齐墩果酸在促进软骨细胞成软骨分化中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及齐墩果酸在促进软骨细胞成软骨分化中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，以下简称OA)，是一种最常见的风湿病，多见于中老年人，发病率随年龄增大而增高。OA最初的病变发生在软骨，由于软骨的修复能力有限破坏后无法愈合，病变在软骨组织破坏后侵犯至软骨下骨板及滑膜等关节周围组织，导致局灶性、侵蚀性软骨破坏，软骨下硬化，囊性变和代偿性骨赘形成等，慢性进行性软骨破坏是OA的主要病理特征之一，而软骨细胞又属于终末分化细胞，修复再生能力有限。因此，靶向软骨前体细胞的分化促进软骨修复再生是治疗OA的一种潜在的治疗策略。

ATDC5细胞系最早是从分化的畸胎癌干细胞系AT805中分离出来的，通常被用作体外软骨细胞研究的模型。ATDC5细胞系与软骨细胞分化有高度一致性，在普通的离体培养环境下仍可以保持未分化状态并具有很强的增殖能力，所以被视作可以模拟软骨形成的可靠细胞模型。因此，越来越多的学者采用ATDC5细胞对细胞形态、细胞活力，生长状态及软骨细胞形成机制进行研究。

骨细胞的形成从间充质细胞的凝集开始，间充质细胞经过聚集、迁移、增殖、融合等一系列的变化，最终分化为软骨祖细胞，软骨祖细胞经静息期、增殖期、肥大前期、肥大时期等四个阶段的分化最后钙化为骨。软骨细胞形成骨组织的过程中会发生基因与蛋白表达的改变、细胞形态的改变、细胞表面标志物及代谢活性的变化，在软骨细胞增殖分化的过程中蛋白及基因的表达涉及许多细胞信号通路及细胞因子的调控，例如一些转录因子(细胞核因子-cl、Runx2、Sox9、激活转录因子-4和AP-1)可以通过互相作用，调控软骨细胞标志性因子表达，在软骨细胞形成过程中起重要调控作用的信号通路(Wnt/β-catenin通路等)，转化生长因子β(TGF-β)以及可以通过作用下游靶因子影响柱状软骨细胞分化的Ihh等。

软骨细胞的分化对于骨骼形成的后续阶段是必不可少的，即Co12、IX型胶原和Aggrecan等软骨基质发生沉积。细胞发生聚集早期表达的标志性因子是核转录因子Sox9，在软骨原基基质发生沉淀之前，Sox9对于Col2al、Col11a2、CD-RAP等软骨基质蛋白的表达是最为重要的转录因子。Sox家族另外的两个成员，L-Sox5和Sox6在软骨细胞增殖分化过程中与Sox9共同发生转录，除了在HMG盒中，Sox9与L-Sox5、Sox6之间具有高度的序列同一性。L-Sox5与Sox6形成同源或异源二聚体，可以更有效地结合到HMG盒双位点上，在软骨细胞分化期间，调控Col9al、Aggrecan、FNl以及Col2al的表达。在软骨细胞凝聚过程中，Sox蛋白的表达取决于两个信号因子(BMPRlA和BMPRlB)参与的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导通路，而BMPRlA和BMPRlB在软骨膜中是不表达的。BMP信号途径主要通过异聚复合物(丝氨酸-苏氨酸激酶活性的I型受体和II型受体)进行转导，BMP与受体结合后，BMPRII使I型受体，ALK-2，BMPRIA/ALK-3和BMPRIB/ALK-6磷酸化。其他BMP介导的转录因子还包括JunB、JunB、JunD、ID和DLX家族成员。BMPs可以通过TGF-β激活蛋白激酶1，蛋白激酶1与MEKK1相互作用级联激活p38和JNK来传递信号，BMPs也可以通过激活Ras/ERKl/2/RhoA/ROCK信号通路来发送信号。p38信号通路有助于软骨细胞发生凝聚，被激活的ERKl/2与BMP-2诱导的信号通路相互作用可以调节软骨形成。

齐墩果酸(Oleanolic acid)属于五环三萜类化合物,别名士当归酸，广泛分布于女贞子中，具有较强的抗炎活性。齐墩果酸的抗炎作用已经通过大量的研究证实，可以缓解骨关节炎疾病的疼痛和炎症反应；在我们的前期研究中我们发现齐墩果酸可以通过介导MAPK、PI3K/Akt和NF-κB信号通路来抑制IL-1β诱导的人滑膜细胞(SW982)的炎症反应，但目前并没有关于齐墩果酸促进软骨细胞分化的报道。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了齐墩果酸在促进软骨细胞成软骨分化中的应用。

第一方面，本发明提供齐墩果酸在体外促进软骨细胞成软骨分化中的应用，所述齐墩果酸的CAS No.:508-02-1。

第二方面，本发明提供一种成软骨分化诱导培养基，所述培养基包括基础培养基和添加于所述基础培养基中的所述的齐墩果酸。

进一步的，所述齐墩果酸在所述基础培养基中的浓度为1nmol-10μmol。

第三方面，本发明提供一种体外诱导软骨细胞成软骨分化的方法，所述方法包括采用所述的培养基培养软骨细胞。

进一步的，所述培养的时间为3-7天。

第四方面，本发明提供所述齐墩果酸在制备治疗关节炎的药物中的应用，所述关节炎包括骨关节炎、类风湿性关节炎。

进一步的，所述药物通过促进软骨修复再生实现治疗的目的，所述促进软骨修复再生是通过促进软骨细胞成软骨分化实现。

进一步的，所述药物包含药学上可接受的载体。

本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现，齐墩果酸具有在体外促进软骨细胞成软骨分化的作用，因此，具有制备成可促进软骨细胞成软骨分化，进而促进软骨修复再生以治疗骨关节炎、类风湿性关节炎的药物的潜力。

附图说明

图1为齐墩果酸的化学结构式。

图2为不同浓度齐墩果酸对ATDC5细胞活力的影响。

图3为ATDC5细胞用含10nM齐墩果酸的培养基分别培养0、3、7天的阿尔新蓝染色图(A)茜素红染色图(B)。

图4为用含10nM齐墩果酸的培养基分别培养0、3、7天的ATDC5细胞中软骨分化标志物Sox9和CollagenⅡ的蛋白表达水平(A)、定量分析结果(B)以及mRNA表达水平(C)。

图5为用含5nM、10nM齐墩果酸的培养基培养1天的ATDC5细胞中软骨分化标志物Sox9和CollagenⅡ的蛋白表达水平(A)、定量分析结果(B)以及mRNA表达水平(C)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：齐墩果酸的化学结构及其对细胞活力的影响

齐墩果酸的化学结构如图1所示，将ATDC5细胞铺于96孔板中，待其密度生长至70％-80％时，分别加入不同浓度的齐墩果酸(1nM、10nM、100nM、1uM、10uM)继续培养24h后，使用CCK8检测对ATDC5细胞活力的影响。

结果如图2所示，与对照组(ctl，不加齐墩果酸)相比齐墩果酸(≤10uM)没有毒害作用对细胞活力没有影响，可进行后续试验。

实施例2：齐墩果酸促进ATDC5细胞成软骨分化蛋白聚糖的表达和钙沉积

取生长状态良好的ATDC5细胞铺到35mm皿中，24h后更换为含10nM齐墩果酸的完全培养基，分别培养0d，3d，7d。使用阿尔新蓝(Alcian blue)染色和茜素红(Mordant Red)染色分别检测齐墩果酸对ATDC5细胞蛋白聚糖的表达和钙沉积的影响。

阿尔新蓝染色图(图3A)和结果量化显示：与对照组相比，蛋白聚糖的表达从3天开始显著增加7天时最高，茜素红染色(图3B)和结果量化显示钙沉积有类似的趋势。这些结果显示齐墩果酸可以影响ATDC细胞的成软骨分化。

实施例3：齐墩果酸促进ATDC5细胞成软骨分化标志物的表达

取生长状态良好的ATDC5细胞铺到35mm皿中，24h后更换为含10nM齐墩果酸的完全培养基，分别培养0d，3d，7d，然后将分别提取细胞总蛋白和总RNA，使用Western blotting检测软骨分化标志物Sox9和CollagenⅡ的蛋白表达水平并定量分析，qPCR检测Sox9和Coll2a的mRNA表达水平，数据用平均值±标准差表示。统计分析采用单因素方差分析检验，n＝3；x±s.*p＜0.1，**＜0.01，***p＜0.001，与对照组比较。

Western blot结果(图4A)和灰度分析(图4B)显示，与第0天相比，软骨标志物Sox9、Coll2从第3天开始显著增加，7天时表达量最大。qRT-PCR也显示Sox9和Coll2蛋白有类似的趋势(图4C)。这些结果提示齐墩果酸可以促进ATDC5细胞成软骨分化，影响程度与齐墩果酸处理时间成正比。

取生长状态良好的ATDC5细胞铺到35mm皿中，24h后更换为含5nM、10nM齐墩果酸的完全培养基分别培养，1天后将和对照组分别提取细胞总蛋白和总RNA，使用Westernblotting检测软骨分化标志物Sox9和CollagenⅡ的蛋白表达水平并定量分析，qPCR检测Sox9和Coll2a的mRNA表达水平。

Western blot检测结果(图5A)和灰度分析(图5B)显示，与对照组相比，软骨标志物Sox9、Coll2的表达量随处理浓度增加而增加。qRT-PCR也显示Sox9和Coll2蛋白有类似的趋势(图5C)。这些结果提示齐墩果酸可以促进ATDC5细胞成软骨分化，并且和齐墩果酸的浓度成正比。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。