一种脂质纳米颗粒组合物以及由其制备的药物递送系统

技术领域

本发明属于生物医药制剂技术领域，尤其涉及一种含有新的脂质化合物的脂质纳米颗粒， 以及由其制备得到的携带活性成分的药物组合物或药物递送系统，比如mRNA疫苗。

背景技术

不同类型的核酸制剂正被研发用于治疗各种重大疾病如传染性疾病、癌症、罕见病等。 该类核酸制剂包括：DNA、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、 小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)等。 其中，mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。基于mRNA修饰 和递送工具的发展，一旦获得病毒抗原序列，可在数周内迅速设计和制造具有临床规模的 mRNA疫苗，可以实现标准化生产，使其在应对大流行暴发方面非常具有吸引力。且mRNA 疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题。在免疫原性上， mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，传递更多有效抗原，并 且能一次表达多个抗原。此外，mRNA只需要穿过细胞膜在细胞质中就可以高效表达抗原蛋 白；mRNA没有基因整合到基因组中的风险。再次，mRNA被翻译成蛋白质后易被降解，其 瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性，而且使其剂量可控，避免了疫苗药物长期 暴露引起的抗原免疫耐受(对特定抗原无反应的状态)。

但是，一方面核酸制剂带负电而且多数分子量较大很难直接进入细胞内，另一方面，RNA 不稳定，在引入体内的过程中极易被核酸酶降解，从而失去生物功能。因此，开发高效安全 并且通用的核酸递送系统，是核酸药物转化过程中亟待解决的问题。

目前，核酸的递送方法包括化学修饰、生物偶联技术、纳米载体技术、基于脂质的制剂、 外泌体、球形核酸、DNA纳米结构、刺激-响应聚合物纳米材料等。其中，较为成熟的核酸递 送载体是脂质纳米颗粒(LNP)，并且2018年LNP包裹的siRNA药物Onpattro(patisiran)获批上 市，2021年LNP包裹的mRNA疫苗已经正式获得FDA审批应用于新冠疫情防控，临床结果显 示出较高的有效性，且目前无严重不良反应。

该类脂质制剂的主要成分包括：阳离子/可电离脂质、辅助型脂质、胆固醇和聚乙二醇- 脂质结合物。在这四种脂质成分中，阳离子脂质带电荷的头部能够与带负电的核酸结合，同 时也能与细胞膜上的磷脂分子结合，在核酸包裹和膜融合过程中都发挥着关键的作用。考虑 到永久性的阳离子脂质的潜在毒性，可电离阳离子脂质的脂质纳米颗粒存在更大的应用价值。

可电离的阳离子脂质包括三个重要的结构组成部分：含胺基的亲水极性头部；疏水脂质 链；负责连接极性头部和非极性尾部的连接链。目前，商业化的可电离阳离子脂质主要有MC3 系列和用于新冠mRNA疫苗的ALC-0315、SM-102。其中，MC3具有很强的肝靶向，对于可能 具有潜在肝毒性的核酸制剂其应用将会受限，而且MC3是针对分子量较小的siRNA递送开发 的，对于分子量较大的核酸制剂其负载量可能存在限制。ALC-0315和SM-102的递送效率需要 进一步提高。因此，为了进一步推进我国脂质制剂的发展及其在核酸药物递送等方面的应用， 我们需要开发出新的可电离的阳离子脂质，并筛选及优化新的纳米递送系统实现核酸的安全、 高效递送，例如实现mRNA疫苗成分安全高效的递送。

发明内容

为解决活性成分，例如核酸(例如mRNA分子)，生物应用时存在的结构不稳定，易被核酸酶降解以及入胞困难的问题，需要开发新的递送技术。此外，现有递送技术中普遍存在溶酶体逃逸差，递送效率较低的问题，本发明基于新合成的可电离阳离子脂质分子，形成多种功能多样性的以脂质为基础的递送系统。

本发明的第一方面，提供一种脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物中含有脂 质纳米颗粒，脂质纳米颗粒中包含：式I的可电离阳离子脂质分子。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物，进一步包含其他脂质分子。所述其他脂质分子 可以是本领域中用于构建脂质纳米颗粒已知或常规使用的脂质分子，包括但不限于中性脂质 分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物，进一步包含活性成分，所述活性成分可以是小 分子化合物、核酸、蛋白质、多肽等。所述活性成分位于脂质纳米颗粒中。所述核酸包括但 不限于DNA、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)等。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物中，脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子 30-60mol％的式I的脂质分子，优选32-55mol％，进一步优选34-46mol％。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物中，脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子 5-30mol％的中性脂质分子，优选8-20mol％，进一步优选9-16mol％。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物中，脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子 30-50mol％的胆固醇类脂质分子，优选35-50mol％，进一步优选37-49mol％。

根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物中，脂质纳米颗粒中可以含有占其总体脂质分子 0.4-10mol％的PEG化的脂质分子，优选0.5-5mol％，进一步优选1.3-2.7mol％。

根据本发明，当活性成分为核酸时，所述脂质纳米颗粒组合物中脂质分子的总质量与核 酸质量之比为5-20:1。

根据本发明，式I的可电离阳离子脂质分子的结构式为

Q为经取代或未取代的直链C2-20亚烷基，所述亚烷基的1个或1个以上C原子任选被独立 地选自O、S和N的杂原子所替换；或，Q为经取代或未取代、饱和或不饱和的4-6元环，所述 4-6元环的环原子任选含有1个或1个以上独立地选自O、S、N的杂原子；所述取代的取代基团 选自卤素、-OH、直链或支链的C1-20烷基、直链或支链的C1-20烷氧基、直链或支链的C2-20 烯基、直链或支链的C2-20炔基、-CH

R

条件是，R

R

R

n选自1～8的整数，m选自0～8的整数，n和m彼此独立，可以相同也可以不同；

当R

在本发明的优选实施方式中，Q为经取代或未取代的直链C2-20亚烷基，所述亚烷基的1 个或1个以上C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；

优选，Q为

优选，Q为

在本发明的一些实施例中，所述饱和或不饱和的4-6元环为哌嗪基或环己基。

在本发明的优选实施方式中，R

在本发明的优选实施方式中，n选自4～8的整数，m选自4～8的整数。

在本发明的优选实施方式中，所述式I化合物为下式A、B、C或D：

其中每个n

其中每个n

其中每个n

其中每个n

在本发明的一些具体实施方式中，所述式I化合物选自表1所示的以下化合物：

表1

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根据本发明，式I的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-60mol％，例 如32-55mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％， 37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％， 47mol％，48mol％，49mol％，50mol％，51mol％，52mol％，53mol％，54mol％，55mol％等。

根据本发明，所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子，例如磷脂酰 胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。

磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示：

中性脂质分子的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰 胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱 (DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、 卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1- 肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1- 硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕 榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰 基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺 (DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。

在一个实施方案中，中性脂质分子可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱 (DSPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。在另一个实施方 案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性脂 质分子可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)。

根据本发明，中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol％，例如 8-20mol％，例如可以为8mol％，9mol％，10mol％，11mol％，12mol％，13mol％，14mol％， 15mol％，16mol％，17mol％，18mol％，19mol％，20mol％。

根据本发明，胆固醇类脂质分子是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质，包括但不限于胆固 醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄 次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇(CHOL)。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥 珀酸酯。

根据本发明，胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-50mol％， 例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％， 48mol％，49mol％，50mol％等。

根据本发明，PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。在一些实施方 案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)、包括包含具有独立 地包含约C4至约C30饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基 团的那些，其中该链可包含一个或多个官能团，诸如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链 长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可还包含一个或多个取代的烷基。 链长可为对称或不对称的。除非另外指明，否则如本文所用，术语“PEG”意指任何聚乙二 醇或其他聚亚烷醚聚合物。在一个实施方案中，PEG部分为乙二醇或环氧乙烷的任选地取代 的直链或支链聚合物。在某些实施方案中，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰 基、羟基或芳基取代。在一个实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或 PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))；或者，PEG部分不包括PEG共聚物，例如其可为PEG单聚物。 在一个实施方案中，PEG的分子量为约130至约50,000，在子实施方案中，为约150至约30,000， 在子实施方案中，为约150至约20,000，在子实施方案中，为约150至约15,000，在子实施 方案中，为约150至约10,000，在子实施方案中，为约150至约6,000，在子实施方案中，为 约150至约5,000，在子实施方案中，为约150至约4,000，在子实施方案中，为约150至约 3,000，在子实施方案中，为约300至约3,000，在子实施方案中，为约1,000至约3,000，并 且在子实施方案中，为约1,500至约2,500。在某些实施方案中，PEG为“PEG 2000”，其平 均分子量为约2,000道尔顿。在本发明的一些实施方式中，PEG在本文中由下式

在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”或者“PEG- 脂质部分”或者“PEG-数均分子量-脂质部分”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰 胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰 胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油 -3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为约130至约 50,000，例如约150至约30,000，约150至约20,000，为约150至约15,000，为约150至约 10,000，为约150至约6,000，为约150至约5,000，为约150至约4,000，为约150至约3,000， 为约300至约3,000，为约1,000至约3,000，为约1,500至约2,500，例如约2000。

在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘 油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、 PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸 乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 -N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇 (DSG-PEG2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基 -3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSA-PEG2000)。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可 为DMG-PEG2000。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSG-PEG2000。在一个实施 方案中，PEG化的脂质分子可为DSPE-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可 为DMA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为C-DMA-PEG2000。在一个 实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分 子可为PEG2000-C11。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C14。在一些实 施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C16。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可 为PEG2000-C18。

根据本发明，PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.4-10mol％， 例如0.5-5mol％，例如可以为0.4mol％，0.5mol％，0.6mol％，0.7mol％，0.8mol％，0.9mol％， 1.0mol％，1.1mol％，1.2mol％，1.3mol％，1.4mol％，1.5mol％，1.6mol％，1.7mol％，1.8mol％， 1.9mol％，2.0mol％，2.1mol％，2.2mol％，2.3mol％，2.4mol％，2.5mol％，2.6mol％，2.7mol％， 2.8mol％，2.9mol％，3.0mol％，3.1mol％，3.2mol％，3.3mol％，3.4mol％，3.5mol％，3.6mol％， 3.7mol％，3.8mol％，3.9mol％，4.0mol％，4.1mol％，4.2mol％，4.3mol％，4.4mol％，4.5mol％， 4.6mol％，4.7mol％，4.8mol％，4.9mol％，5.0mol％等。

在本发明的一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒中含有式C所示的脂质分子，中性脂质 分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子，其中：

式C

中性脂质分子选自式E所示的磷脂酰胆碱类化合物

胆固醇类脂质分子选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯。胆固醇类脂质分子占脂质纳米颗粒 中脂质的摩尔百分比为30-50mol％，优选为35-50mol％，更优选为37-49mol％。

PEG化的脂质分子表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”，所述脂质部分是二酰基甘油 或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、 二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬 脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量 为130～50,000，例如150～30,000，150～20,000，150～15,000，150～10,000，150～6,000，150～5,000， 150～4,000，150～3,000，300～3,000，1,000～3,000，1,500～2,500，约2000。PEG化的脂质分子 占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为0.5-5mol％，优选为1.3-2.7mol％。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸是mRNA。

根据本发明，所述mRNA从5’端至3’端可以包含5’帽结构、5’UTR，开放阅读框(ORF)，3’UTR和poly-A尾。

根据本发明，所述帽结构可以是Cap1结构，Cap2结构或Cap3结构。在本发明的一个实施 方式中，所述帽结构是Cap1结构。

根据本发明，所述5’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的5’UTR或其同源物、片段。在本 发明的一些实施方式中，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:6所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列 至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％， 至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方 式中，所述5’UTR包含SEQ ID NO:6所示的β-珠蛋白的5’UTR核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述5'UTR还包含Kozak序列。在本发明的一个实施方式中， 所述Kozak序列为GCCACC。

根据本发明，所述3’UTR可以包含β-珠蛋白或α-珠蛋白的3’UTR或其同源物、片段，或片 段的组合。在本发明的一些实施方式中，所述3’UTR包含与SEQ ID NO:7所示α2-珠蛋白3’UTR 的片段至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少 96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的另一些实 施方式中，所述3’UTR包含2个首尾相连的与SEQ ID NO:7所示的α2-珠蛋白3’UTR的片段至少 60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少 97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中， 所述3’UTR包含2个首尾相连的SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

根据本发明，所述poly-A尾的长度可以为50-200个核苷酸，优选为100-150个核苷酸，例 如110-120个核苷酸，例如约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸， 约150个核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，所述开放阅读框(ORF)是编码2019-nCov的S蛋白突变体 的开放阅读框(ORF)，其核酸序列是与SEQ ID NO:8所示核苷酸序列至少60％，至少70％， 至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％， 至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。该ORF翻译后的S蛋白突变体的氨基酸序列是由从N 端向C端直接连接的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成。在本 发明的一个具体实施方式中，所述S蛋白突变体的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在本发明的一个实施方案中，所述mRNA包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列至少 60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至 少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方 式中，所述mRNA包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

可采用本领域已知的方法制备本发明的mRNA。在本发明的一些实施方式中，可以人工 合成编码mRNA的核酸序列，将该序列克隆到载体中，构建体外转录用质粒。将构建的质粒 转化到宿主菌中培养扩增，提取质粒。将提取的质粒使用紧邻着polyA尾后面的限制性内切 酶酶切消化成线性分子。以制备的线性化质粒分子为模板，使用体外转录法制备mRNA。可 以在体外转录过程中添加帽结构类似物，直接得到具有帽结构的mRNA；也可以在体外转录 结束后，使用加帽酶和二甲基转移酶给mRNA添加上帽结构。可采用本领域常规的方法纯化 得到的mRNA，例如化学沉淀法、磁珠法、亲和层析法等。

根据本发明，所述mRNA中的一个或多个核苷酸可以是经修饰的。例如，所述mRNA中的一个或多个核苷酸(例如所有核苷酸)可以各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工 合成的核苷酸类似物，例如选自假尿苷(pseudouridine)、2-硫尿苷(2-thiouridine)、5-甲基尿苷 (5-methyluridine)、5-甲基胞苷(5-methylcytidine)、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)、N1-甲基 假尿苷(N1-methylpseudouridine)等。

本发明还提供一种mRNA疫苗，所述疫苗中含有脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中含 有式C所示的脂质分子，中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子和编码2019-nCoV S蛋白突变体的mRNA，所述mRNA包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至 少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列；脂质分子的总质量与mRNA 的质量比为5-20:1；其中：

式C

中性脂质分子选自式E所示的磷脂酰胆碱类化合物

胆固醇类脂质分子选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯。胆固醇类脂质分子占脂质纳米颗粒 中脂质的摩尔百分比为37-49mol％；

PEG化的脂质分子表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”，所述脂质部分是二酰基甘油或 二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二 月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂 酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为 约130至约50,000，例如约150至约30,000，约150至约20,000，为约150至约15,000，为约150 至约10,000，为约150至约6,000，为约150至约5,000，为约150至约4,000，为约150至约3,000， 为约300至约3,000，为约1,000至约3,000，为约1,500至约2,500，例如约2000。PEG化的脂质分 子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为1.3-2.7mol％。

在本发明的一些实施方式中，式C所示的脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的 脂质分子摩尔比为35:15:48.5:1.5。

在本发明的一些实施方式中，式C所示的脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的 脂质分子摩尔比为40:10:48.5:1.5。

在本发明的一些实施方式中，式C所示的脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的 脂质分子摩尔比为45:15:38.5:1.5。

在本发明的一个实施方式中，式C脂质分子为化合物II-37。

在本发明的一个实施方式中，所述中性脂质分子是DOPE和/或DSPC。

在本发明的一个实施方式中，所述PEG化的脂质分子是DMG-PEG2000和/或 DSPE-PEG2000。

本发明还提供式I的可电离阳离子脂质分子的制备方法。

本发明的可电离脂质化合物可以采用本领域已有的方法进行合成，例如，使一当量或一 当量以上的胺与一当量或一当量以上的环氧基封端化合物在合适的条件下反应形成。可电离 脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在25-100℃范围内的较高 温度下进行。可任选纯化制得的可电离脂质化合物。举例来说，可纯化可电离脂质化合物的 混合物，得到特定的可电离脂质化合物。或可纯化混合物，得到特定立体异构体或区域异构 体。所述环氧化物可以商业购买，或者合成制备。

在本发明的一些实施方式中，本发明的可电离脂质化合物可以采用如下的一般制备方法 进行制备。

式A、B、C或D

步骤1：还原

在还原剂的存在下，将化合物A1的羧基还原成羟基以获得化合物A2。还原剂的实例包括 但不限于氢化铝锂、二异丁基氢化铝等。反应所用溶剂的实例包括但不限于醚类(如乙醚、 四氢呋喃和二氧六环等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、 正己烷、苯和甲苯等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。

步骤2：氧化

在氧化剂的存在下，将化合物A2的羟基氧化成醛基以获得化合物A3。氧化剂的实例包括 但不限于2-碘酰基苯甲酸(IBX)、氯铬酸吡啶(PCC)、二氯铬酸吡啶盐(PDC)、戴斯-马丁氧化 剂、二氧化锰等。反应所用溶剂的实例包括但不限于卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷 等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，腈类(例如乙腈等)，及这些溶剂的两种 或以上形成的混合溶剂。

步骤3：卤代-还原

首先在酸性条件下，将化合物A3的醛α-氢与卤代试剂发生卤代反应以获得α-卤代醛中间 体，然后在还原剂存在下，将α-卤代醛的醛基还原成羟基以获得化合物A4。提供酸性条件的 实例包括但不限于DL-脯氨酸。卤代试剂的实例包括但不限于N-氯代丁二酰亚胺(NCS)和N- 溴代丁二酰亚胺(NBS)。还原剂的实例包括但不限于硼氢化钠、氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼 氢化钠。

步骤4：环氧化

将化合物A4在碱的存在下进行分子内的亲核取代反应以获得环氧化合物A5。碱的实例包 括但不限于碱金属的氢氧化物或氢化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢化钠。反应所用溶剂 的实例包括但不限于二氧六环和水的混合物。

步骤5：开环反应

使化合物A5与胺(例如N,N-二(2-氨基乙基)甲胺)发生开环反应以获得最终化合物。反 应用溶剂的实例包括但不限于乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷、己烷、甲苯、乙 醚等。

所述制备方法中的原料A1可以商购也可以采用常规方法合成。

本发明还提供制备脂质纳米颗粒组合物的方法。

根据本发明，所述制备方法，包括：将各脂质分子按摩尔比用有机溶剂溶解制成混合脂 质的溶液，以混合脂质的溶液为有机相，以被递送物(例如核酸)的水溶液为水相，混合有 机相和水相，制备脂质纳米颗粒。可以采用包括但不限于喷雾干燥、单一和双重乳液溶剂蒸 发、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员 熟知的其它方法来制备脂质纳米颗粒。

在一些实施方式中，所述有机溶剂是醇，例如乙醇。

在一些实施方式中，所述有机相和水相的体积比为(2～4):1。

在一些实施方案中，采用微流控平台制备纳米颗粒。

根据本发明，所述制备方法还进一步包括，分离和纯化得到所述脂质纳米颗粒的步骤。

根据本发明，所述制备方法还进一步包括，冻干所述脂质纳米颗粒的步骤。

本发明式I的可电离脂质分子结构中含有两个相邻的顺式双键，使其在后续应用于递送系 统包裹活性物质(例如核酸如mRNA)时，具有较高的包封率，较好的细胞转染率；此外， 在制备脂质纳米颗粒时，得到的脂质纳米颗粒粒径更均匀。本发明的可电离脂质化合物尤其 适合于制备实心结构的纳米颗粒。

此外，对于本发明的mRNA疫苗，由于本发明的mRNA具有高的翻译效率和稳定性，其所编码的S蛋白突变体具有高的稳定性，加之本发明脂质纳米颗粒包封率高、粒径更均匀，具 有较好的细胞转染率，本发明的mRNA疫苗具有高的mRNA包封率、载药量，细胞转染效率，高效和稳定的体内翻译，抗原稳定性，免疫效果好。

本发明中脂质纳米颗粒的粒径范围在1nm到1000nm范围，例如10～500nm，10～200nm等。

本发明的脂质纳米颗粒还可修饰上靶向分子，使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织 或器官。靶向分子可位于颗粒表面上。靶向分子可为蛋白质、肽、糖蛋白、脂质、小分子、 核酸等，其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白(transferrin)、 脱唾液酸糖蛋白(asialycoprotein)、受体配体、唾液酸、适体等。靶向分子可以连接在脂质纳 米颗粒的胆固醇类脂质分子或者PEG化的脂质分子上。

本发明的脂质纳米颗粒组合物和疫苗中，可以进一步含有一种或一种以上医药赋形剂。 术语“医药赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等， 包括但不限于糖，诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉； 纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；明胶；滑石；油，诸 如花生油、棉籽油、红花油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；表面活性剂，诸如吐温80(Tween 80)；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液；着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂等。

在本发明的一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒组合物和疫苗是液体制剂，进一步含有 蔗糖，蔗糖的质量百分比浓度为5-20％，优选为8-10％。

本发明的脂质纳米颗粒组合物和疫苗，可经口、经直肠、静脉内、肌注、阴道内、鼻内、 腹膜内、经颊或以口服或鼻用喷雾等形式投予人类和/或动物。

本发明中的S蛋白突变体是亲本S蛋白发生氨基酸突变产生的。在本发明的一个实施方式 中，所述亲本S蛋白是2019-nCoV B1.351突变毒株的S蛋白，2019-nCoV B1.351突变毒株的S 蛋白与2019-nCoV野生株的S蛋白相比具有以下突变：L18F，D80A，D215G，L242_244L del， R246I，K417N，E484K，N501Y，D614G，A701V(所述位点以SEQ ID NO:1所示氨基酸序 列的位置来定位描述)。

在本发明中，S蛋白突变体和亲本S蛋白的氨基酸位置均以野生型S蛋白的氨基酸序列为描 述依据，野生型S蛋白的氨基酸序列可以在NCBI GeneID:43740568获得，共有1273个氨基酸， 其序列如下所示，在本发明中标示为SEQ ID NO:1。

本发明所述S蛋白突变体至少包含胞外域，其胞外域相对于亲本S蛋白的胞外域包含如下 位置的氨基酸突变：F817P、A892P、A899P、A942P、和KV986_987PP以及将682-685位氨基 酸RRAR突变为GSAS；以及不包含S蛋白的跨膜域和胞质尾；在胞外区的C端直接融合辅助形 成三聚体的结构域T4 Fibritin Foldon Trimerization Motif。所述S蛋白突变体包含从N端向C端 直接连接的SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

本发明上述序列的列表：

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术语说明：

术语“烷基”是指从含有1到30个碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和烃基。 烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、 异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。

术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的烃部分通过去除单个氢原子得到的单价基 团。烯基包括例如例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。

术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的烃通过去除单个氢原子得到的单价基团。 代表性炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。

术语“烷氧基”是指如前文所定义的烷基通过氧原子连接于母体分子。烷氧基的实例包 括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己 氧基。

术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。

术语“饱和或不饱和的4-6元环”是指具有4-6个环原子的环，所述环原子可以是C、N、S、 O，其实例包括但不限于4-6元饱和的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基；4-6元 芳基，例如苯基；4-6元杂环基，例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基等；4-6元杂芳基， 例如三唑基、唑基、异唑基、噻唑基等。在本发明的一些实施例中，所述饱和或不饱和的4-6 元环优选为哌嗪基、环己基。

术语“经取代”(无论前面是否存在术语“任选地”)和“取代基”是指将一个官能团变 为另一个官能团的能力，条件是维持所有原子的价数。当任何特定结构中的一个以上位置可 经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。

“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。 因此，在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或” 旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B； B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

“包括”和“包含”具有相同的含义，旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件 或步骤。当在本文中使用术语“包括”或“包含”时，因此也包括和公开了术语“由......组成” 和/或“基本上由……组成”。

在本说明书和权利要求书中，核苷酸通过其通常接受的单字母代码来指代。除非另有说 明，否则核苷酸序列以5'至3'方向从左向右书写。核碱基在本文中由IUPAC-IUB生物化学命 名委员会推荐的通常已知的单字母符号表示。技术人员将理解，本文公开的密码子中的T碱基 存在于DNA中，而T碱基在相应RNA中将被U碱基取代。例如，本文公开的DNA形式的密码 子-核苷酸序列，例如载体或体外翻译(IVT)模板，其T碱基在其相应的转录mRNA中转录为U 碱基。在这一方面，密码子优化的DNA序列(包含T)和它们相应的mRNA序列(包含U)都被认 为是本公开的密码子优化的核苷酸序列。本领域技术人员还将理解，可以通过用非天然碱基 替换一个或多个碱基来产生等同的密码子图谱。

术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”可互换使用，并且是指连续的核酸序列。序列可以是单链或双链的DNA或RNA，例如mRNA。

“编码…的核苷酸序列”是指编码多肽的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够 指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和多腺苷酸化信号。

在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。除非另有说 明，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左至右书写。

“约”：在整个说明书和权利要求中与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员 熟悉和可接受的准确度区间。通常，这种精确度的区间为±10％。

为了便于参照，本发明的S蛋白突变体使用如下命名规则描述：原始氨基酸:位置:取代氨 基酸。根据该命名规则，例如在第30位天冬酰胺被丙氨酸取代表示为：Asn30Ala或N30A；在 相同位置缺失天冬酰胺表示为：Asn30*或N30*；插入另一氨基酸残基，例如赖氨酸，表示为： Asn30AsnLys或N30NK；缺失连续的一段氨基酸残基，例如缺失氨基酸残基242-244，表示为 (242-244)*或Δ(242-244)或242_244del；如果与其它S蛋白亲本相比，S蛋白突变体含有“缺 失”且在该位置含有插入，则表示为：*36Asp或*36D，表示在第36位缺失同时插入天冬氨酸。 当在给定位置可插入一个或多个可选择的氨基酸残基时，表示为：N30A,E，或N30A或N30E。

同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间的总体相关性，例如，在核 酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间。通常，术语“同源性”意味 着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的背 景下，术语同源性包括同一性和相似性。

在一些实施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的单体 是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换)，聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同 源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。

同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA 分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体单体保守性。例如，可以通过以进行最佳 比较目的比对两个序列来进行两个多核苷酸序列的百分同一性的计算(例如，可以在第一和第 二核酸序列之一或两个中引入空位用于最佳比对和非相同的序列可以对于比较目的放弃。当 比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被认为是等同的。

合适的软件程序可从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列两者的比对。例如， Bl2seq，Needle，Stretcher，Water或Matcher等。

术语“编码区”和“编码区域”是指多核苷酸中的开放阅读框(ORF)，其在表达时产生多 肽或蛋白质。

“可操作地连接”是指两个或更多个分子，构建体，转录物，实体，部分等之间的功能 性连接。

结构域：如本文所用，当提及多肽时，术语“结构域”是指具有一个或多个可识别的结 构或功能特征或性质(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件：(1)从DNA序列产生 mRNA模板(例如，通过转录)；(2)mRNA转录物的加工(例如，通过剪接，编辑，5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将mRNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

术语“蛋白突变体”或“多肽突变体”是指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。 与天然或参考序列相比，氨基酸序列突变体可在氨基酸序列内的某些位置具有置换、缺失和/ 或插入等。通常，突变体与天然或参考序列将具有至少约50％的同一性，至少约60％的同一 性，至少约70％的同一性，至少约80％的同一性，至少约90％的同一性，至少约95％的同一 性，至少约99％的同一性。

附图说明

图1：使用RNA 6000nano chip在2100生物分析仪上分析B1.351mRNA完整性结果。

图2：ELISA法检测核酸转染CHO-K1细胞后上清中S蛋白表达水平。

图3：S蛋白突变体的3D结构图。

图4：ELISA法检测用II-37制成的纳米颗粒包封本发明mRNA转染细胞后上清中S蛋白表 达水平。

图5：II-37和MC3制备的LNP包封本发明mRNA转染细胞后上清中S蛋白表达水平。

图6：以Firefly Luc为报告蛋白，不同的体外转录载体制备的mRNA在细胞内蛋白表达量 的统计图。

图7：本发明S蛋白突变体免疫BALB/c鼠后体内结合抗体的产生情况统计图。图中a为野 生型S蛋白三聚体结果，b为B1.351 mRNA翻译出的S蛋白的三聚体结果，c为空白对照。

图8：编码所述S蛋白突变体的mRNA的脂质纳米颗粒免疫BALB/c鼠后，体内结合抗体和 中和抗体的产生情况统计图。图中d、e、f分别为5μg、1μg、0.2μg mRNA的脂质纳米颗粒(LNP) 免疫后的结合抗体检测结果，图中纵坐标为浓度(μg/ml)；图中g、h、i分别为5μg、1μg、 0.2μg mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)免疫后的中和抗体检测结果，图中横坐标为血清稀释倍 数的log转换值，纵坐标为抑制率％。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实 施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本 发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法 制备。所述实验方法是本领域常规的分子生物学方法，可以参照本领域的分子生物学实验手 册或试剂盒产品说明书的指引进行操作。

实施例1脂质II-37的合成

亚麻油醇(a2)的合成：在0℃下，向950mL四氢呋喃中加入LiAlH

1

(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3)的合成：在室温下，向170mL乙腈中加入亚麻油醇(25.0 g，a2)和2-碘酰基苯甲酸(39.4g)，之后混合物在85℃下搅拌4h。反应液通过布氏漏斗过滤并 用二氯甲烷洗涤滤饼，收集滤液并蒸发浓缩，得到目标产物(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(a3) 24.0g。

1

(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(a4)的合成：在0℃下，向246mL乙腈中加入 (9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醛(43.0g，a3)，DL-脯氨酸(5.62g)和N-氯代丁二酰亚胺，然后在0 ℃下搅拌2h。反应完成后，用无水乙醇(246mL)稀释反应液，再加入硼氢化钠(8.8g)，之后 在0℃下搅拌4h。向反应混合物中加水(120mL)淬灭，并用甲基叔丁基醚萃取，合并有机相后 用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥之后过滤、蒸发浓缩，得到目标产物(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳 -9,12-二烯-1-醇(a4,46g)，直接用于下一步。

1

2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(a5)的合成：在室温下，向450mL1,4-二氧六环 中加入(9Z,12Z)-2-氯代-十八碳-9,12-二烯-1-醇(45g，a4)和氢氧化钠水溶液(120g氢氧化钠溶 于585mL水)，滴加完毕后混合物在35℃下搅拌2h。TLC显示反应完成后，反应液通过分液 漏斗分离，并用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥后过滤并蒸发浓缩，然后通过快速过柱法用石 油醚/乙酸乙酯洗脱来纯化残余物，得到目标产物2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷 (a5)29.11g。

1

II-37的合成：在室温下，向10mL乙醇中加入2-[(7Z,10Z)-十六碳烷-7,10-二烯]环氧乙烷(5 g)和N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(739mg)，之后混合物在90℃下搅拌36h。反应液蒸发浓缩，然 后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化残余物，得到粗产物II-37(4g)。再次通过快速 过柱法用二氯甲烷/甲醇纯化目标产物，得到II-37(2.2g)。

1

ESI-MS：m/z 910.8[M+H]

实施例2B1.351 mRNA的制备及其翻译

1.人工合成能够编码前述SEQ ID No.8所示mRNA的核酸序列，将该序列克隆到pUC57-kana载体的T7启动子后面，所述载体在之前经过改造，已含有能够编码SEQ ID NO:6、 Kozak序列、2个首尾相连的SEQ ID NO:7、polyA尾的序列。编码前述SEQ ID NO:8所示mRNA 的核酸序列克隆在Kozak序列和2个首尾相连SEQ ID NO:7之间的多克隆位点上，构建体外转录 用质粒。

2.将构建的质粒转化到大肠杆菌Dh5a中，培养扩增，提取质粒。

3.将提取的质粒使用紧邻着polyA尾后面的限制性内切酶SpeI酶切消化成线性分子。

4.以制备的线性化质粒分子为模板，使用体外转录法(Thermo公司的体外转录试剂盒 A45975)制备mRNA，所述mRNA的序列如SEQ ID NO:9所示，以下将所述mRNA简称为B1.351 mRNA，由该mRNA翻译后获得的是本发明S蛋白突变体，其氨基酸序列从N端向C端为直接 连接的SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在体外转录结束后，使用加 帽酶和二甲基转移酶给mRNA添加上CAP1的帽结构。

5.mRNA的纯化：得到的mRNA原液使用亲和层析法纯化。

6.mRNA的质控：将制备出来的mRNA，使用RNA 6000nano chip在2100生物分析仪上分析mRNA完整性，结果如图1所示，转录mRNA条带单一，无明显降解。

另外，通过限制性内切酶HindIII和EcoRI从商品化的质粒pCMV3-spike上切下Spike片段， 插入到实施例5的IVT1载体的HindIII和EcoRI位点之间，得到IVT1-spike质粒。再对该质粒进 行点突变，得到IVT1-spike-D614G质粒，以该质粒为模板，体外转录得到spike-D614G mRNA， 表达包含D614G突变的全长S蛋白。

7.B1.351 mRNA细胞水平表达检测：以CHO-K1细胞系为表达体系，使用Lipofectamine Messenger MAX Reagent(Invitrogen,Cat#1168-027)将mRNA转染，培养48h后，收集细胞培 养上清，采用检测S蛋白的酶联免疫法检测试剂盒，检测S蛋白表达水平，以评判mRNA可否 翻译成蛋白。结果如图2所示。图2中，“spike DNA”为商品化的质粒pCMV3-spike(采购自 义翘神州公司)，表达全长野生型S蛋白；“spike-D614G mRNA”为前述表达包含D614G突 变的全长S蛋白的mRNA，“spike B1.351 mRNA”为前述B1.351 mRNA，表达的是本发明所 述的S蛋白突变体，结果表明本发明的mRNA可以在细胞内高表达出S蛋白突变体。

将得到的S蛋白突变体纯化后，采用冷冻电镜进行结构解析，该S蛋白的3D结构如图3所 示，S蛋白突变体为预融合(prefusion spike structure)的稳定结构。B1.351突变毒株的序列和 野生毒株的序列有9个突变位点的差异，其中3个在RBD区域。已经报道的野生毒株的预融合S 蛋白的RBD区域状态主要为1个OPEN、2个CLOSE的结构。本发明的S蛋白突变体的结构主要 为2个OPEN和1个CLOSE的柔性状态。这种结构差异，是病毒与受体ACE2结合能力增强和传 染性增强的结构基础，并且该结构差异，也会导致S蛋白的免疫原性表位的显著差异，从而基 于不同结构诱导的抗体尤其是中和抗体的显著不同。

实施例3包含核酸的脂质纳米颗粒组合物的制备

准确称取化合物II-37、DOPE、CHOL、DSPE-PEG2000、DSPC、DMG-PEG2000等，将 每种脂质于适当容器中，无水乙醇充分溶解备用。

将各脂质按下表中的摩尔比例混合均匀，作为有机相，将核酸(mRNA或DNA)配置成水溶液(以纯水为溶剂)作为水相pH＝4。

有机相与水相体积比例为3:1混合，在微流控平台(如，PNI Ignite)上制备得到脂质纳米颗 粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩 后的液体进行分装。

将制备所得脂质纳米颗粒用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位，用紫外分光光度计结合 RiboGreen RNA试剂盒测包封率(％)，示例性结果如下。

在优化制备工艺后，还能获得理化质控数据更好的脂质纳米颗粒，以II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000的配方结果示例如下表，其中tri-009-BJ-LNP-21040601的脂质摩尔配比为:40:10:48.5:1.5；tri-009-BJ-LNP-21040602的脂质摩尔配比为:35:15:48.5:1.5；tri-009-BJ-LNP-21040603的脂质摩尔配比为:45:15:38.5:1.5。将其中一部分样本按照实施例2 的方式转染细胞CHO，并通过Elisa检测蛋白表达量以评估细胞转染率。

细胞转染结果见图4，图4中，“tri-009-BJ-LNP-21040601”、“tri-009-BJ-LNP-21040602”、 “tri-009-BJ-LNP-21040603”是上述对应配方包载实施例2的B1.351 mRNA，“lipoMax-spike mRNA”是用lipoMax

实施例4II-37和商业化可电离阳离子脂质分子MC3的效果对比

MC3为：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂。

按照实施例3所述的方法，分别使用II37和MC3制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为： II-37:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；MC3:DSPC:CHOL: DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；包载实施例2中B1.351 mRNA。

制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示：

由上表可见，在相同的制备工艺下，II-37制备的脂质纳米颗粒包封率高达90.5％，远高于 MC3的脂质纳米颗粒，并且粒径更小更均一，电位更高。

采用实施例2相同的转染方式，将制备的脂质纳米颗粒转染细胞，了解蛋白的表达情况， 结果如图5所示，II-37(图中以C2表示)制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后，细胞 中蛋白表达量远远高于MC3的，说明II-37制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。

实施例5本发明IVT载体的效率对比实验

本实施例以Firefly Luc为报告蛋白，构建了不同的IVT载体用于在体外转录合成能够翻译 Firefly Luc的mRNA，对比合成的不同序列特征的mRNA的翻译效率。

采用本领域常规的质粒载体构建技术，将Firefly Luc的编码序列克隆到相应载体的多克隆 位点上，得到编号分别为IVT1，IVT2，IVT3和IVT4的载体，之后使用AM1344试剂盒依据前 述载体体外转录制备得到对应的Firefly Luc mRNA样品。

载体IVT1～IVT4均为在商业化载体psp73的基础上改造而来，以下序列在载体psp73酶切位 点XhoI/NdeI处插入，其中IVT1中没有添加UTR序列，polyA尾长度为64个A；IVT2中使用了 SEQ ID NO:6所示的5’UTR和 GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTAC TAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACA TTTATTTTCATTGC的3’UTR序列(β珠蛋白的3’UTR序列)，polyA长度为120个A；IVT3 中使用了SEQ ID NO:6所示的5’UTR和SEQ ID NO:7所示的3’UTR序列，polyA长度为120个A；IVT4中使用了SEQ ID NO:6所示的5’UTR和2个串联重复的SEQ ID NO:7所示的3’UTR序列，polyA长度为120个A。在上述5’UTR和3’UTR的序列中间插入包含常见酶切位点HindIII和EcoRI的多克隆位点，再将Firefly Luc的编码序列克隆到HindIII和EcoRI的多克隆位点中。所有 载体均为金斯瑞公司使用基因合成的方法构建得到。

将每种Firefly Luc mRNA样品以Lipofectamine2000(cat#11668030，购自赛默飞世尔公司) 为转染试剂，转染到CHO细胞中，使用Dual-Lumi

结果如图6所示。图中“DNA”是阳性对照(携带有Firefly Luc的DNA的psicheck2质粒)， “IVT1-Luc”、“IVT2-Luc”、“IVT3-Luc”、“IVT4-Luc”分别代表由IVT1，IVT2，IVT3 和IVT4的载体体外转录得到的对应Firefly Luc mRNA，“Nagative control”为阴性对照。由图 6可见，在相同mRNA的转染量下，IVT4-Luc的蛋白表达量远远高于其他三个mRNA，为其2-3 倍，说明IVT4-Luc的稳定性好且翻译效率高。

实施例6S蛋白突变体免疫原性的测定

使用BALB/c鼠评价S蛋白突变体诱导结合抗体和中和抗体的产生：6周龄雌性BALB/c鼠， 初次免疫及二次免疫间隔2周；免疫14天后采血。ELISA法检测针对S蛋白突变体的结合抗体 的表达，化学发光检测针对S蛋白突变体的中和抗体滴度。

ELISA方法检测结合抗体：通过在酶标板上包被商业化S蛋白捕获免疫小鼠血浆中针对S 蛋白突变体的结合抗体，再用生物素标记的检测抗体进行吸光度检测。化学发光检测针对S 蛋白突变体的中和抗体滴度：免疫后小鼠血浆与携带荧光素酶报告基因的SPIKE慢病毒(中 吉当康；商品名称：SRAS-CoV-2假病毒(B.1.351)-LUC；商品编号：DZPSC-L-0；批次： K05202102)中和后去感染高表达ACE-2的293T细胞(中吉当康；商品名称：“YJ1B09”hACE2-293T cell lines；商品编号：YJ293T-01；批次：A23202001)，用化学发光(Bright-Lumi II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒，品牌：碧云天；商品编号：RG052M)评定血浆的中 和抗体滴度。

对照组共9只小鼠，每只小鼠皮下注射2ug蛋白。其中，3只注射的蛋白为实施例2的B1.351 mRNA翻译出的S蛋白的三聚体纯化物，3只注射的蛋白为野生型的S蛋白的三聚体，3只注射 的是空白脂质纳米颗粒，脂质纳米颗粒的脂质配方是实施例3中tri-009-BJ-LNP-21040602。

实验组共18只小鼠，皮下注射mRNA的脂质纳米颗粒；其中1-6号注射0.2μg mRNA的脂质 纳米颗粒(LNP)，7-12号注射1μg mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)，13-18号注射5μg mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)，其中的mRNA是实施例2的B1.351 mRNA，脂质纳米颗粒的配方是 实施例3中tri-009-BJ-LNP-21040602。

初次免疫及二次免疫后小鼠结合抗体表达水平以及中和抗体水平如图7-8所示。

由图7中的a、b、c可见，实施例2的B1.351 mRNA翻译出的S蛋白三聚体及野生型的S蛋白 三聚体在小鼠体内均可以诱导出抗S蛋白的结合抗体：在实验小鼠中第二次免疫时已经能产生 较高浓度的结合抗体，在二次免疫后8周，所述结合抗体的浓度仍保持较高水平，经计算，二 次免疫后结合抗体浓度在2.2μg/ml左右，二次免疫后8周，仍能维持1.6μg/ml左右。

由图8中的d、e、f可见，二次免疫LNP包裹的mRNA制剂后的小鼠，即使是低剂量(0.2μg) 注射组也可在小鼠体内诱导出抗S蛋白的结合抗体，经计算，结合抗体水平约为0.1-0.3μg/ml。 由图8中的g、h、i可见，二次免疫LNP包裹的mRNA制剂后的小鼠体内诱导出了较好的中和抗 体，中和抗体的GMT值分别为78.69，21.9和72.19。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本 发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 一种脂质纳米颗粒组合物以及由其制备的药物递送系统

<130> CPCN21411053

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 2019-nCoV野生型S蛋白

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Glu Gln

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 辅助形成三聚体的结构域

<400> 3

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1 5 1015

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2025

<210> 4

<211> 3615

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

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