一种酸枣仁多糖提取物的提取方法

技术领域

本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种酸枣仁多糖提取物的提取方法。

背景技术

多糖是由至少10个以上的单糖由糖苷键结合组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C

酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，秋季果实成熟时采收，将果实浸泡一宿，搓去果肉，捞出，用石碾碾碎果核，取出种子，晒干。酸枣仁味甘，性平，具宁心安神、养肝、敛汗生津之功效。主治虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴，是一种常用中药。酸枣仁主要含有黄酮和皂苷等镇静催眠有效成分，临床上酸枣仁主要以生品和炒制品入药。

酸枣仁除了多糖，还含脂肪油、蛋白质等，故从酸枣仁中提取多糖成分时，最重要的就是分离脂肪油和蛋白质等，以免影响多糖纯度，对多糖的进一步利用产生阻碍。

专利申请CN107674127A公开了酸枣仁多糖的制备方法，先将酸枣仁药材干燥粉末并加溶剂石油醚或乙醚于反应容器中，70℃-90℃加热回流两次，每次1-2h，脱去脂肪类物质，过滤，残渣烘干；取上述残渣质量百分含量为70％乙醇水溶液回流提取2h，除去黄酮、皂苷等杂质，过滤，滤渣烘干备用；然后将滤渣固体加入纯水，在40-70℃，180-240W下超声辅助提取30-50min，过滤，滤液备用；最后将滤液减压浓缩，得浓缩液；在浓缩液中加入质量浓度95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，然后用丙酮洗涤多次并边洗涤边搅拌，干燥，得到黄褐色酸枣仁粗多糖。该专利申请对酸枣仁中多糖的提取率低，所得多糖纯度低，且存在生产放大效应，限制了大规模生产应用。

该专利申请公开了酸枣仁多糖可用于抗肿瘤治疗，申请人发现酸枣仁多糖提取物的纯度直接关系到抗肿瘤效果，故提高酸枣仁多糖提取物的纯度对于未来的临床应用具有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，提取率高，且所得多糖的纯度高，品质好，适合大规模生产。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，具体步骤如下：

(1)先将酸枣仁粉碎成80～100目的酸枣仁粉末并加入水中，微波萃取，减压浓缩，转移至喷雾干燥塔中干燥，得到酸枣仁粉末；

(2)接着利用超临界CO

(3)将步骤(2)脱脂的酸枣仁粉末加入水中，微波提取，离心取上清，得到提取液，继续向提取液加入蛋白酶酶解，灭酶，浓缩至提取液原体积的1/4～1/3，得到酶解液，利用Sevag法除去酶解液中的大部分蛋白质，得到脱脂脱蛋白提取液，醇沉，即得酸枣仁粗多糖；

(4)然后将步骤(3)所制备的酸枣仁粗多糖加入水中，搅拌均匀，加入氟修饰磁性微球，超声波分散均匀，再加入无水乙醇，振摇1～2分钟，析出沉淀并使用磁铁吸附分离，接着将这些沉淀超声波分散于水中，磁铁吸附除去磁性微球，喷雾干燥，即得酸枣仁多糖提取物。

优选的，酸枣仁粉末、蛋白酶、氟修饰磁性微球的质量比为3～4：0.2～0.3：0.02～0.03。

进一步优选的，所述蛋白酶是将中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照质量比3：1均匀混合而得。

优选的，步骤(1)中，微波萃取的工艺条件为：300～400W微波萃取5～10分钟。

优选的，步骤(1)中，超音速射流的工艺条件为：40～50℃，0.05～0.07MPa，速度800～900m/s。

优选的，步骤(2)中，超临界CO

优选的，步骤(3)中，微波提取的工艺条件为：300～400W微波提取25～30分钟。

优选的，步骤(3)中，酶解的工艺条件为：55～60℃酶解3～4小时。

优选的，步骤(3)中，Sevag法的具体方法为：向酶解液中加入等体积的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清，即为所述的脱脂脱蛋白提取液；其中，Sevag试剂是将三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：1混匀而得。

优选的，步骤(3)中，醇沉的具体方法为：向脱脂脱蛋白提取液中加入其3～4倍体积的体积分数90～95％乙醇水溶液，0～4℃静置12～15小时，离心取沉淀即可。

优选的，步骤(4)中，以重量份计，所述氟修饰磁性微球的制备方法如下：

(A)先将1份纳米四氧化三铁加入30～40份0.2～0.3mol/L柠檬酸钠溶液中，300～400W超声波分散40～50分钟，磁分离，得到柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁；

(B)再将柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁超声分散于4～5份水中，倒入25～30份液态硅酸钠中，搅拌混匀，得到水相；接着将1.5～2份OP-10、5～6份司盘-80加入55～60份二氯甲烷中，搅拌混匀，得到油相；边搅拌边将水相缓慢滴入油相中，得到乳液，边搅拌边将乳液缓慢滴入2～3mol/L硫酸铵水溶液中，400～500r/min搅拌2～3小时，磁吸出固体物质，并用水洗涤2～3次，得到磁性微球；

(C)最后将磁性微球超声分散于35～45份体积浓度70～80％乙醇溶液中，继续加入0.2～0.3份全氟癸基三甲氧基硅烷，加热至回流，保温搅拌4～5小时，磁吸出固体物质，无水乙醇洗涤，干燥，即得。

本发明还要求保护利用上述提取方法得到的一种酸枣仁多糖提取物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用超临界CO

(2)本发明采用蛋白酶和Sevag法结合除去大部分蛋白质，先蛋白酶酶解可以将提取液汇总含有的大分子蛋白质进行降解，减少对多糖成分的缠绕、包裹，促使多糖游离出来，结合Sevag法即可除去大部分蛋白质，在此之后醇沉，大大减少了蛋白质成分在多糖表面的黏附，提高多糖纯度。

(3)本发明酸枣仁粗多糖利用氟修饰磁性微球进行进一步纯化处理，氟修饰磁性微球具有磁性，可以方便地通过磁铁分离除去，操作简单。磁性微球表面经氟修饰，在多糖醇沉过程中包裹在氟修饰磁性微球表面，可能是因为氟与多糖的羟基形成的氢键作用更强，避免了体系中残留少量蛋白质随多糖醇沉，从而实现多糖纯化，获得高纯度多糖。申请人还尝试用环氧基、硅羟基替代氟对磁性微球进行表面修饰，结果发现所得多糖纯度均不如氟修饰磁性微球纯化所得多糖纯度，这可能是因为，与环氧基、硅羟基相比，氟与多糖之间的氢键作用更强，更有利于多糖与蛋白质的分离。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中氟修饰磁性微球的制备具体步骤如下：

(A)先将10g纳米四氧化三铁加入300～400g 0.2～0.3mol/L柠檬酸钠溶液中，400W超声波分散45分钟，磁分离，得到柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁；

(B)再将柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁超声分散于50g水中，倒入300g液态硅酸钠中，搅拌混匀，得到水相；接着将20g OP-10、60g司盘-80加入600g二氯甲烷中，搅拌混匀，得到油相；边搅拌边将水相缓慢滴入油相中，得到乳液，边搅拌边将乳液缓慢滴入2.5mol/L硫酸铵水溶液中，500r/min搅拌3小时，磁吸出固体物质，并用水洗涤3次，得到磁性微球；

(C)最后将磁性微球超声分散于400g体积浓度70％乙醇溶液中，继续加入2.5g全氟癸基三甲氧基硅烷，加热至回流，保温搅拌4小时，磁吸出固体物质，无水乙醇洗涤，干燥，即得。

实施例1

一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，具体步骤如下：

(1)先将3g酸枣仁粉碎成80目的酸枣仁粉末并加入30g水中，300W微波萃取5分钟，减压浓缩，转移至喷雾干燥塔中干燥，得到酸枣仁粉末；

(2)接着利用超临界CO

(3)再将脱脂酸枣仁粉末加入28g水中，300W微波提取25分钟，离心取上清，得到提取液，继续向提取液加入0.2g蛋白酶(中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照质量比3：1均匀混合而得)，55℃酶解3小时，灭酶，浓缩至提取液原体积的1/4，得到酶解液，利用Sevag法除去酶解液中的大部分蛋白质，得到脱脂脱蛋白提取液，醇沉，即得酸枣仁粗多糖；

(4)然后将酸枣仁粗多糖加入20g水中，搅拌均匀，加入0.02g氟修饰磁性微球，超声波分散均匀，再加入20g无水乙醇，振摇1分钟，析出沉淀并使用磁铁吸附分离，接着将这些沉淀超声波分散于30g水中，磁铁吸附除去磁性微球，喷雾干燥，即得酸枣仁多糖提取物。

步骤(2)中，超临界CO

步骤(3)中，Sevag法的具体方法为：向酶解液中加入等体积的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清，即为所述的脱脂脱蛋白提取液；其中，Sevag试剂是将三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：1混匀而得。

步骤(3)中，醇沉的具体方法为：向脱脂脱蛋白提取液中加入其3倍体积的体积分数90％乙醇水溶液，0℃静置12小时，离心取沉淀即可。

实施例2

一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，具体步骤如下：

(1)先将4g酸枣仁粉碎成100目的酸枣仁粉末并加入35g水中，400W微波萃取10分钟，减压浓缩，转移至喷雾干燥塔中干燥，得到酸枣仁粉末；

(2)接着利用超临界CO

(3)再将脱脂酸枣仁粉末加入30g水中，400W微波提取30分钟，离心取上清，得到提取液，继续向提取液加入0.3g蛋白酶(中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照质量比3：1均匀混合而得)，60℃酶解4小时，灭酶，浓缩至提取液原体积的1/3，得到酶解液，利用Sevag法除去酶解液中的大部分蛋白质，得到脱脂脱蛋白提取液，醇沉，即得酸枣仁粗多糖；

(4)然后将酸枣仁粗多糖加入25g水中，搅拌均匀，加入0.03g氟修饰磁性微球(参考实施例)，超声波分散均匀，再加入25g无水乙醇，振摇2分钟，析出沉淀并使用磁铁吸附分离，接着将这些沉淀超声波分散于35g水中，磁铁吸附除去磁性微球，喷雾干燥，即得酸枣仁多糖提取物。

步骤(2)中，超临界CO

步骤(3)中，Sevag法的具体方法为：向酶解液中加入等体积的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清，即为所述的脱脂脱蛋白提取液；其中，Sevag试剂是将三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：1混匀而得。

步骤(3)中，醇沉的具体方法为：向脱脂脱蛋白提取液中加入其4倍体积的体积分数95％乙醇水溶液，4℃静置15小时，离心取沉淀即可。

实施例3

一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，具体步骤如下：

(1)先将3.5g酸枣仁粉碎成90目的酸枣仁粉末并加入33g水中，400W微波萃取8分钟，减压浓缩，转移至喷雾干燥塔中干燥，得到酸枣仁粉末；

(2)接着利用超临界CO

(3)再将脱脂酸枣仁粉末加入29g中，400W微波提取28分钟，离心取上清，得到提取液，继续向提取液加入0.25g蛋白酶(中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照质量比3：1均匀混合而得)，58℃酶解3.5小时，灭酶，浓缩至提取液原体积的1/4，得到酶解液，利用Sevag法除去酶解液中的大部分蛋白质，得到脱脂脱蛋白提取液，醇沉，即得酸枣仁粗多糖；

(4)然后将酸枣仁粗多糖加入22g水中，搅拌均匀，加入0.025g氟修饰磁性微球(参考实施例)，超声波分散均匀，再加入23g无水乙醇，振摇2分钟，析出沉淀并使用磁铁吸附分离，接着将这些沉淀超声波分散于34g水中，磁铁吸附除去磁性微球，喷雾干燥，即得酸枣仁多糖提取物。

步骤(2)中，超临界CO

步骤(3)中，Sevag法的具体方法为：向酶解液中加入等体积的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清，即为所述的脱脂脱蛋白提取液；其中，Sevag试剂是将三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：1混匀而得。

步骤(3)中，醇沉的具体方法为：向脱脂脱蛋白提取液中加入其3.5倍体积的体积分数93％乙醇水溶液，2℃静置13小时，离心取沉淀即可。

对比例1

一种酸枣仁多糖提取物的提取方法，具体步骤如下：

(1)先将3g酸枣仁粉碎成80目的酸枣仁粉末并加入30g水中，300W微波萃取5分钟，减压浓缩，转移至喷雾干燥塔中干燥，得到酸枣仁粉末；

(2)接着利用超临界CO

(3)再将脱脂酸枣仁粉末加入28g水中，300W微波提取25分钟，离心取上清，得到提取液，继续向提取液加入0.2g蛋白酶(中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照质量比3：1均匀混合而得)，55℃酶解3小时，灭酶，浓缩至提取液原体积的1/4，得到酶解液，利用Sevag法除去酶解液中的大部分蛋白质，得到脱脂脱蛋白提取液，醇沉，即得酸枣仁粗多糖；

(4)然后将酸枣仁粗多糖加入20g水中，搅拌均匀，加入0.02g环氧基修饰磁性微球，超声波分散均匀，再加入20g无水乙醇，振摇1分钟，析出沉淀并使用磁铁吸附分离，接着将这些沉淀超声波分散于30g水中，磁铁吸附除去磁性微球，喷雾干燥，即得酸枣仁多糖提取物。

步骤(2)中，超临界CO

步骤(3)中，Sevag法的具体方法为：向酶解液中加入等体积的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清，即为所述的脱脂脱蛋白提取液；其中，Sevag试剂是将三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：1混匀而得。

步骤(3)中，醇沉的具体方法为：向脱脂脱蛋白提取液中加入其3倍体积的体积分数90％乙醇水溶液，0℃静置12小时，离心取沉淀即可。

步骤(4)中，环氧基修饰磁性微球的制备方法如下：

(A)先将1g纳米四氧化三铁加入30～40g 0.2～0.3mol/L柠檬酸钠溶液中，300～400W超声波分散40～50分钟，磁分离，得到柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁；

(B)再将柠檬酸钠修饰的纳米四氧化三铁超声分散于4～5g水中，倒入25～30g液态硅酸钠中，搅拌混匀，得到水相；接着将1.5～2g OP-10、5～6kg司盘-80加入55～60g二氯甲烷中，搅拌混匀，得到油相；边搅拌边将水相缓慢滴入油相中，得到乳液，边搅拌边将乳液缓慢滴入2～3mol/L硫酸铵水溶液中，400～500r/min搅拌2～3小时，磁吸出固体物质，并用水洗涤2～3次，得到磁性微球；

(C)最后将磁性微球超声分散于35～45g体积浓度70～80％乙醇溶液中，继续加入0.2～0.3gγ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，加热至回流，保温搅拌4～5小时，磁吸出固体物质，无水乙醇洗涤，干燥，即得。

测定实施例1～3及对比例1的提取率(以酸枣仁粉末重量计)，并采用《中国药典》2015版多糖测定方法采用苯酚-硫酸法计算所得酸枣仁多糖提取物中多糖含量。结果见表1。

表1.多糖提取物的产率和多糖纯度

从表1可以看到，实施例1～3对酸枣仁中多糖的提取率高，多糖纯度高。

本发明通过上述实施例来说明本发明的技术构思，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品个别原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。