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一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用。

背景技术

随着全外显子组测序和全基因组测序在罕见遗传病领域的广泛应用，越来越多的基因内含子区域的变异被报道，但目前对于内含子区域的变异对基因剪接的影响没有系统的验证方法。近些年来，研究提示在许多疾病相关基因中位于内含子内的突变影响pre-mRNA的剪接过程。最常见的剪接突变形式是通过产生或增强剪接位点或者产生新的分支点而导致异常剪接。在特定的内含子中，突变可以创造新的剪接位点，成为新的外显子的边界，从而使新产生的外显子被包含在成熟的mRNA产物中。因此，一种准确、客观、快速地验证基因内含子变异对基因剪接影响的方法是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种可变剪接报告质粒，其是以包含E1-Intron1-E2-Intron2-E3的质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明第二方面提供了一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒，以待验证基因的内含子替代上述可变剪接报告质粒的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒。

本发明第三方面提供了一种可变剪接报告质粒的构建方法，包括如下步骤：以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明第四方面提供了一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒的构建方法，包括如下步骤：以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示；

以待验证基因的内含子替代可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒。

本发明第五方面提供了一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的方法，包括如下步骤：

1)以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示；

2)以待验证基因的内含子替代可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒；

3)以minigene质粒转染细胞，后通过荧光显微镜观察转染的细胞是否表达完整的荧光蛋白，有荧光表明待验证基因的内含子被正确剪接掉，若无荧光则表明待验证基因的内含子发生异常剪接；同时结合转染细胞的EGFP扩增测序进一步验证转染细胞内待验证基因的内含子是否被正确剪接。

本发明第六方面提供了上述质粒在用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响中的应用，包括如下步骤：以minigene质粒转染细胞，后通过荧光显微镜观察转染的细胞是否表达完整的荧光蛋白，有荧光表明待验证基因的内含子被正确剪接掉，若无荧光则表明待验证基因的内含子发生异常剪接；同时结合转染细胞的EGFP扩增测序进一步验证转染细胞内待验证基因的内含子是否被正确剪接。

本发明的有益效果：

本发明构建含有特殊序列Intron1和Intron2的质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，其中Intron1或Intron2可以使用待验证基因的内含子替代，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒，转染细胞后可通过荧光显微镜观察转染的细胞是否表达完整的荧光蛋白，有荧光表明待验证基因的内含子被正确剪接掉，若无荧光则表明待验证基因的内含子发生异常剪接，同时结合转染细胞的EGFP扩增测序进一步验证转染细胞内待验证基因的内含子是否被正确剪接。

本发明通过提供一种准确、客观、快速地验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及构建方法，结合细胞转染和cDNA检测，既能够在细胞水平和活体水平体现基因内含子变异对基因剪接的影响，又可以从转录水平对可变剪接实践进行检测。

附图说明

图1为EGFP中插入Intron1与Intron2示意图。

图2为EGFP中插入Intron1与Intron2扩增结果电泳凝胶照片。泳道1为以pCDNA3.1-EGFP-C为模板扩增EGFP全长，长度为728bp；泳道2为以pCDNA3.1-EGFP-AS为模板扩增EGFP全长，长度为1074bp。

图3为pCDNA3.1-EGFP-AS质粒及转染细胞cDNA扩增结果电泳凝胶照片。泳道1、2、3为以转染pCDNA3.1-EGFP-AS质粒的细胞cDNA为模板扩增EGFP全长，长度为728bp；泳道4、5、6为以pCDNA3.1-EGFP-AS质粒为模板扩增EGFP全长，长度为1074bp；泳道7为以未转染细胞cDNA为模板扩增EFGP，未扩增出条带。

图4为pCDNA3.1-EGFP-AS质粒转染细胞后的荧光显示(bar＝50μm)。A、C、E为以pCDNA3.1-EGFP-AS转染细胞明场照片，B、D、F为明场对应位置的荧光照片。

图5为人基因内含子变异对基因剪接影响的验证(bar＝50μm)。A、B为pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-wt转染细胞明场照片及对应位置荧光照片，C、D为pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-mut转染细胞明场照片及对应位置荧光照片，E、F为pCDNA3.1-EGFP-AS-ANK1-wt转染细胞明场照片及对应位置荧光照片，G、H为pCDNA3.1-EGFP-AS-AKN1-mut转染细胞明场照片及对应位置荧光照片。

图6为一代测序验证结果。A为pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-wt转染细胞cDNA为模板扩增EGFP测序结果，E1与E2正常剪接；B为pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-mut转染细胞cDNA为模板扩增EGFP测序结果，E2外显子左侧1碱基缺失；C为pCDNA3.1-EGFP-AS-ANK1-wt转染细胞cDNA为模板扩增EGFP测序结果，E1与E2正常剪接；D为pCDNA3.1-EGFP-AS-AKN1-mut转染细胞cDNA为模板扩增EGFP测序结果，E1与E2之间出现7bp的滞留。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

一种可变剪接报告质粒，以质粒pCDNA3.1-EGFP-C(Addgene收录号129020)为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，并在分段的断点处插入两段内含子序列Intron1和Intron2，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，以保证U1snRNP可以同5’剪切位点结合从而启动剪接，U2AF因子同分支位点和3’剪切位点之间的区域结合，使内含子得以形成套索结构发生剪接，并将改造后的质粒即可变剪接报告质粒命名为pCDNA3.1-EGFP-AS。

EGFP基因E1、E2、E3序列如下：

E1序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTC

E2序列如SEQ ID NO.2所示：

ATCTGTACAACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAA

E3序列如SEQ ID NO.3所示：

ACAGACTCTCCAGCAGCTCTCTGCTTTGCCCTGCAGAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

Intron1序列如SEQ ID NO.4所示：

其中，下划线部分序列依次为5’剪切位点，分支位点和3’剪切位点。

Intron2序列如SEQ ID NO.5所示：

其中，下划线部分序列依次为5’剪切位点，分支位点和3’剪切位点。

pCDNA3.1-EGFP-AS可变剪接报告质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)质粒构建策略为EGFP序列分为E1、E2、E3三段，在E1与E2之间插入Intron1，E2与E3之间插入Intron2(示意图参照图1)。

(2)设计并合成序列Intron1和Intron2。

(3)通过限制性内切酶BsrG I将E1与E2连接处切开，然后通过DNA连接酶将Intron1插入。通过一代测序确定将Intron1插入到E1与E2之间后再用限制性内切酶HPA I将E2与E3的连接处切开，然后通过DNA连接酶将Intron2插入，并进行一代测序确定将Intron2插入到E2与E3之间，得到以pCDNA3.1-EGFP-C为质粒骨架，包含E1-Intron1-E2-Intron2-E3的质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，分别以pCDNA3.1-EGFP-C和pCDNA3.1-EGFP-AS为模板扩增EGFP片段，跑琼脂糖凝胶可以看出扩增片段大小差异明显(图2)。

(4)挑选测序正确的质粒在大肠杆菌中扩繁。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，因此，本发明使用去内毒素的质粒提取试剂盒(无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)，天根生化)提取质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用核酸测定仪测定pCDNA3.1-EGFP-AS质粒的浓度和纯度，经测定，pCDNA3.1-EGFP-AS质粒的浓度为897ng/ul，OD260/280为1.83，说明质粒较纯，可用于后续的细胞转染。

脂质体lipo2000转染方法如下：

(1)细胞培养：取6cm培养皿，向其中加入约10^5个Hek293T细胞，500ul含10％FBS的DMEM培养液，于37℃、5％CO

(2)转染液制备：在无菌1.5ml EP管中制备以下两液(为转染1个培养皿细胞所用的量)：

A管：将0.8ug质粒溶于50ul Opti-MEM

B管：将2ul lipo2000(Invitrogen)溶于50ul Opti-MEM

C管：将A、B两管混合，室温放置20min。

(3)转染准备：用2ml Opti-MEM

(4)转染：把C管溶液缓缓加入培养皿中，轻轻摇匀，于37℃、5％CO

转染后培养24h，转染pCDNA3.1-EGFP-AS的细胞在荧光显微镜先观察表达绿色荧光蛋白，说明转染pCDNA3.1-EGFP-AS的细胞中目的基因完成转录后能够正确剪切拼接，继续培养至48h。

转染细胞培养48h后，经胰蛋白酶消化，离心，PBS(0.1M，PH7.4)悬浮；使用总RNA提取试剂盒提取转染细胞的RNA，进行RT-PCR，过程参照全式金公司反转录试剂盒进行，每20μL的体系中1μgRNA作为模板，按照25℃10min，42℃30min，85℃5s的程序进行反应，反转录所得的cDNA于-20℃保存。

利用RNA剪接原理在EGFP的序列上设计一对引物EGFP-F与EGFP-R，用来检测细胞转染后Intron1与Intron2是否滞留:

EGFP-F序列如SEQ ID NO.6所示:CCCTCTAGATTACTTGTAGAGCTC；

EGFP-R序列如SEQ ID NO.7所示:GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG。

以cDNA为模板，设计合成的EGFP-F与EGFP-R作为引物，分别扩增EGFP的序列，再次对剪接发生事件进行PCR鉴定。转染报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的细胞中内含子Intron1与Intron2被剪切，转染报告质粒的细胞中的内含子序列不存在，说明改造后的质粒的内含子被正确剪切掉(图3)，使用荧光显微镜对转染细胞培养48h时进行拍照，在明场下观察到细胞形态正常，在滤光片下细胞有荧光显示，这表明完整的EGFP蛋白大量表达，也意味着Intron1与Intron2在细胞体内被正确剪切(图4)。

为验证改造后的质粒可以用来验证人类基因内含子变异对基因剪接的影响，本发明验证了两个基因的内含子变异对剪接的影响：TRPC6(c.2645-1G>A)与ANK1(c.1504-9G>A)，即使用携带变异的突变型内含子序列(mut)与不携带变异的野生型内含子序列(wt)分别替代Intron1，构建质粒pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-wt与pCDNA3.1-EGFP-AS-TRPC6-mut、pCDNA3.1-EGFP-AS-ANK1-wt与pCDNA3.1-EGFP-AS-ANK1-mut。TRPC6-wt/mut、ANK1-wt/mut序列如下(下划线位置为突变位点)。然后按照上述转染方法转染Hek293T细胞后观察是否有绿色荧光产生以判定内含子变异对基因剪接的影响，并进行一代测序验证。

TRPC6内含子野生型序列(TRPC6-wt)如SEQ ID NO.8所示：

GTGAGTTGAACGCAGAAGCAAATCAGCCCCTGAATGTGAGTCAGGACGGGGGCCTAGCGCAGAGTGCCTGGAGAGCTGCAGAGATGCGTACAGGGAGAGTGAACTTCAAGGGGAAAAGTAGAACAGGATCTCACCAACCGCCGTTCTGTTAAAGAGTGGGGAACAGGCTATGTCTCCACAGGCGGGGACAGGTGCCACTTGCTAGATAAAAAGCTCTCATTCTTATGGTGGACTTGGAGGGAGGAGGAAGTGGGTGGGAAAGGCAAGGAAGGGGCTGCTGCCTCAACCCCTGAATCATTCACCACCTTTTTGTTTTAACTTACTTTAGGAGGGCTTTTGTTATCATTCTGCTATAATCTCTTCATTCACAAAAACACTTAGCTAAGAAAACAAAAACCTGCTCAATTAGGAAGTTATTTCCTTTCAAAGGATTCAAAATAAAATTGTGTGTGAAATTAGAGCTGATTTCCTCCTGTCCCACAGTCACTAGTTTTTCCGCATTGCGTATTTATAGTTGACTTCTTATCACTCTTGCTTTCAAAG

TRPC6内含子突变型序列(TRPC6-mut)如SEQ ID NO.9所示：

ANK1内含子野生型序列(ANK1-wt)如SEQ ID NO.10所示：

GTGAGTAGTGAAGGCAGGAAGGGAAGGGTTTCAGATGTGAGCAGTTCCAGCACTGTGCAGAGAACCCATCCTCATTCCAGGCGGGGCTGCAGTGCTGTGGCCTGGGGATCACTTTTCATCCTGATCAGGTCACTCTGAGCGCCCAGATTCTGCTTTGCAGGGGGTTTGAGAAGACCAGGGGTATTTCTGCATGAGAGCCACATTTCTTTAAAATAAGGAAAGTCCAAGGTGCGTGGCTGGCCTGAGTATGTCCTGGGCTAACGATGACAGTTGCCATGTAAGGAGGGGGGCAACGTTTTAAAGAAAGCATTGCCAGCAAAAATCAGGCAAGAATTACTTGATCTAAAACTGGAGAGTTCCCCCTTGCTGTAAACACATTTTGCGGGGGTTGGAGGAGTAGACAGTGAGAAGAGCTGTGGAGTTTGCCAGTTGCTCACTCGGCCAACAGCAGGCTTCCTAACCACAGGCCACGATGGGTTCTCCTTAGAGTCAGGCCTGTGATTTGTGTTTGGGGCCCTCGAGGGAAGCCTCCAGCTGGGCCCCATGAGACCTGGCCCAGGCAGCCCGACAGCAGCATTCAGAAACAGGAAGTGGGGGGGTGTGGGTGGAAAAGTCCTCATTCTCTGTCAGCAGTTGAGACTCCCCTGACCCCAGCACAGAGAAAATCAAACTAGAGTTCAAGCAGAAAGACAAGCGCATCCACTCAGAAAGGATGTGGGAGACGGATGAGCAGCCACACTGCATTGAGTGCCTTTTATGCACCAAACGCAGAAACCATGTACATTATCAGCTTGATCCCAGCTGAGCCCTAGCAAGTAGACGTTATTATTCCCATTTTACAGATGGGAGGGCTGGGCCTTTGGGAAATAAGGTAGAAATAACAGCTCACTTGAAGAACTGTTGTAAGGATTCAGTAGGATACAGCATATTGGTTCCTGTAACTCAGAGACTTGATTCGAATCCTGACTCTTCATCTTCTTAGCTGTGTGACCTTGAGAAGGTCACTTGCCCTCTCTGGGCCCTGCCTTGCTTCTCTGTAAGATGAAAAGTTGGATTTGGTAACATTAGCGTTTCTTCTTCTTTGTTTTCCCTTCGGGGTCCAG

ANK1内含子突变型序列(ANK1-mut)如SEQ ID NO.11所示：

荧光观测结果表明相较野生型，携带TRPC6(c.2645-1G>A)与ANK1(c.1504-9G>A)的突变的质粒均影响了剪接，导致不能形成完整的EGFP蛋白，从而在转染细胞里观测不到绿色荧光产生(图5)，一代测序结果则表明TRPC6(c.2645-1G>A)导致E2外显子左侧1bp缺失，而ANK1(c.1504-9G>A)导致了7bp的ANK1-intron滞留(图6)。

通过对改造后的质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的转染实验以及两例人类基因内含子变异对基因剪接影响的验证，证明本发明方法可以很好地用于验证人类基因内含子变异对基因剪接的影响。本发明方法既可以通过直观地观察转染后的细胞是否有绿色荧光产生，又可进一步对转染后细胞进行RT-PCR验证，提高了实验结果的准确性，具有推广意义。

序列表

<110> 浙江赛微思生物科技有限公司

<120> 一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213> E1(人工序列)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt c 141

<210> 2

<211> 329

<212> DNA

<213> E2(人工序列)

<400> 2

atctgtacaa ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 60

ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 120

gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 180

aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 240

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 300

agccacaacg tctatatcat ggccgacaa 329

<210> 3

<211> 258

<212> DNA

<213> E3(人工序列)

<400> 3

acagactctc cagcagctct ctgctttgcc ctgcagaaga tccgccacaa catcgaggac 60

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 120

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 180

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 240

gacgagctgt acaagtaa 258

<210> 4

<211> 187

<212> DNA

<213> Intron1(人工序列)

<400> 4

gtactgggaa cccggctggg gttggaggag gtggggcctg agtgtgggta ttggacccag 60

ggctggcaca gatagccctg cctggcactc actcttcact ttgaggtcac agggccaccc 120

aggctgttcg tgggaggtgg gaggcccaaa ggctgatgag ccggtcttac actctttccc 180

tgcccag 187

<210> 5

<211> 159

<212> DNA

<213> Intron2(人工序列)

<400> 5

gtaggcctgc tcacaccccg agtgctcgct ctcctgcgtt ggccagggtg gggttggggg 60

tggaggaaag agccggcagg catgtctacc ttggctatgc ctggaggggg ccgaggctgg 120

tgaagcagcc ttcagtgagg acaaactgtt ctcccacag 159

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> EGFP-F(人工序列)

<400> 6

ccctctagat tacttgtaga gctc 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> EGFP-R(人工序列)

<400> 7

gggagaccca agctggctag cg 22

<210> 8

<211> 543

<212> DNA

<213> TRPC6-wt(人工序列)

<400> 8

gtgagttgaa cgcagaagca aatcagcccc tgaatgtgag tcaggacggg ggcctagcgc 60

agagtgcctg gagagctgca gagatgcgta cagggagagt gaacttcaag gggaaaagta 120

gaacaggatc tcaccaaccg ccgttctgtt aaagagtggg gaacaggcta tgtctccaca 180

ggcggggaca ggtgccactt gctagataaa aagctctcat tcttatggtg gacttggagg 240

gaggaggaag tgggtgggaa aggcaaggaa ggggctgctg cctcaacccc tgaatcattc 300

accacctttt tgttttaact tactttagga gggcttttgt tatcattctg ctataatctc 360

ttcattcaca aaaacactta gctaagaaaa caaaaacctg ctcaattagg aagttatttc 420

ctttcaaagg attcaaaata aaattgtgtg tgaaattaga gctgatttcc tcctgtccca 480

cagtcactag tttttccgca ttgcgtattt atagttgact tcttatcact cttgctttca 540

aag 543

<210> 9

<211> 543

<212> DNA

<213> TRPC6-mut(人工序列)

<400> 9