩苷、连翘苷和大黄素等主要有效成分，它们具有抗菌消炎、抵抗病原微生物、提高抗氧化能力、调节免疫的功效，能够有效提高南美白对虾的生长性能，增强其免疫能力和抗氧化能力，从而减小副溶血弧菌对其的急性胁迫。

结论：根据试验结果，该中草药复方制剂用于预防对虾感染副溶血弧菌的临床推荐用法用量为：混饲，对虾，每千克饲料20mL，连用35天。

表1中草药复方制剂对对虾生长性能的影响(M±SD)

注：同一列数字肩标的小写字母均有相同者表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同为差异显著(P<0.05)。

表2中草药复方制剂对对虾免疫功能的影响(M±SD)

注：同一列数字肩标的小写字母均有相同者表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同为差异显著(P<0.05)。

表3中草药复方制剂对对虾感染副溶血弧菌的预防效果