一种神经营养因子和穿透肽组合物及其应用

技术领域

本发明公开了一种多肽的组合物，属于蛋白质或多肽技术领域。

背景技术

视神经病变通常由外伤和一些病理状况引起，如缺血性视神经病变、青光眼或糖尿病，从而导致视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGC）轴突损伤和不可逆的RGC损失。RGC的退化和视神经萎缩是许多眼部疾病和外伤的标志，可导致永久性视力丧失。

神经营养因子是一类由神经所支配的组织和星形胶质细胞产生的为神经元生长和存活所必需的蛋白质分子。神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）是神经营养因子家族中最经典的成员，外源性NGF已被广泛报道可以刺激视神经损伤后神经元存活和恢复视觉功能。通过玻璃体内注射或滴眼液进行NGF的局部应用可以显著减少视神经损伤后RGC的损失。在临床试验中重组人神经生长因子（Recombinant Human Nerve Growth Factor,rhNGF）滴眼液在改善青光眼患者的症状和体征方面安全有效。此外，局部应用rhNGF有利于改善角膜神经的结构和功能，Cenegermin（20 μg/mL rhNGF）滴眼液已被EMA和FDA批准用于治疗神经营养性角膜炎。

然而，由于生理屏障的存在，眼科药物递送显示出较低的生物利用度(< 5%)，角膜和结膜屏障以及血眼屏障阻碍药物进入眼球到达视网膜和视神经，因此通过局部给药将大分子和小分子药物递送到眼内是一个主要的挑战。细胞穿透肽是一类多样化的肽，通常具有5-30个氨基酸，可以通过非共价或共价结合的方式转运蛋白质、核酸片段或小分子药物从而使其穿过细胞膜。基于穿透肽的细胞摄取促进了生物分子的非侵入性局部递送，如经皮、经鼻和经眼递送，为突破人体生理屏障的药物递送提供了新方案。本发明的目的在于提供一种可用于治疗视神经相关疾病的组合物，以将其中的有效成份神经营养因子高效突破生理屏障到达病变部位发挥神经保护作用。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种组合物，所述组合物含有神经营养因子和多肽，其中，所述多肽选自以下多肽的一种或多种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

（2）序列如SEQ ID NO.2所示的多肽；

（3）序列如SEQ ID NO.3所示的多肽。

本发明中所述的多肽又被称为穿透肽，是指一类多样化的肽，通常具有5-30个氨基酸，可以通过非共价或共价结合的方式转运蛋白质、核酸片段或小分子药物从而使其穿过细胞膜。所述多肽富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，可促进与带负电的细胞膜的静电相互作用。所述多肽中的氨基酸可以为D型氨基酸，也可以为L型氨基酸，本发明提供了具有L型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.1所示的多肽被命名为“L-RK16”，具有D型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.1所示的多肽被命名为“D-RK16”；具有L型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.2所示的多肽被命名为“L-KR16”，具有D型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.2所示的多肽被命名为“D-KR16”；具有L型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.3所示的多肽被命名为“L-DR16”，具有D型氨基酸的且序列如SEQ ID NO.3所示的多肽被命名为“D-DR16”。

在一个优选的实施方案中，所述神经营养因子选自神经生长因子、脑源神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、睫状神经营养因子、胶质细胞源神经营养因子中的一种或几种。

在一个更为优选的实施方案中，所述神经营养因子为神经生长因子，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1:（2-50）。在本发明的具体实施方案中，当rhNGF终浓度为50 μg/mL，L-KR16的终浓度为2.5 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL时，即，神rhNGF与多肽的重量配比为1：（2-50），rhNGF穿越进入大鼠视网膜的含量无显著性差异，均具有优异的穿越效能。

尤为优选地，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1：（2-5）。在本发明的具体实施方案中，当rhNGF终浓度为50 μg/mL，L-KR16终浓度分别设定为250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL时，4个浓度梯度rhNGF在视网膜的含量无显著性差异。

在本发明的一个具体实施方案中，所述多肽的序列如SEQ ID NO. 1所示，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1：5。在本发明的具体实施方案中，当rhNGF终浓度为50 μg/mL，L-RK16设定250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL和100 μg/mL 4个浓度梯度时，rhNGF在视网膜的含量平均值分别为5.6 pg/mg、4.4 pg/mg、2.9 pg/mg和2.3 pg/mg，250 μg/mL组显著高于150 μg/mL组（P=0.0065）和100 μg/mL组（P=0.0013），即，对于L-RK16而言，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1：5时可以取得更为优异的穿越效果。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述多肽的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1：3。在本发明的具体实施方案中，在rhNGF 50μg/mL的条件下，L-KR16设定250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL和100 μg/mL 4个浓度梯度，4个浓度梯度rhNGF在视网膜的含量平均值分别为22.0 pg/mg、21.7 pg/mg、35.3 pg/mg和34.1 pg/mg，无显著性差异，但是，150 μg/mL组在视网膜的含量最高。即，对于L-KR16而言，所述神经生长因子与多肽的重量配比为1：3时可以取得更为优异的穿越效果。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽中的氨基酸可以为D型氨基酸，也可以为L型氨基酸，在一个更为优选的实施方案中，所述多肽为L型氨基酸。

其次，本发明提供了上述的组合物在制备治疗视神经相关疾病的药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述视神经相关疾病包括以下疾病中的一种或多种：视网膜病变、视神经病变相关疾病、青光眼。

本发明所述的视网膜病变包括急性视网膜坏死、视网膜色素变性、视网膜血管炎、视网膜脱落、视网膜动脉/静脉阻塞；所述视神经病变相关疾病包括视神经萎缩、球后视神经炎；所述青光眼包括原发性开角型青光眼、新生血管性青光眼、色素性青光眼。

本发明所述的治疗视神经相关疾病可以包括以下方式的一种或几种：抗凋亡、抗炎、促进神经细胞存活、促进神经再生。

在另一个优选的实施方案中，所述的组合物被制备为冻干剂、注射剂、滴眼剂、雾化剂、外敷剂。在本发明的一个具体实施方案中，所述的组合物被制备为滴眼剂，本领域技术人员明白，基于临床用药的具体需要，本发明所述的组合物可以制备成相应的适合制剂以满足实施的具体需要。

本发明所述的神经营养因子和穿透肽组合物进行滴眼可显著促进组合物中神经营养因子入眼的效率，组合物中rhNGF的入眼效率是单独rhNGF滴眼的2-80倍。神经营养因子rhNGF与穿透肽L-KR16组合物滴眼液可确保rhNGF在较低浓度水平条件下对视神经夹伤小鼠产生保护视网膜节细胞和改善视觉诱发电位的治疗效果。视神经夹伤小鼠连续滴眼14天，L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组视网膜节细胞数量显著高于rhNGF 90 μg/mL组（平均值816个/mm

附图说明

图1为10条穿透肽对rhNGF入眼效果的评价结果；

图2为4条穿透肽对rhNGF入眼效果的进一步评价结果；

图3为不同rhNGF浓度下单独滴眼rhNGF和L-KR16+rhNGF滴眼的入眼效果，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图4为对L-KR16作用浓度的评价结果；

图5为对L-RK16作用浓度的评价结果，**，P<0.01；

图6为L-KR16+rhNGF滴眼后rhNGF在视网膜中含量的时间动态变化结果，****，P<0.0001；

图7为L-KR16+rhNGF滴眼对视神经夹伤模型小鼠视觉诱发电位的疗效结果，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001；

图8为L-KR16+rhNGF滴眼对视神经夹伤模型小鼠视网膜节细胞的保护结果，*，P<0.05；**，P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1. 穿透肽增强rhNGF入眼效率

合成基于L氨基酸和D氨基酸的穿透肽各5条，情况如表1所示。其中RK-16已经证实在递送反义寡核苷酸（Tai等， Noninvasive delivery of oligonucleotide bypenetratin-modified polyplexes to inhibit protein expression of intraoculartumor, Nanomedicine: Nanotech-nology, Biology, and Medicine (2017), doi:10.1016/j.nano.2017.04.011）和有机化合物甲氨蝶呤、长春新碱（Kamei N等，Evaluation of Cell-Penetrating Peptides as Versatile, Effective AbsorptionEnhancers: Relation to Molecular Weight and Inherent Epithelial DrugPermeability，Pharm Res (2020) 37:182 https://doi.org/10.1007/s11095-020-02874-0）中有效果；RK-16和KR16可提高大鼠口服胰岛素的肠道吸收（Khafagy等，Region-Dependent Role of Cell-Penetrating Peptides in Insulin Absorption Across theRat Small Intestinal Membrane， The AAPS Journal，2015，published online 28 July2015），以及经鼻无创伤递送胰岛素（Khafagy等，One-month subchronic toxicity studyof cell-penetrating peptides for insulin nasal delivery in rats. EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 85 (2013) 736–743）；DR-16来源于Oct4蛋白转导域，具有细胞穿透功能（Harreither 等，Characterization of a novelcell penetrating peptide derived from human Oct4 ，Cell Regeneration 2014, 3:2，http://www.cellregenerationjournal.com/content/3/1/2）；GQ13与酸性成纤维细胞生长因子融合表达产物滴眼液可有效渗入大鼠视网膜（Wang等，Cell penetratingpeptide TAT-mediated delivery of acidic FGF to retina and protection againstischemia reperfusion injury in rats， Cell. Mol. Med. Vol 14, No 7, 2010 pp.1998-2005）；RR8可用于细胞水平的siRNA递送（Chu等，Rational modification ofoligoarginine for highly efficient siRNA delivery: structure–activityrelationship and mechanism of intracellular trafficking of siRNA.Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 11 (2015) 435 – 446），以及促进静脉注射胰岛素穿过血脑屏障进入大脑（Kamei N 等，Noncovalent Strategy withCell-Penetrating Peptides to Facilitate the Brain Delivery of Insulin throughthe Blood-Brain Barrier.Biol.Pharm. Bull.41,546-554（2018））。除GQ13融合表达产物之外，这些穿透肽均未被用于神经营养因子的眼内递送。rhNGF基于发明人此前的缺失突变体设计（见CN201110213670.8），在CHO细胞中表达，柱层析纯化，UV法检测浓度，在TF-1细胞上验证具有不低于参考品的生物学活性。穿透肽使用PBS溶解并稀释至所需浓度，实验前将特定浓度的肽与等体积特定浓度的rhNGF溶液混合，反复吸打充分混匀，冰浴放置，待用。

表1. 合成的穿透肽序列信息

。

在SD大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）上验证rhNGF的入眼效率。大鼠根据体重腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，30 μL/眼滴加特定浓度的肽-rhNGF组合物或对照物，于滴眼后30分钟或1、2、3、6、12和24小时过量麻醉处死大鼠，PBS冲洗眼表，取眼球，再用PBS冲洗，于体视显微镜下解剖眼球取视网膜，置于对应已知重量的EP管中，称重，于-70℃冰箱保存。

使用ELISA法检测各组大鼠视网膜中的rhNGF含量。待测样品从低温冰箱中取出，恢复至室温，每管加入0.3 mL PBS，60%功率超声5秒，4℃ 12000 rpm离心5分钟，上清转移至新EP管用于检测，检测后剩余样品-70℃及以下温度保存。根据R&D Human beta-NGFDuoSet ELISA试剂盒所附说明书检测方法，检测前一天用PBS将NGF捕获抗体Capture稀释至2.00 μg/mL，100 μL/孔加入到96孔ELISA板中，室温密封孵育过夜；ELISA板用洗液（PBS+ 0.05% Tween-20）洗涤3次，每孔300 μL加入样品稀释液（PBS + 1% BSA），室温孵育1小时；配制一系列浓度的标准品，浓度梯度分别为2000 pg/mL、1000 pg/mL、500 pg/mL、250pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL和31.2 pg/mL；待测样品根据预检测结果进行预先稀释；封闭完成后，ELISA板洗板3次，根据板布局分别加入检测样品和标准品，室温孵育2小时；洗涤3次后，每孔100 μL加入50.0 pg/mL的生物素标记抗体，室温孵育2小时；洗板3次后，每孔100 μL加入40倍稀释的Streptavidin-HRP，室温避光孵育20分钟；洗板3次后，每孔加入100μL TMB显色液室温避光显色6-10分钟，每孔加入50 μL终止液终止反应；酶标仪读取450 nm和570 nm处的吸光值，根据标准品浓度和对应的OD值（OD450 - OD570）绘制标准曲线，计算样品中的rhNGF浓度，并根据样品重量进行均一化，rhNGF含量单位为pg/mg。

36只雄性SD大鼠分12组，每组3只（6只眼），分别滴眼PBS（Neg.），单独rhNGF，以及rhNGF+各穿透肽，每只眼30 μL，rhNGF终浓度为0.1 mg/mL，穿透肽终浓度为2.5 mg/mL。滴眼30分钟后取视网膜检测rhNGF含量。如图1所示，对照组（Neg.）未检测到rhNGF，单独rhNGF组检测到极低水平的rhNGF，平均浓度为2.6 pg/mg，rhNGF与穿透肽混合后，rhNGF在视网膜的含量增高，其中L-RK16+rhNGF、D-RK16+rhNGF、L-KR16+rhNGF、D-KR16+rhNGF和L-DR16+rhNGF组rhNGF在视网膜的含量最高，其平均值分别为41.3 pg/mg、14.6 pg/mg、15.3 pg/mg、15.3 pg/mg和12.0 pg/mg。结果表明，穿透肽可增强rhNGF滴眼的入眼效率，在rhNGF浓度为0.1 mg/mL穿透肽浓度为2.5 mg/mL的条件下rhNGF入眼效率是单独滴眼rhNGF的4.7-16.1倍。相比之下，L-GQ13+rhNGF组与D-GQ13+rhNGF组rhNGF在视网膜的含量较低，平均浓度分别是3.5 pg/mg和4.6 pg/mg，仅为单独滴眼rhNGF的1.3倍和1.8倍，明显低于L-RK16+rhNGF、D-RK16+rhNGF、L-KR16+rhNGF、D-KR16+rhNGF和L-DR16+rhNGF组。

进一步验证穿透肽L-RK16、D-RK16、L-KR16和D-KR16对rhNGF入眼效率的影响。64只雄性SD大鼠分为16组，每组4只（8只眼），分别滴眼PBS（Neg.），单独rhNGF和肽+rhNGF组合物。rhNGF浓度设定100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL三个梯度，肽浓度为2.5 mg/mL。滴眼30分钟后取视网膜检测rhNGF含量。如图2所示，在肽浓度为2.5 mg/mL，rhNGF终浓度为100 μg/mL、50 μg/mL或25 μg/mL的条件下，均以L-KR16+rhNGF组rhNGF在视网膜的含量最高，平均值分别为15.7 pg/mg、12.2 pg/mg和4.3 pg/mg，基于图2结果，下图中，rhNGF在组合物中（100μg/眼）的入眼效率是单独rhNGF滴眼的入眼效率的1.9-12.8倍，中图中，rhNGF在组合物中（50μg/眼）的入眼效率是单独rhNGF滴眼的入眼效率的6.6-35.9倍，上图中，rhNGF在组合物中（25μg/眼）的入眼效率是单独rhNGF滴眼的入眼效率的2.6-14.2倍。如图3所示， L-KR16+rhNGF滴眼时rhNGF 100 μg/mL和50 μg/mL组rhNGF在视网膜中的含量均显著高于rhNGF 25μg/mL组（100 μg/mL vs. 25 μg/mL, P=0.0005；50 μg/mL vs. 25 μg/mL, P=0.0123），而100 μg/mL和50 μg/mL两组之间则无显著性差异（P=0.3535）；相比之下，单独rhNGF滴眼仅100 μg/mL组显著高于空白对照组（平均值1.2 pg/mg vs 0.17 pg/mg, P=0.0006），其rhNGF在视网膜中的含量均值为1.2 pg/mg，远低于D-KR16+rhNGF 25 μg/mL组的4.3 pg/mg。基于图3结果，右图中，rhNGF在组合物中的入眼效率是单独rhNGF滴眼的入眼效率的49.2-80.2倍（左图无单独rhNGF组）。

在rhNGF终浓度50 μg/mL的条件下考察L-KR16的作用浓度。首先设定L-KR16的终浓度为2.5 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL，每组5只SD大鼠（10只眼）。滴眼30分钟后取视网膜检测rhNGF含量。如图4所示，以上L-KR16的5个浓度梯度，rhNGF在大鼠视网膜的含量平均值分别为12.9 pg/mg、13.7 pg/mg、13.3 pg/mg、15.1 pg/mg和10.5 pg/mg，各组间无显著性差异，但观察到0.1 mg/mL组rhNGF在视网膜中的含量略低于其它组。进一步考察L-KR16从0.25 mg/mL至0.1 mg/mL的作用效果，L-KR16终浓度分别设定为250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL和0 μg/mL，每组4只大鼠（8只眼）。如图4所示，以上L-KR16的4个浓度梯度rhNGF在视网膜的含量平均值分别为22.0 pg/mg、21.7 pg/mg、35.3 pg/mg和34.1 pg/mg，无显著性差异。在rhNGF 50 μg/mL的条件下，选择L-KR16的使用终浓度为150 μg/mL。

在rhNGF 终浓度50 μg/mL的条件下考察L-RK16的作用浓度。参考L-KR16的结果，设定250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL和100 μg/mL 4个浓度梯度。如图5所示，以上L-RK16的4个浓度梯度rhNGF在视网膜的含量平均值分别为5.6 pg/mg、4.4 pg/mg、2.9 pg/mg和2.3 pg/mg，随着L-RK16浓度的下降，rhNGF在视网膜的含量逐渐降低，其中250 μg/mL组显著高于150 μg/mL组（P=0.0065）和100μg/mL组（P=0.0013）。

在rhNGF 50 μg/mL和L-KR16 200 μg/mL的条件下考察rhNGF入眼后在大鼠眼内的存留时间。实验共设滴眼后取材时间为0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h共7组，每组4只大鼠（8只眼）。如图6所示，rhNGF在视网膜的含量于滴眼后0.5小时为最高值，平均值为21.7 pg/mg，之后呈现逐渐下降的趋势，至滴眼后3个小时仍可以检测到显著水平的rhNGF，平均值为3.5 pg/mg，第6小时rhNGF在视网膜中的含量显著高于第24小时（平均值0.73 pg/mg vs. 0.083 pg/mg, P<0.0001），第12小时仍可以检测到低水平的rhNGF，平均值为0.23pg/mg。结果提示L-KR16+rhNGF每天滴眼两次可维持rhNGF在眼内的含量。

综上所述，L-RK16、D-RK16、L-KR16、D-KR16和L-DR16是增强rhNGF入眼效率较好的穿透肽，其中L型氨基酸肽的效果优于D型氨基酸肽，效果最好的穿透肽是L-KR16；使用L-KR16时，rhNGF较好的使用浓度为50 μg/mL，在这一浓度下，L-KR16较好的使用浓度为150 μg/mL；L-KR16+rhNGF每天滴眼两次可维持rhNGF在眼内的含量。

实施例2. rhNGF与L-KR16组合物的神经保护作用

在小鼠视神经夹伤模型上评价rhNGF与L-KR16组合物的神经保护作用。实验动物为成年雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18-23 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。实验分为正常对照组（不做任何处理），模型对照组（夹伤不给药），模型单独rhNGF 90 μg/mL组，模型单独rhNGF 180 μg/mL组和模型L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组，L-KR16的终浓度为270μg/mL。

采用镊子夹伤法建立视神经损伤模型。异氟烷气体麻醉小鼠，左眼局部消毒后在眼尾侧剪开球结膜，分离结膜下组织使视神经暴露，用杜蒙5号镊在距眼球2mm处垂直夹持视神经5秒进行夹伤。术后球结膜进行复位，涂抹红霉素眼膏，镜下观察眼底情况。第2天镜下观察，出现Marcus-gunn瞳孔、眼球无明显突出、眼底无出血者为成功模型。

按实验分组在小鼠麻醉状态下每天早晚各滴眼给药1次，连续2周。空白对照组不做任何处理。第14天检测每只小鼠的视觉诱发电位，之后过量麻醉处死小鼠，取视网膜进行视神经节细胞染色和计数。

视觉诱发电位检测方法如下。小鼠暗适应2小时后根据体重腹腔注射一定体积的2%戊巴比妥钠麻醉，滴加复方托吡卡胺充分散瞳5分钟，将记录电极置双耳连线中点，参考电极置外眦部皮肤，地电极插入小鼠尾巴，遮盖对侧眼。采用全视野连续白光刺激，光强为3cd.s.m

视网膜节细胞计数方法如下。小鼠经过量麻醉处死并心脏灌流固定后，小心摘取眼球转移至4%多聚甲醛固定过夜。剥离视网膜并标记上下鼻颞4个方向，剪开并分成鼻侧、颞侧、腹侧、背侧4个象限。将视网膜在Triton X-100中浸泡2 h后，使用兔抗小鼠RBPMS多克隆抗体4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后加入Alexa Fluor 594标记驴抗兔二抗，室温避光孵育2小时。PBS漂洗后在载玻片上铺平视网膜，使用含DAPI的抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜下观察，对每一象限中线上距视盘凹陷处0.5 mm、1 mm和1.5 mm处分别拍照，使用Photoshop软件为每张图片画定0.3 × 0.3 mm的计数区，使用Image J软件对每个计数区进行节细胞计数。

视觉诱发电位检测结果如图7所示。术后14天，正常对照组、模型对照组、rhNGF 90μg/mL组、rhNGF 180 μg/mL组和L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组的P波潜伏期平均值分别为60.9ms、85.9 ms、79.9 ms、69.4 ms和64.0 ms。模型对照组小鼠的P波潜伏期时间相比于正常对照组小鼠显著延长（平均值 85.9 ms vs. 60.9 ms, P=0.0008），说明视神经夹伤造成小鼠视觉电位P波潜伏期显著变化。单独滴眼rhNGF 90 μg/mL 14天不能改善因视神经夹伤造成的P波潜伏期延长（相比于模型对照组，平均值79.9 ms vs. 85.9 ms, P=0.6889）；将rhNGF提高至180 μg/mL后，P波潜伏期延长时间缩短，与正常对照组无统计差异（平均值69.4 msvs. 60.9 ms, P=0.3665），显著低于模型结果组（平均值69.4 ms vs. 79.9 ms, P=0.0315）。L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组P波潜伏期时间在各视神经夹伤组间最接近于正常对照组（平均值64.0 ms vs. 60.9 ms, P=0.9492），同时其P波潜伏期时间显著低于模型对照组（平均值64.0 ms vs. 85.9 ms, P=0.0031）和单独滴眼rhNGF 90 μg/mL组（平均值64.0ms vs. 79.9 ms, P=0.0305）。这些结果表明，以较高浓度rhNGF滴眼可改善视神经夹伤模型小鼠的视觉诱发电位P波潜伏期时间，而L-KR16可促使rhNGF在较低浓度下达到这一作用效果。在N-P波振幅方面，术后14天，正常对照组、模型对照组、rhNGF 90 μg/mL组、rhNGF180 μg/mL组和L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组的N-P波振幅平均值分别为16.0 μV、5.3 μV、5.9μV、6.1 μV和7.0 μV。正常对照组的视觉诱发电位N-P波振幅均显著高于各视神经夹伤组。在各个视神经夹伤组之间，L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组的N-P波振幅显著高于模型对照组（平均值7.0 μV vs. 5.3 μV, P=0.0346），说明rhNGF与L-KR16联用可改善视神经夹伤模型小鼠视觉诱发电位的N-P波振幅。

视网膜节细胞计数结果如图8所示。术后14天，正常对照组、模型对照组、rhNGF 90μg/mL组、rhNGF 180 μg/mL组和L-KR16+rhNGF 90 μg/mL组的视网膜节细胞平均值分别为3878个/mm

综上所述，以较高浓度的rhNGF滴眼可改善视神经夹伤小鼠的视觉诱发电位，并在一定程度上保护视网膜节细胞，而L-KR16可确保rhNGF在较低浓度水平下获得这些保护效果。