一种重组人3D皮肤模型的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种重组人3D皮肤模型的制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

透皮吸收是影响药物、化合物功能、毒理等性质的关键属性。在经皮给药制剂中，药物经皮渗透达到作用部位是药物发挥治疗作用的前提，大部分药物由于药物本身理化性质的限制，不易透过人体皮肤到达治疗部位。因此，研究药物原料或制剂中成分透皮吸收率具有重要的意义。近年来，经皮给药制剂仿制药质量和疗效一致性评价研究过程中，透皮吸收的评价也是不可或缺的研究内容。对于化妆品原料或产品中的成分，能够透皮吸收也决定了其作用方式、有效性和安全性。化合物能够透皮吸收，也是化学品安全分级的重要研究指标。

目前评价透皮吸收的方法有体内和体外两大类。体内方法即动物或人体实验，这种方法的优点是准确性高，但时间长，成本高、费用高，因此一般不作为大量初筛和前期评价工作，只用于创新药物研发时药代动力学研究等等特定情景。常用的体外方法是采用人源或动物来源哺乳动物皮肤，采用扩散池进行试验。将皮肤固定于扩散池的给样池和接收池之间，待测物质在特定条件下在皮肤上停留特定时间，然后通过适当的清洁程序去除。在整个实验过程的各个时间点对受体液进行采样，分析待测化学物质和/或代谢物。

现有技术中，猪皮、大鼠皮等是最为常用的透皮吸收研究的试验体系。但是使用这些哺乳动物来源的皮肤存在明显的缺点和困难：例如，皮肤质量受制皮工艺影响较大、同种动物不同个体来源的皮肤差别较大、同一动物不同区域的皮肤差别较大、制备后的皮肤标本储存困难等，这在客观上造成了试验结果重复性差、精密度较差。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明公开了一种重组人3D皮肤模型的制备方法和应用，制备得到皮肤质量稳定、用于化合物透皮吸收评价试验时试验结果重复性好，精密度高的3D皮肤模型。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一种重组人3D皮肤模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）将真皮成纤维细胞加入到牛I型胶原蛋白溶液中，使得所述真皮成纤维细胞在所述牛I型胶原蛋白溶液中的密度为5×10

（2）取加有真皮成纤维细胞的牛I型胶原蛋白溶液加入至六孔板transwellinsert小室中，置于培养箱中凝胶0.5~1.5 h，形成胶原凝胶；

（3）将胶原凝胶的厚度压缩至0.5~1.5 mm；

（4）分别向小室内和小室外加入真皮培养基，使得小室内外界面相平，培养2~4天，使得真皮成纤维细胞和胶原蛋白相互作用形成真皮层；

（5）将含有角质细胞的角质细胞培养基接种到所述真皮层上，置于培养箱中静置2~4 h使角质细胞贴壁；

（6）分别向小室内和小室外加入角质细胞培养基，使得小室内外界面相平，浸没培养2~4天；

（7）向小室外加入气液培养基气液培养10~12天，每天换液，即得到重组人3D皮肤模型。

在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述重组人3D皮肤模型的制备方法制备得到的重组人3D皮肤模型。

在本发明的第三方面，提供一种第二方面所述重组人3D皮肤模型在药品或化妆品的安全性评价或功效性评价中的应用。

在本发明的第四方面，提供一种第二方面所述重组人3D皮肤模型在皮肤相关的基础研究中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明的重组人3D皮肤模型的制备方法中真皮成纤维细胞和牛I型胶原蛋白相互作用，牛I型胶原蛋白结构重塑可以形成机械性能较好、结构与天然皮肤真皮层相近的真皮层，更接近真实人体组织。加入气液培养基进行气液培养，可以更好地模拟皮肤模型的体内特性，形成更接近真实人体组织的重组人3D皮肤模型。

本发明制备的重组人3D皮肤模型皮肤质量稳定、将该皮肤模型用于化合物透皮吸收评价试验时试验结果重复性好，精密度高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1制备的重组人3D皮肤模型的组织学结构图；

图2为本发明实施例2制备的重组人3D皮肤模型的组织学结构图；

图3为本发明实施例4中皮肤模型编号3的咖啡因transwell培养小室的重组人3D皮肤模型的透皮吸收实验结果；

图4为图3的液相图谱数值；

图5为本发明实施例4中皮肤模型编号4的咖啡因transwell培养小室的重组人3D皮肤模型的透皮吸收实验结果；

图6为图4的液相图谱数值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术中论述的，现有技术中猪皮、大鼠皮等作为最为常用的透皮吸收研究的试验体系存在明显的缺点和困难，包括皮肤质量受制皮工艺影响较大、同种动物不同个体来源的皮肤差别较大、同一动物不同区域的皮肤差别较大、制备后的皮肤标本储存困难等，这在客观上造成了透皮吸收研究的试验结果重复性差、精密度较差。鉴于此，本发明公开了一种重组人3D皮肤模型的制备方法，采用真皮成纤维细胞和牛I型胶原蛋白相互作用形成机械性能较好、结构与天然皮肤真皮层相近的真皮层，并在真皮层上接种角质细胞，经过气液培养形成皮肤质量稳定、试验结果重复性好，精密度高的3D皮肤模型。

本发明的一种实施方式中，提供了一种重组人3D皮肤模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）将真皮成纤维细胞加入到牛I型胶原蛋白溶液中，使得所述真皮成纤维细胞在所述牛I型胶原蛋白溶液中的密度为5×10

（2）取加有真皮成纤维细胞的牛I型胶原蛋白溶液加入至六孔板transwellinsert小室中，置于培养箱中凝胶0.5~1.5 h，形成胶原凝胶；

（3）将胶原凝胶的厚度压缩至0.5~1.5 mm；

（4）分别向小室内和小室外加入真皮培养基，使得小室内外界面相平，培养2~4天，使得真皮成纤维细胞和胶原蛋白相互作用形成真皮层；

（5）将含有角质细胞的角质细胞培养基接种到所述真皮层上，置于培养箱中静置2~4 h使角质细胞贴壁；

（6）分别向小室内和小室外加入角质细胞培养基，使得小室内外界面相平，浸没培养2~4天；

（7）向小室外加入气液培养基气液培养10~12天，每天换液，即得到重组人3D皮肤模型。

本发明的制备方法中，在小室中加入真皮培养基后，真皮成纤维细胞和牛I型胶原蛋白相互作用，牛I型胶原蛋白得结构重塑形成结构与天然皮肤真皮层相近的真皮层，该真皮层的机械性能较好。将角质细胞接种到真皮层上，并在小室中加入角质细胞培养基后，真皮层表面形成角质层。加入气液培养基进行气液培养，可以更好地模拟皮肤模型的体内特性，形成更接近真实人体组织的3D皮肤模型。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中牛I型胶原蛋白溶液的pH值7.0~7.2；牛I型胶原蛋白溶液的浓度为4~6 mg/ml。

在一种具体的实施方式中，步骤（2）中所述培养箱的培养条件为温度37℃，5%二氧化碳。

在一种具体的实施方式中，步骤（3）中使用与所述六孔板匹配的压缩装置压缩胶原凝胶，待所述胶原凝胶的厚度压缩至0.5~1.5 mm时，取出压缩装置；

优选地，所述压缩装置的载重为110~130 g。

本发明中将所述胶原凝胶的厚度压缩至一定厚度，使得后续生成的真皮层更加接近真实人体组织中真皮层的结构。

在一种具体的实施方式中，步骤（4）中小室内加入1~3 mL真皮培养基，小室外加入2~4 mL真皮培养基。

在一种具体的实施方式中，步骤（4）中的真皮培养基的配方为：DMEM 10 g/L~20g/L，牛血清5%~15%，L-谷氨酰胺 2 mol/L~5 mol/L，抗生素0.1%~1.5%，NaHCO

在一种具体的实施方式中，步骤（5）中的角质细胞培养基的配方为：DMEM 8 g/L~15 g/L，F12 2 g/L~8 g/L，牛血清0.1%~1%，L-谷氨酰胺 2 mol/L~5 mol/L，氢化可的松0.1%~0.5%，胰岛素1 mg/L~5 mg/L。

在一种具体的实施方式中，步骤（5）中所述培养箱的培养条件为温度37℃，5%二氧化碳。

在一种具体的实施方式中，步骤（5）中角质细胞培养基中的角质细胞的密度为5×10

优选地，所述角质细胞培养基的接种量为140~160 μl。

在一种具体的实施方式中，步骤（6）中小室内加入1~3 mL角质细胞培养基，小室外加入2~4 mL角质细胞培养基。

在一种具体的实施方式中，步骤（7）中所述气液培养基的配方为：在所述角质细胞培养基的基础上添加以下成分：软脂酸 0.020 mM~0.028 mM，花生四烯酸 0.006~0.008mM，亚油酸 0.012 mM ~0.018 mM，BSA0.020 mM ~0.026 mM，维生素C 0.25 mM ~0.30 mM。

在一种具体的实施方式中，步骤（7）中所述气液培养基的加入量为1~2 mL。

气液培养基使皮肤模型的一侧与液体培养基接触，另一侧暴露在空气中，与现有技术中的细胞培养方法相比，该培养方法可以更准确地模拟体内环境，使得形成的皮肤模型更加接近真实人体组织。

本发明的一种实施方式中，提供了一种上述重组人3D皮肤模型的制备方法制备得到的重组人3D皮肤模型。

本发明的一种实施方式中，提供了一种上述重组人3D皮肤模型在药品或化妆品的安全性评价或功效性评价中的应用。

本发明的一种实施方式中，提供了一种上述重组人3D皮肤模型在皮肤相关的基础研究中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明并不仅限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

一种重组人3D皮肤模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）使用5 M NaOH调节牛I型胶原蛋白溶液的pH值至7.1，按7×10

（2）移取4 mL上述加有真皮成纤维细胞的胶原蛋白溶液至六孔板transwellinsert小室中，置于37℃，5%二氧化碳培养箱中凝胶1 h；

（3）将六孔板置于无菌吸水纸上，使用与六孔板匹配的载重为120 g的压缩装置压缩胶原凝胶，待胶原凝胶的厚度压缩至1 mm时，取出压缩装置；

（4）小室内加入2 mL真皮培养基，小室外加入3 mL真皮培养基，小室内外界面相平，培养3天，使真皮成纤维细胞和胶原蛋白相互作用形成真皮层；其中真皮培养基的配方为：DMEM 10 g/L~20 g/L，牛血清5%~15%，L-谷氨酰胺 2 mol/L~5 mol/L，抗生素0.1%~1.5%，NaHCO

（5）收集角质细胞，使用角质细胞培养基重悬细胞，使角质细胞在角质细胞培养基中的密度为12.5×10

（6）小室内加入2 mL角质细胞培养基，小室外加入3 mL角质细胞培养基，小室内外界面相平，浸没培养3天；

（7）小室外加入1.5 mL气液培养基气液培养11天，每天换液，得到3D皮肤模型；其中，气液培养基的配方为：DMEM 8 g/L~15 g/L，F12 2 g/L~8 g/L，牛血清0.1%~1%，L-谷氨酰胺 2 mol/L~5 mol/L，氢化可的松 0.1%~0.5%，胰岛素1mg/L~5 mg/L，软脂酸 0.020 mM~0.028 mM，花生四烯酸 0.006~0.008mM，亚油酸 0.012 mM ~0.018 mM，BSA 0.020 mM~0.026 mM，维生素C 0.25 mM ~0.30 mM。

对本发明制备的重组人3D皮肤模型进行检测可得，实施例1制备的重组人3D皮肤模型厚度达到标准，组织层次合格，经皮电阻值符合规定（≥10 KΩ）。

实施例2

一种重组人3D皮肤模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）使用5 M NaOH调节牛I型胶原蛋白溶液的pH值至7.2，按10×10

（2）移取4 mL上述加有真皮成纤维细胞的胶原蛋白溶液至六孔板transwellinsert小室中，置于37℃，5%二氧化碳培养箱中凝胶1 h；

（3）将六孔板置于无菌吸水纸上，使用与六孔板匹配的载重为120 g的压缩装置压缩胶原凝胶，待胶原凝胶的厚度压缩至1.5 mm时，取出压缩装置；

（4）小室内加入2 mL真皮培养基，小室外加入3 mL真皮培养基，小室内外界面相平，培养3天，使真皮成纤维细胞和胶原蛋白相互作用形成真皮层；其中真皮培养基的配方为：DMEM 10 g/L~20 g/L，牛血清5%~15%，L-谷氨酰胺 2 mol/L~5 mol/L，抗生素0.1%~1.5%，NaHCO

（5）收集角质细胞，使用角质细胞培养基重悬细胞，使角质细胞在角质细胞培养基中的密度为20×10

（6）小室内加入3 mL角质细胞培养基，小室外加入4 mL角质细胞培养基，小室内外界面相平，浸没培养4天；

（7）小室外加入2 mL气液培养基气液培养12天，每天换液，得到3D皮肤模型；其中，气液培养基的配方为：DMEM 8 g/L~15 g/L，F12 2 g/L~8 g/L，牛血清0.1%~1%，L-谷氨酰胺2 mol/L~5 mol/L，氢化可的松 0.1%~0.5%，胰岛素1 mg/L~5 mg/L，软脂酸 0.020 mM~0.028 mM，花生四烯酸 0.006~0.008mM，亚油酸0.012 mM ~0.018 mM，BSA 0.020 mM ~0.026 mM，维生素C 0.25 mM ~0.30 mM。

对本发明制备的重组人3D皮肤模型进行检测可得，实施例2制备的重组人3D皮肤模型厚度达到标准，组织层次合格，经皮电阻值符合规定（≥10 KΩ）。

从实施例1制备的重组人3D皮肤模型中剪取部分培养至符合标准的重组人3D皮肤模型，编号为1；从实施例2制备的重组人3D皮肤模型中剪取部分培养至符合标准的重组人3D皮肤模型，编号为2。将编号1和2的重组人3D皮肤模型经过HE染色后进行镜下观察。实施例1制备的重组人3D皮肤模型的组织学结构图如图1所示，实施例2制备的重组人3D皮肤模型的组织学结构图如图2所示。

从图1和图2中可以看出重组人3D皮肤模型具有连续完整的皮肤结构（表皮+真皮），皮肤厚度均一性较好，不同编号的皮肤之间结构稳定，说明本发明的制备方法制备得到的重组人3D皮肤模型的皮肤质量稳定。

实施例3

基于实施例1制备的重组人3D皮肤模型的transwell培养小室的透皮吸收方法，包括以下步骤：

（1）使用transwell培养小室和6孔培养板组合，培养板孔为下室，在transwell培养小室培养皮肤模型；

（2）重组人3D皮肤培养至一定标准（厚度达到约1 mm）、组织层次合格（HE染色病理切片观察）、经皮电阻达标；

（3）将下室6孔板中每孔加入2 ml接收液（根据受试物选取合适的培养基或者其他缓冲液；接受液的选择需进行验证，证明该接受液对受试物无破坏不影响检测且能够保证试验期间皮肤正常存活），后将含有重组人3D皮肤模型的transwell小室沿孔壁一侧缓缓放入，应确保接收液和transwell培养小室之间无气泡；

（4）将直径为15 mm的无菌玻璃定量环放置在3D皮肤模型中央，测定经皮电阻值符合规定（≥10 KΩ）；

（5）选择合适的受试物浓度（通常受试物在接受液中的浓度不应对该受试物经皮扩散产生速率限制），将受试物均匀涂布于定量环中的皮肤上，通常为每平方厘米皮肤表面使用1~5 mg固体化学品或10 µl液体化学品；

（6）将试验体系继续放置于二氧化碳培养箱中培养，轻微震荡培养或定期进行摇晃，使接受液中物质分布均匀；

（7）按照研究方案，选取合适的时间段定期取出0.5~1 ml接受液用于测定被研究物质含量，并及时补足接受液体积；

（8）充分清洗transwell培养小室、定量环及皮肤表面残留的受试物；根据化合物特性进行测定，回算出未透皮吸收量；

（9）使用超声震荡等方式充分提取皮肤组织和transwell小室薄膜中的受试物，进行测定；

（10）结果计算：接收液中的受试物总量、transwell小室薄膜和皮肤组织中的受试物之和为透皮吸收量；回收率应符合规定（透皮吸收量+未透皮吸收量/加样总量×100%）。

实施例4

4.1 基于实施例1和实施例2中制备的重组人3D皮肤模型和实施例2中transwell培养小室的透皮吸收方法，进行的咖啡因透皮吸收试验，具体步骤如下：

（1）从实施例1制备的重组人3D皮肤模型中取1块培养至符合标准的重组人3D皮肤模型，编号为3；从实施例2制备的重组人3D皮肤模型中取1块培养至符合标准的重组人3D皮肤模型，编号为4。另取6孔板并向其中每孔加入2 ml 0.9%无菌NaCl溶液，后将含有重组人3D皮肤模型的transwell小室沿孔壁一侧缓缓放入，确保接收液和transwell培养小室之间无气泡。

（2）将直径为15 mm的无菌玻璃定量环放置在3D皮肤模型中央，测定编号为1和2的经皮电阻值分别为10.28 KΩ和11.59 KΩ。

（3）选取0.3%咖啡因无菌溶液作为受试物，按每孔每平方厘米皮肤表面使用10 µl液体化学品进行计算，取17.67 µl 0.1%咖啡因无菌溶液均匀涂布于定量环中的皮肤上。

（4）将试验体系继续放置于二氧化碳培养箱中培养，轻微震荡培养使接受液Nacl中的受试物分布均匀。

（5）在加样后的1 h、3 h、5 h、7 h、24 h每孔取出1 ml接受液用于测定咖啡因含量，并及时将接受液体积补足至2 ml。

（6）待24小时试验结束后，使用15 ml Nacl溶液充分清洗transwell培养小室、定量环及皮肤表面残留的咖啡因，高效液相测定其含量，用于回算出未透皮吸收量。取10 ml甲醇溶液，超声震荡充分提取皮肤组织和transwell小室薄膜中的咖啡因，高效液相测定含量。

3.2 咖啡因transwell培养小室的透皮吸收实验结果及计算：

实施例4中皮肤模型编号3的咖啡因transwell培养小室的重组人3D皮肤模型的透皮吸收实验结果如图3和图4所示。实施例4中皮肤模型编号4的咖啡因transwell培养小室的重组人3D皮肤模型的透皮吸收实验结果如图5和图6所示。

透皮吸收实验结果汇总如表1所示：

表1

透皮吸收实验结果计算：

按照公式

标准品浓度和标准品吸收峰面积如表2所示：

表2

计算得到皮肤模型编号3和4的皮肤吸收率和回收率如表3所示：

表3

从表3可以看出，将本发明制备的重组人3D皮肤模型用于透皮吸收实验，多块重组人3D皮肤模型对透皮物质的皮肤吸收率和回收率都很高，说明本发明中制备的重组人3D皮肤模型试验结果重复性好、精密度高，适用于透皮吸收试验的进行。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。