一种葛根提取物在制备调节肠道菌群、降血脂的药物或保健品中的应用
文献发布时间:2023-06-19 13:48:08
技术领域
本发明属于疾病治疗药物技术领域,特别涉及葛根提取物在制备调节肠道菌群的药物或保健品中的应用,尤其是在调节道菌比例、增加肠道短链脂肪酸产量、降血脂的药物或保健食品中的应用。
背景技术
高脂血症(Hyperlipidemia,HLP)是一种脂质代谢紊乱性疾病,以血液中血脂变化为主,包括总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)和低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的异常增多,高密度脂蛋白胆固醇 (High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的缺乏。HLP可由饮食失调、过度安逸、吸烟、药物、遗传性疾病(如家族性高胆固醇血症) 等引起。HLP知晓率低,容易被漏诊或误诊,随着疾病进展,可导致多种并发症,是诱发动脉粥样硬化的重大危险因素,血清中TC水平更是与心血管疾病直接相关。近年来,亚洲国家人群血清中TC水平一直在上升,中国人群最为严重,随着我国经济的发展,HLP患病率快速上升,我国成人血脂异常患病率达40.40%。因此,如何有效的干预HLP的发生发展成为人类面临的重大医学问题。
HLP的治疗包括药物治疗及其他疗法。其他疗法如调节饮食、戒烟、运动等也可以降低血脂水平,但是需要长时间的坚持,大多数人很难做到。他汀类、烟酸类、贝特类等是目前临床常用降脂药物,疗效明显,但可能会导致肝损伤、横纹肌溶解等。HLP病因复杂,其作用机制主要包括氧化损伤、炎症、和脂质浸润等。近年来,肠道菌群在脂质代谢过程中的作用日益得到重视,高脂饮食诱导的肠道菌群及其代谢产物(脂多糖等)可以进入循环系统,引起机体慢性代谢性炎症,加重脂质沉积。因此,研究开发安全有效的个性化治疗药物是必不可少的。
发明内容
本发明的目的是提供葛根提取物在制备调节肠道菌群的药物中的应用。所述葛根提取物可以制成各种制剂,包括:栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液等。
进一步的,葛根提取物通过干预肠道菌群的丰度及多样性,可以减少Tyzzerella、Anaerotruncus、staphylococcus、Enterococcus、 Negativibacillus、Oscillibacter和Sphingomona菌属丰度(P<0.05), Roseburia、Blautia和Erysipelatoclostridium菌属丰度呈下降趋势,增加Dubosiella、Muribaculum、Paraprevotella和Peptococcus菌属丰度(P<0.05)。
进一步的,所述葛根提取物的使用剂量为50~200mg/kg/d, 200mg/kg/d剂量降低血清血脂水平效果最佳。
本发明的目的还在于提供葛根提取物在制备促进肠道短链脂肪酸产生的药物或保健品中的应用。
进一步的,所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸中的至少一种。
本发明的目的还在于提供葛根提取物在制备降血脂的药物或保健品中的应用。
本发明的技术原理:葛根提取物能够明显减少Tyzzerella、 Anaerotruncus、staphylococcus、Enterococcus、Negativibacillus、 Oscillibacter和Sphingomona菌属丰度(P<0.05),Roseburia、Blautia 和Erysipelatoclostridium菌属丰度呈下降趋势,增加Dubosiella、 Muribaculum、Paraprevotella和Peptococcus菌属丰度(P<0.05),增加乙酸、丁酸和异丁酸含量,葛根提取物通过干预肠道菌群的丰度及多样性、增加短链脂肪酸的含量调节血脂水平,进一步调节高脂血症,且通过抗生素清除小鼠肠道菌群后再复制高脂血症小鼠模型并进行药物干预,药效减弱,目前无人报道,为治疗HLP提供新的治疗药物选择和机制。
本发明产生的有益效果:研究发现在高脂血症(HLP)中,葛根提取物50、100、200mg/kg/d能够缓解HLP,且200mg/kg/d剂量效果最佳;因此我们进一步选用200mg/kg/d治疗剂量进行分子机制探索。本发明为治疗高脂血症提供新的治疗药物选择,相对于目前临床治疗高脂血症的药物,本实验选用药物药食同源,价格低廉,易于推广、接受。
附图说明
图1为葛根提取物治疗高脂血症的疗效实验步骤图;
图2为含清菌实验的葛根提取物治疗高脂血症的疗效实验步骤图;
图3为葛根提取物干预高脂血症血脂结果图;
图4为葛根提取物在门水平对肠道菌群的影响;
图5为葛根提取物干预高脂血症菌属丰度明显减少的菌群结果图;
图6为葛根提取物干预高脂血症菌属丰度呈下降趋势的菌群结果图;
图7为葛根提取物干预高脂血症菌属丰度增加的菌群结果图;
图8为葛根提取物干预高脂血症短链脂肪酸结果图;
图9为菌群清除后葛根提取物干预高脂血症血脂结果图;
图10为小鼠肝组织HE染色观察葛根对肝组织空泡样改变及炎性细胞浸润程度;
图11小鼠肝组织油红O染色观察葛根对肝组织脂质沉积的影响。(注:病理:40x、200x;生化检测:n=6);
图12为葛根提取物的总成分。
其中图3:
(A)COD-PAP法检测葛根对小鼠血清中TC含量的影响;
(B)直接法检测葛根对小鼠血清中LDL-C含量的影响;
(C)直接法检测葛根对小鼠血清中HDL-C含量事物影响;
(D)称重法检测葛根对小鼠肝体比的影响;
(E)小鼠肝组织HE染色观察葛根对肝组织空泡样改变及炎性细胞浸润程度;
(F)小鼠肝组织油红O染色观察葛根对肝组织脂质沉积的影响。(注:病理:40x、200x;生化检测:n=6)
图8:(A)代谢组学分析葛根对乙酸含量的影响;
(B)代谢组学分析葛根对丙酸含量的影响;
(C)代谢组学分析葛根对丁酸含量的影响;
(D)代谢组学分析葛根对异丁酸含量的影响。(注:n=3)
图9:(A)COD-PAP法检测葛根对小鼠血清中TC含量的影响;
(B)直接法检测葛根对小鼠血清中LDL-C含量的影响;
(C)直接法检测葛根对小鼠血清中HDL-C含量事物影响;
(D)称重法检测葛根对小鼠肝体比的影响。
图12:(A)为葛根提取物在正离子的条件下分析出的成分;
(B)为葛根提取物在负离子条件下分析出的成分。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面结合具体实施方式并参照附图,对本发明进一步详细说明。应该理解,这些描述只是示例性的,而并非要限制本发明的范围。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1:(1)造模及给药方法
雄性C57BL/6J小鼠75只,体质量18-22g,购自成都达硕实验动物有限公司(实验动物许可证编号:SYXK(滇)K2013-0007),饲养于云南中医药大学SPF级动物房,自由饮食饮水1周。按照随机数字表法将动物分为空白对照组、造模组。空白对照组给予对照饲料(10%脂肪,20%蛋白质,70%碳水化合物);造模组给予高脂饲料(38.25%脂肪,20%蛋白质,40%碳水化合物,1.25%胆固醇,0.5%胆酸钠)10 周复制HLP小鼠模型。
造模成功后按照随机数字表法将模型小鼠分为模型组和葛根提取物组。葛根提取物组灌胃给予葛根提取物(50、100、200mg/kg/ 天),空白组与模型组灌胃给予等量生理盐水,每只0.2ml。
28天后麻醉取材,南京建成试剂盒检测血清中TC、LDL-C和HDL-C 的含量;制作肝组织病理切片,通过HE染色观察小鼠肝组织炎性细胞浸润和空泡样改变,油红O染色观察肝组织脂质沉积程度;细菌 16S rRNA微生物群落多样性测序法检测小鼠肠道内容物菌群的丰度及多样性;GC-MS高通量靶标代谢组学法检测小鼠肠道内容物短链脂肪酸的含量。
实施例2:(2)清菌实验
雄性C57BL/6J小鼠90只,体质量18-22g,购自成都达硕实验动物有限公司(实验动物许可证编号:SYXK(滇)K2013-0007),饲养于 SPF级动物房,自由饮食饮水1周。按照随机数字表法将动物分为对照组和清菌组。对照组每天给予生理盐水,清菌组每天给予四联抗生素,连续灌胃21天。然后对照组分为空白对照组、模型组、葛根提取物组,清菌组分为清菌对照组、清菌模型组、清菌葛根提取物组,模型组、葛根提取物组、清菌模型组、清菌葛根提取物组高脂饲料干预10周。
造模成功后葛根提取物组、清菌葛根提取物组给予葛根提取物 (200mg/kg/天),其余组别给予等量生理盐水,每只灌胃0.2ml。
28天后麻醉取材,南京建成试剂盒检测血清中TC、LDL-C、HDL-C 水平;制作肝组织病理切片,通过HE染色观察小鼠肝组织炎性细胞浸润和空泡样改变,油红O染色观察肝组织脂质沉积情况
实施例3:(3)HE染色
先将石蜡切片在二甲苯、无水乙醇和酒精中依次脱蜡至水,再进行苏木素染色,苏木素染色结束后先脱水再进行伊红染色5min,最后依次在无水乙醇、正丁醇、二甲苯等中脱水,晾干封片后显微镜下进行图像采集并分析。
实施例4:(4)油红O染色
将冰冻切片复温干燥后进行固定晾干,然后在油红染液中浸泡 8-10min(避光),用75%酒精分化,ddH
实施例5:(5)COD-PAP法检测血清中TC含量
操作步骤如表所示:
血清TC检测操作方法
血清样本计算公式:
总胆固醇含量(mmol/L)=(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值 -空白OD值)x标准品浓度
实施例6:(6)直接法检测小鼠血清中LDL-C和HDL-C含量操作步骤如表所示:
血清LDL-C检测操作方法
血清HDL-C检测操作方法
血清样本计算公式:
LDL-C/HDL-C含量(mmol/L)=((样本A2-样本A1)-(空白A2-空白A1))/((标准A2-标准A1)-(空白A2-空白A1))x标准品浓度
实施例7:(7)16Sr RNA检测小鼠肠道菌群
提取肠道内容物中菌群的基因组进行扩增,然后再进行PCR定量和鉴定,文库制备和测序,最终分析结果。
细菌16S rRNA微生物群落多样性测序法检测小鼠肠道内容物菌群的丰度及多样性实验委托上海百趣生物医学科技有限公司完成。
实施例8:(8)GC-MS靶标代谢组学检测小鼠肠道内容物短链脂肪酸含量
1)样本预处理
①取样本25mg于2mL EP管中,加入ddH
②样本4℃、5000rpm离心20min;吸取0.3mL上清液移入新EP管中,加入0.5mLddH
③40Hz研磨4min,超声5min;4℃、5000rpm离心20min;
④移取0.5mL上清液与步骤②上清液合并,加入0.1mL 50%H
⑤4℃离心、10000rpm离心15min;-20℃静置30min;GC-MS检测。
2)上机检测
Agilent 7890气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP-FFAP毛细管柱, GC-MS具体分析条件如下:
表19仪器参数
3)标准曲线
根据分析结果绘制标准曲线,并计算每种短链脂肪酸具体含量。
计算公式:
C(con):样本中目标化合物的含量,mg/kg;
Cs:提取液中目标物浓度,mg/L;
V1:加入内标溶液体积,mL;
V2:取出纯水上清液体积,mL;
V3:加入纯水体积,mL;
M:称样量,mg。
按照以上实验流程,验证葛根提取物对HLP的疗效,如图1~5 所示。根据上述实验,筛选出最佳疗效剂量,葛根提取物最佳剂量为200mg/kg;因此,本实验选用200mg/kg葛根黄酮,明确其对肠道菌群及其代谢物的干预效果。
本实验创新性的发现,葛根提取物50、100、200mg/kg对高脂血症小鼠进行干预,结果显示200mg/kg剂量降低血清血脂水平效果最佳,因此接下来我们对200mg/kg浓度的葛根提取物进行分子机制探索,明确其具体作用机制。葛根提取物通过干预肠道菌群的丰度及多样性、增加短链脂肪酸的含量调节血脂水平,进一步调节高脂血症,且通过抗生素清除小鼠肠道菌群后再复制高脂血症小鼠模型并进行药物干预,药效减弱,目前无人报道,为治疗HLP提供新的治疗药物选择和机制。
实施例9:葛根冻干固体饮料制备:
(1)将葛根洗净晒干、破碎成1cm x 1cm大小,放入冻干机中,在加热温度80℃、真空度100pa的条件下进行干燥,冻干12h后取出,用粉碎机粉碎后得到葛根全粉。
(2)将葛根提取物与乳糖和麦芽糊精过140~160目筛,放入容器中搅拌混匀;
(3)使用乙醇溶液作为粘合剂制备湿料;
(4)把制好的湿料过筛制备成湿颗粒,然后在鼓风干燥箱内干燥,干燥结束后取出,筛整粒,装袋成品。
实施例10:葛根提取物制备:
(1)将葛根晒干、破碎成1cm x 1cm大小,装入纱带中,加15倍量70%~80%乙醇溶液,常温下提取4-5次,每次2-3小时;
(2)离心,过滤,收集上清液;
(3)于旋转蒸发仪中提取,将药液减压浓缩至药液比1:6;
(4)将浓缩液在大孔树脂中水洗2倍柱体积去除杂质,然后分别用 50℃~70℃、10%~25%乙醇洗脱并收集洗脱液。
(5)用纳滤膜分离洗脱液并收集;
(6)将过滤液浓缩至药液比为4:1,4℃静置析晶,晶体加入5倍纯净水,加热溶解,4℃静置析晶,重复2~4次;
(7)将晶体干燥后,即得葛根提取物。
实施例11:UHPLC-QTOF-MS非靶标代谢组学分析葛根提取物中活性成分
(1)称取20mg样本,加入500μL提取液,涡旋混匀后加入钢珠研磨,冰水浴超声后重复研磨,静置1h后4℃、12000rpm离心 15min,取上清真空干燥;加入50%乙腈混匀,冰水浴超声10min; 4℃、13000rpm离心15min;上机检测。
(2)使用超高效液相色谱仪通过液相色谱柱对葛根提取物进行色谱分离。使用Triple TOF 6600高分辨质谱,通过IDA (information-dependent acquisition)模式进行高分辨质谱数据采集。在IDA这种模式下,数据采集软件(Analyst TF 1.7,AB Sciex)依据一级质谱数据和预先设定的标准采集数据,然后进行物质鉴定。如图 12所示。
葛根提取物主要活性成分如下表所示。
应当理解的是,本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理,而不构成对本发明的限制。因此,在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。此外,本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
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