一种1-脱氧野尻霉素的生物合成方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种1-脱氧野尻霉素的生物合成方法。

背景技术

随着我国经济的飞速发展，膳食结构和生活方式也正发生巨变，加上人口老龄化速度的加快，使糖尿病的患病率也呈现逐年快速增加的趋势。有数据表明，糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。

根据发病机制不同，糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，后者约占糖尿病总数的85％以上。迄今为止，治疗II型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为：促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)等。由于α-GI具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，因此得到越来越多国内外研究者的青睐。

1-脱氧野尻霉素是一种较早被发现的哌啶生物碱类的α-葡萄糖苷酶抑制剂，自然界中这种物质的主要来源是植物，尤其桑叶或桑根中的含量最高，然而，植物的生长周期相对较长，因此，制备所需的时间成本较高。因此，找到一种快速，高效的1-脱氧野尻霉素的制备方法，彻底解决1-脱氧野尻霉素的来源问题是本领域技术人员亟待解决的首要问题。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一种1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin)的生物合成方法。所述1-脱氧野尻霉素为已知化合物，其结构式为

具体的，该1-脱氧野尻霉素的生物合成方法包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333于培养基中进行发酵。

优选的，所述培养基为脱脂乳淀粉培养基。

优选的，所述脱脂乳淀粉培养基包括脱脂乳粉、淀粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳淀粉培养基的质量百分比为0.5～4.5％，淀粉占脱脂乳淀粉培养基的质量百分比为0.5～4.5％，其余为水。

优选的，所述步骤还包括将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于所述培养基；更优选的，接种量为1.6x10

优选的，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。

优选的，发酵的温度为25℃～35℃。

优选的，发酵的时间为12～48h。

进一步的，发酵终止时的发酵液中1-脱氧野尻霉素的含量＞0.5mg/mL。

本发明还提供了一种1-脱氧野尻霉素或其药用盐的制备方法，所述制备包括用如上所述的1-脱氧野尻霉素的生物合成方法合成1-脱氧野尻霉素。

本发明所述1-脱氧野尻霉素或其盐可以为其各种异构体中的一种或多种的混合。

上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333发酵脱脂乳淀粉培养基方法完成1-脱氧野尻霉素的生物合成，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳淀粉培养基合成1-脱氧野尻霉素的新用途，拓宽了1-脱氧野尻霉素的来源。同时，组成简单、来源天然的培养基，令合成的1-脱氧野尻霉素具有更高的使用安全性。

附图说明

图1为1-脱氧野尻霉素的UHPLC-Q-TOF MS二级镜像匹配图。

具体实施方式

为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：

在一个具体的实施方式中，提供了一种1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin)的生物合成方法，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳淀粉培养基中进行发酵，得到了含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333发酵脱脂乳淀粉培养基的方法完成1-脱氧野尻霉素的生物合成，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳淀粉培养基合成1-脱氧野尻霉素的新用途，拓宽了1-脱氧野尻霉素的来源。同时，组成简单、来源天然的培养基，令合成的1-脱氧野尻霉素具有更高的使用安全性。

此外，生物合成所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用牛类芽孢杆菌这一种单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于合成工艺的标准化与工业大规模生产的成本控制。

优选的，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.6x10

优选的，所述脱脂乳淀粉培养基包括脱脂乳粉、淀粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳淀粉培养基的质量百分比为0.5～4.5％，淀粉占脱脂乳淀粉培养基的质量百分比为0.5～4.5％，其余为水。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉和淀粉，混匀充分后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。

优选的，优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为200rpm。

优选的，优选的发酵温度为25℃～35℃；较佳地为28℃～32℃；更佳地为30℃。

优选的，优选的发酵时间为12～48h；较佳地为18～36h；更佳地为24h。

结合对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333发酵脱脂乳淀粉培养基合成1-脱氧野尻霉素的效率明显下降了。而在优选范围之内，接种量、振荡速度、发酵温度和时间相互影响，使得牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵合成1-脱氧野尻霉素的能力更强。

发酵终止时发酵液中1-脱氧野尻霉素的含量＞0.5mg/mL。

本发明还提供了用上述生物合成方法得到的1-脱氧野尻霉素。

下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1.6x10

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：将质量百分比为1％的脱脂乳粉、4％的淀粉与蒸馏水充分混匀，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳淀粉培养基。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定：超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪法(UHPLC-Q-TOF MS)。

待测样品的制备：向适量发酵样品中加入预冷的甲醇/乙腈/水溶液(2：2：1，v/v)，涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min，14,000g 4℃离心20min，取上清真空干燥。质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14,000g、4℃离心15min，取上清液即得待测样品。

色谱条件：超高效液相色谱系统Agilent 1290Infinity LC(安捷伦公司，美国)、色谱柱ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC(waters公司，美国)、进样量2μL、柱温25℃、流速0.5mL/min、流动相A为水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B为乙腈。梯度洗脱程序如表1所示：

表1液相色谱梯度洗脱程序

质谱条件：质谱仪AB Triple TOF 6600(SCIEX公司，美国)、检测方式电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式、ESI源设置参数如下：雾化气辅助加热气1(Gas1)：60，辅助加热气2(Gas2)：60，气帘气(CUR)：30psi，离子源温度：600℃，喷雾电压(ISVF)±5500V(正负两种模式)，一级质荷比检测范围：60-1000Da，二级子离子质荷比检测范围：25-1000Da，一级质谱扫描累积时间：0.20s/spectra，二级质谱扫描累积时间0.05s/spectra，二级质谱采用数据依赖型采集模式(IDA)获得，并且采用峰强度值筛选模式，去簇电压(DP)：±60V(正负两种模式)，碰撞能量：35±15eV，IDA设置如下：动态排除同位素离子范围：4Da，每次扫描采集10个碎片图谱。

数据分析：Wiff格式的原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS软件进行分析，并与数据库内的标准物质进行二级镜像匹配，最终确定代谢物。

(d)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。

待测样品的制备：取发酵液离心(15,000g、15min)取上清，向上清中加入三倍体积的无水乙醇，再次离心(15,000g、15min)取上清，旋转蒸发去除乙醇，冷冻干燥，溶解于发酵液原体积的去离子水中，即得待测样品。

标准样品的制备：取1-脱氧野尻霉素用去离子水配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500和1000ppb 10个浓度梯度的标准样品。

色谱条件：色谱柱：Acquity uplc HSS T3 1.8um 2.1×100mm、进样量：4ul、柱温35℃、流速0.25mL/min、流动相：A为水+0.1％甲酸，B为0.1％乙腈、梯度洗脱程序见表2。

表2液相色谱梯度洗脱程序

质谱条件：离子化模式为电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)；正离子模式；扫描方式为Full-MS-ddMS 2；喷雾电压为3,500V；温度为350℃；鞘气(sheath gas flowrate):30psi；吹扫气(sweep gas flow rate):0psi；辅助气(aux gas flow rate):10psi。

数据分析：将1-脱氧野尻霉素的上述标准样品依次上样于液相色谱串联质谱系统，拟合获得标样色谱峰面积与浓度关系的标准曲线，随后将待测样品上样后，根据1-脱氧野尻霉素的色谱峰面积推算出其浓度。

2、1-脱氧野尻霉素的生物合成

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含有1％(w/w)脱脂乳粉、4％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，30℃、200rpm培养24h，即得含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定和定量测定

将发酵样品进行上述UHPLC-Q-TOF MS方法检测并结合XCMS软件分析后发现，代谢产物中编号为M164T75的物质与数据库内1-脱氧野尻霉素标品的质谱特征信号完全匹配，因而判定该物质为1-脱氧野尻霉素，结果如图1所示。发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，确定其中1-脱氧野尻霉素的含量为0.62mg/mL。

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：将质量百分比为0.5％的脱脂乳粉、4.5％的淀粉与蒸馏水充分混匀，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳淀粉培养基。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定：同实施例1。

(d)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：同实施例1。

2、1-脱氧野尻霉素的生物合成

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量5％(v/v)无菌接种于含有0.5％(w/w)脱脂乳粉、4.5％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，32℃、300rpm培养12h，即得含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定和定量测定

将发酵样品进行上述UHPLC-Q-TOF MS方法检测并结合XCMS软件分析，结果同实施例1。发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，确定其中1-脱氧野尻霉素的含量为0.51mg/mL。

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：将质量百分比为4.5％的脱脂乳粉、0.5％的淀粉与蒸馏水充分混匀，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳淀粉培养基。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定：同实施例1。

(d)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：同实施例1。

2、1-脱氧野尻霉素的生物合成

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％(v/v)无菌接种于含有4.5％(w/w)脱脂乳粉、0.5％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，28℃、100rpm培养48h，即得含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定和定量测定

将发酵样品进行上述UHPLC-Q-TOF MS方法检测并结合XCMS软件分析，结果同实施例1。发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，确定其中1-脱氧野尻霉素的含量为0.67mg/mL。

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：将质量百分比为2.5％的脱脂乳粉、2.5％的淀粉与蒸馏水充分混匀，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳淀粉培养基。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定：同实施例1。

(d)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：同实施例1。

2、1-脱氧野尻霉素的生物合成

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含有2.5％(w/w)脱脂乳粉、2.5％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，25℃、250rpm培养36h，即得含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定和定量测定

将发酵样品进行上述UHPLC-Q-TOF MS方法检测并结合XCMS软件分析，结果同实施例1。发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，确定其中1-脱氧野尻霉素的含量为0.58mg/mL。

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：将质量百分比为3％的脱脂乳粉、2％的淀粉与蒸馏水充分混匀，在110℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳淀粉培养基。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定：同实施例1。

(d)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：同实施例1。

2、1-脱氧野尻霉素的生物合成

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含有3％(w/w)脱脂乳粉、2％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，35℃、150rpm培养18h，即得含有1-脱氧野尻霉素的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的结构鉴定和定量测定

将发酵样品进行上述UHPLC-Q-TOF MS方法检测并结合XCMS软件分析，结果同实施例1。发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，确定其中1-脱氧野尻霉素的含量为0.69mg/mL。

将实施例1中的接种量，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵液，分别对各组所得发酵液进行1-脱氧野尻霉素的定量测定，结果如表3所示。

表3不同方法制备所得发酵液中1-脱氧野尻霉素的含量

由表3所示的结果中可以得出，将所述1-脱氧野尻霉素的生物合成方法中接种量，发酵温度，发酵时间以及发酵振荡的速度调整到优选范围之外的时候，牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333依然可以合成1-脱氧野尻霉素，但是其产率明显下降。

参考实施例1所述方法，比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的发酵液中1-脱氧野尻霉素的含量，具体操作如下：

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：

牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子的制备：同实施例1。

干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。

嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL M17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

(b)脱脂乳淀粉培养基的制备：同实施例1。

(c)发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量检测：同实施例1。

2、接种于脱脂乳淀粉培养基中发酵

将各菌株以3％(v/v)接种量无菌接种于含有1％(w/w)脱脂乳粉、4％(w/w)淀粉的脱脂乳淀粉培养基中，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)7h，获得相应的发酵液。

3、发酵样品中1-脱氧野尻霉素的定量测定

发酵样品进行上述HPLC-MS/MS方法检测，结果如表4所示：

表4不同菌株制备的发酵液中1-脱氧野尻霉素的含量

由表4可知，除了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333外，其他常规发酵菌株的发酵液中都无法检测到1-脱氧野尻霉素，说明其他常规发酵菌不具有发酵脱脂乳淀粉培养基产生1-脱氧野尻霉素的能力。

以上对本发明所提供的1-脱氧野尻霉素的生物合成方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。