一种呋塞米及其注射液中降解杂质含量测定的控制方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及用一种高效液相色谱法检测呋塞米及其注射液中降解杂质含量的方法，该方法用于检测呋塞米原料及其注射液中光降解杂质M(2-[(呋喃-2-基甲基)-氨基]-4-羟基-3-亚甲基氨基-5-氨磺酰基苯甲酸甲酯)的含量。

背景技术

呋塞米，英文名Furosemide。临床广泛用于治疗与心力衰竭有关的水肿，也可单独或与其他抗高血压药物联合使用治疗高血压。分子式为C

呋塞米及其制剂的储存方式多为避光。稳定性研究过程中也发现呋塞米在光照条件下易降解。呋塞米在光照条件下会产生多种降解杂质。主要其中降解杂质M为其主要光降解杂质之一，尤其在酸性溶液中易产生。降解杂质M的分子式为C

根据国家食品药品监督管理局的要求，应对相关杂质进行控制。根据《化学药品注射剂仿制药质量与疗效一致性评价技术要求》，应重点对制剂的降解产物进行研究包括原料药的降解产物或者原料药与辅料和/或内包材的反应产物。四氢呋喃具有较大的紫外吸收，紫外检测下容易对基线产生影响，形成基线较差的色谱图，影响样品检测。因此本品采用新型的蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器可以很好地支持梯度洗脱，同时可以消除流动相配比变化对基线产生的影响。因此选择采用蒸发光散射检测器。

降解杂质M在呋塞米原料中时降解程度低，在注射剂中更易降解，为在原料中严控此降解杂质的限度。需增加呋塞米的进样浓度。

呋塞米在水中不溶，略溶于乙醇，易溶于四氢呋喃。为增加呋塞米的溶解度，减小溶剂效应对检测的干扰。选择四氢呋喃作为方法的溶剂。

本研究中方法采用液相色谱法，使用蒸发光散射检测器进行控制，操作简单，灵敏度可达20ppm，满足最低的限度要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液相色谱法分离测定呋塞米及其注射剂中光降解杂质M的方法，它采用蒸发光散射检测器进行测定，采用四氢呋喃作溶剂。该方法通过验证能有效达到对降解杂质M的定量检测。从而实现对呋塞米原料及其制剂的质量的有效控制。该方法灵敏度高，专属性强。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种呋塞米及其注射液中降解杂质含量测定的控制方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，以蒸发光散射检测器进行检测，检测条件如下：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格为4.6×250mm，5μm；

流动相：缓冲盐溶液溶液与四氢呋喃；

检测器：蒸发光散射检测器。

所述缓冲盐溶液为甲酸铵溶液、乙酸铵溶液中的一种。

所述缓冲盐溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。

所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min。

所述色谱柱的柱温为30～40℃。

所述检测器的漂移管温度为80～90℃。

所述检测器的气体流速为1.5～2.0L/min。

呋塞米中降解杂质M含量测定的具体方法如下：

一、仪器与试剂

安捷伦1100高效液相色谱仪，四氢呋喃(色谱级)，乙酸铵(分析级)，甲酸铵(分析级)，SATORIOUS分析天平。

稀释剂：四氢呋喃。

缓冲盐溶液：甲酸铵或乙酸铵溶于1000ml水中。

对照品溶液：取杂质M对照品适量，用四氢呋喃定量稀释，摇匀，即得对照品溶液。

二、样品的测定：

(1)原料样品的配制：避光操作。取呋塞米样品适量，精密称定。加入四氢呋喃使溶解后，四氢呋喃定量稀释至刻度，摇匀，即得。

(2)制剂样品的配制：取呋塞米注射液适量(约相当于呋塞米50mg)，用四氢呋喃稀释10倍，摇匀，即得。

(3)色谱条件：

流动相：缓冲盐溶液为水相，四氢呋喃为有机相，进行洗脱。

采用高效液相色谱法测定，蒸发光散射检测器。

(4)专属性试验

在上述色谱条件下，依次分别取空白溶剂、杂质M对照品溶液、呋塞米供试品溶液及注射液供试品溶液及其他各已知杂质溶液，分别进样检测，杂质M与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。空白溶剂、已知杂质及呋塞米峰均不干扰杂质M检测，专属性符合要求。

(5)线性与范围

配制不同浓度的杂质M溶液，范围为定量限至限度浓度200％的溶液。记录杂质M的峰面积。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制线性回归线。得到线性回归方程：y＝64765x-138.95，R

(6)定量限与检测限

在上述色谱条件下，根据色谱峰的信噪比为10:1时的响应浓度确定定量限，信噪比为3:1时的响应浓度确定检测限，经过测定杂质M的检测限为0.01μg/ml，定量限为0.04μg/ml。

(7)精密度试验

制备定量限浓度的杂质M对照品溶液一份，按照上述色谱条件连续进样6针，记录峰面积，计算保留时间与峰面积的RSD％值。保留时间的RSD％值为0.5％，小于2％，峰面积的RSD％值为1.8％，小于5％。符合要求。

(8)准确度

称取13份样品，其中1份样品为未加标供试品溶液，按照供试品溶液配制方法正常配制。其他12份分为4组，每组3份。分别按照杂质M定量限浓度、80％、100％、120％的限度浓度进行加标，每种浓度的加标样品平行制备3份。所有样品按照上述色谱条件测定。结果如下：

注：N/A表示不适用。

(9)溶液稳定性

取杂质M对照品溶液与供试品溶液分别于室温、避光条件下放置48小时。测定杂质M的峰面积，计算每个时刻的峰面积与0时峰面积的SD％值。结果为杂质M对照品溶液于室温、避光条件下，48小时内峰面积SD％值为1.6％，小于2％。说明杂质M对照品溶液于48小时内为稳定状态。杂质M对照品溶液在室温、避光条件下可使用48小时。供试品溶液在室温、避光状态下放置48小时，未见杂质M检出。因此可说明供试品溶液在室温、避光状态下，于48小时内为稳定状态。

本方法专属性好、灵敏度高、线性范围宽、溶液稳定性良好，仪器的系统适用性好。为切实可行地测定呋塞米原料及其制剂中的光降解杂质M提供了有效的方法。

本发明具有的积极效果：本发明采用高效液相色谱法、以蒸发光散射检测器进行测定呋塞米光降解杂质M，从而实现了呋塞米及其注射剂中的杂质M的含量测定，最终得以保证呋塞米及其制剂的安全性和有效性。

一、流动相缓冲盐种类及盐浓度的选择

流动相缓冲盐种类在蒸发光散射检测器及被测化合物pKa值的基础上考虑甲酸铵、乙酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵。采用同一摩尔浓度的盐溶液对同一光破坏样品溶液进行检测。通过试验表明，甲酸铵、乙酸铵可作为呋塞米光降解杂质M的流动相缓冲盐。在此两种盐基础上通过考察不同浓度对呋塞米光降解杂质的检出情况，选择0.1～0.2mol/L甲酸铵或乙酸铵溶液的缓冲盐溶液作流动相，具体试验检出情况如下：

盐浓度选择试验情况如下：

二、色谱柱柱温、流动相流速及选择

具体的本发明人考察了不同色谱柱柱温及流动相流速下此光降解杂质M的检出情况。具体如下：

由结果可知，所述的呋塞米及其注射液中降解杂质含量测定的分析方法，其特征在于所述色谱柱的柱温为30～40℃、流动相的流速为0.8～1.2ml/min。

三、漂移管温度及气体流速的选择

具体的本发明人针对蒸发光散射检测器的特点，对漂移管温度及气体流速进行了筛选，具体如下：

由结果可知所述蒸发光散射检测器的检测条件中，漂移管温度为80～90℃、气体流速为1.5～2.0L/min。

附图说明

附图1：呋塞米结构式图。

附图2：杂质M结构式图。

附图3：根据本发明实施例1得到的杂质M对照品溶液色谱图。

附图4：根据本发明实施例1得到的呋塞米供试品溶液色谱图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不作为对本发明保护范围的限制。

实施例1

仪器高效液相色谱仪：安捷伦，1100，蒸发光散射检测器。

色谱柱：Thermo HYPERSIL BDS C

流动相：以缓冲盐溶液为水相(称取7.7g乙酸铵于1000ml水中)；以四氢呋喃为有机相。

洗脱梯度：

流速：1.0ml/min。

柱温：30℃。

漂移管温度：90℃。

气体流速：2.0L/min。

进样体积：20μl。

稀释剂：四氢呋喃。

样品溶液的配制：取杂质M对照品溶液适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约为10μg的溶液，作为对照品溶液；取本品50mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并后定容至刻度，作为供试品溶液。

精密量取对照品溶液及供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图分别见附图1及附图2。按外标法计算，杂质M为未检出。

实施例2。

仪器：同实施例1。

色谱柱：HILIC C

流速：1.2ml/min。

柱温：40℃。

漂移管温度：85℃。

气体流速：1.8L/min。

洗脱梯度、进样体积及稀释剂同实施例1。

流动相：以缓冲盐溶液为水相(称取11g乙酸铵于1000ml水中)；以四氢呋喃为有机相。

样品溶液的配制：取杂质M对照品溶液适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约为20μg的溶液，作为对照品溶液；取呋塞米注射液5ml，置10ml量瓶中，稀释剂定量稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取对照品溶液及供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计，杂质M的含量为0.005％。