甲氧基尿石素A酰胺类衍生物的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体为甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物在制备预防机体衰老药物中的应用。

背景技术

衰老是指有机体的各组织、器官等随着年龄的增长发生一系列退行性改变的过程。线粒体自噬功能障碍、基因组的不稳定性，端粒酶的缩短，蛋白质稳态平衡失调，细胞衰老等特征都与衰老有着必不可少的联系。由于大多数神经退行性疾病的发病率也会随着年龄的增长增加，较目前现有药物来说，神经退行性疾病的有效治疗药物只是处于缓解症状的阶段且毒副作用较大，因此开发能够治疗和预防神经退行性疾病的药物尤为迫切。

目前针对筛选抗衰老的模型包括D-半乳糖所致的亚急性大鼠衰老模型、β淀粉样蛋白致衰老模型、快速老化的模型小鼠、自然衰老鼠模型、鱼类衰老模型和果蝇衰老模型等都被广泛应用于抗衰老实验中。而线虫作为模式生物，在衰老方面有着其他实验生物都不具备的优点：秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)作为一种模式生物，在20℃营养丰富的条件下从卵发育为成虫仅需3天，其基因与人类的相关基因具有60％-80％的高度保守性，其实验结果对人类预防抗衰老的效果起到重要的提示作用；其生长周期短，短期内可使用大量的样本量线虫用于实验，实验结果可信；使用线虫在神经退行性疾病的研究中，容易获得理想的疾病缺陷型体系模型，其身体透明，易于表型特征的观察和检测，具有完整的神经、运动和生殖系统，细胞间的相互协调作用使得线虫构成了前进、后退、群体趋向性等丰富的运动行为，使得在有关疾病的模型研究中很容易对线虫在遗传学和药理学上进行操作，为对于预防和探索神经退化性疾病的发病机制和治疗方法具有重要意义。

鞣花单宁是目前存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物，鞣花酸经过人体经肠道菌群代谢后成为尿石素，尿石素具有抗氧化、抗炎、抗癌、调节肠道菌群、抗衰老等生物活性。

尿石素是鞣花单宁的代谢产物，在化学结构上，尿石素是鞣花酸失去一个内酯环，并逐步脱去羟基的过程。甲氧基尿石素A是通过分离、纯化和干燥后得到化合物，专利号CN113387916公开了甲氧基尿石素酰胺类衍生物的制备方法。经查阅资料，目前还未发现甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物在抗衰老方面应用的报道，将甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物作为抗衰老的成分进行应用具有重大的现实意义。

甲氧基尿石素A及酰胺类衍生物命名和化学结构如下：

8UA：

甲氧基尿石素A

1：

N-环己基-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺2：

N-(2-羟基苄基)-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺

3：

N-(环丁基甲基)-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺

4：

N-苄基-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺

5：

2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-N-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)乙酰胺

6：

2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺

7：

N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺

8：

2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)乙酰胺

9：

N-己基-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺

发明内容

在上述背景下，本发明公开了甲氧基尿石素A及其酰胺类衍生物的抗衰老作用，其目的在于提供甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物在抗衰老药物制备方面的新用途。

为了实现上述发明的目的，本发明采取了如下的技术方案。

甲氧基尿石素A酰胺类衍生物的应用，所述甲氧基尿石素A酰胺类衍生物为如下两种化合物，

2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺

N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺；所述两种化合物用于制备干预防机体衰老药物。

甲氧基尿石素A酰胺类衍生物的应用，所述两种化合物用于制备干预预防神经退行性疾病的药物。

甲氧基尿石素A酰胺类衍生物的应用，所述两种化合物用于制备干预延长线虫寿命的药物。

甲氧基尿石素A酰胺类衍生物的应用，所述两种化合物用于制备干预防线虫肌肉损伤的药物。

进一步地，所述的线虫为秀丽隐杆线虫。

进一步地，所述两种化合物75μM时，抗衰老效果明显。

本发明的技术方案具有以下优点：

1、在较低的剂量和浓度下，能观察到甲氧基尿石素A酰胺衍生物比甲氧基尿石素A对秀丽隐杆线虫的寿命具有明显的延长作用，能够延缓秀丽隐杆线虫的衰老过程；该方法操作简单，效果优势。

2、秀丽隐杆线虫的运动行为和应激能力再次表明了甲氧基尿石素A酰胺衍生物具有明显的延长寿命的效果，进而延缓衰老，对深远的医学应用具有良好的应用价值和意义。

3、本发明为甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物在抗衰老药物中的应用提供了一定的理论依据，为今后药品的开发奠定了良好的基础。

附图说明

图1为不同浓度甲氧基尿石素A作用下对线虫健康寿命的影响。其中，(a)为不同浓度的甲氧基尿石素A线虫生存曲线(b)为不同浓度的甲氧基尿石素A线虫平均寿命。

图2为75μM甲氧基尿石素A及酰胺类衍生物作用下对线虫寿命的影响。其中(a)为75μM的甲氧基尿石素A线虫生存曲线(b)为75μM N环己基2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(c)为75μM N(2羟基苄基)2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(d)为75μM N(环丁基甲基)2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(e)为75μM N苄基2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(f)为75μM 2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧基)N((5甲基呋喃2基)甲基)乙酰胺线虫生存曲线(g)为75μM 2((8甲氧基6氧代6H苯并[c]苯并吡喃3基)氧)N(吡嗪2基甲基)乙酰胺线虫生存曲线(h)为75μM N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(i)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)乙酰胺线虫生存曲线(j)为75μM N-己基-2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(k)为75μM甲氧基尿石素A平均寿命(l)为75μM甲氧基尿石素A和酰胺衍生物线虫平均寿命。

图3为第4，8，12天75μM甲氧基尿石素A及6，7酰胺衍生物对线虫运动行为的影响。其中(a)为第4天75μM甲氧基尿石素A身体弯曲(b)为第4天75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺身体弯曲(c)为第四天75μM甲氧基尿石素A头部摆动(d)为第四天75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺头部摆动(e)为第8天75μM甲氧基尿石素A身体弯曲(f)为第8天75μM2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺身体弯曲(g)为第8天75μM甲氧基尿石素A头部摆动(h)为第8天75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺头部摆动(i)为第十二天75μM甲氧基尿石素A身体弯曲(j)为第十二天75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺身体弯曲(k)为第十二天75μM甲氧基尿石素A头部摆动(l)为第十二天75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺头部摆动。

图4为75μM甲氧基尿石素A及6，7酰胺衍生物对线虫氧化应激能力的影响。其中(a)为75μM甲氧基尿石素A氧化应激生存曲线(b)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺氧化应激生存曲线(c)为75μM N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺氧化应激生存曲线(d)为75μM甲氧基尿石素A氧化应激平均寿命(e)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺氧化应激平均寿命。

图5为75μM甲氧基尿石素A及6，7酰胺衍生物对线虫重金属能力评估的影响。其中(a)为75μM甲氧基尿石素A重金属生存曲线(b)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺重金属生存曲线(c)75μM N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺重金属生存曲线(d)为75μM甲氧基尿石素A重金属平均寿命(e)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺重金属平均寿命。

图6为75μM甲氧基尿石素A和6，7酰胺衍生物对线虫学习记忆能力的影响。其中(a)为75μM甲氧基尿石素A学习记忆(b)为75μM 2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺和N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺学习记忆。

图7为甲氧基尿石素A和6，7酰胺衍生物对大肠杆菌生长状态的影响。其中(a)为甲氧基尿石素A对大肠杆菌生长的影响(b)为2-((8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧)-N-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺对大肠杆菌生长曲线的影响(c)为N-(3，5-二氟苄基)-2-(8-甲氧基-6-氧代-6H-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺对大肠杆菌生长曲线的影响。

图8为甲氧基尿石素A及6，7酰胺衍生物学习能力实验图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

1、实验材料与试剂

试验中所属的秀丽隐杆线虫株系和大肠杆菌op50均购自于Caenorha bd itisGenetics Center(CGC)；

秀丽隐杆线虫株系：野生型N2

甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物：合成于常州大学

百草枯购自西格玛奥德里齐贸易有限公司，其他试剂均购自于上海生工有限公司

NGM培养基：3g Nacl，2.5g胰蛋白胨，17g琼脂，磷酸缓冲液25ml，蒸馏水975ml，灭菌121℃、20min，待温度降至50℃-70℃左右，过膜除菌后，加入5mol/L的胆固醇溶液1mL，1mol/L的无水MgSO

100mMNaCl:NaCl 5.85g，蛋白胨2.5g，琼脂17g，蒸馏水1L。

LB培养基配制：

①液体培养基：分别称取蛋白胨、酵母提取物和NaCl 10g、5g和10g，加入蒸馏水定容至1L，121℃，20min灭菌后4℃冰箱备用。

②固体培养基：分别称取蛋白胨、酵母提取物、NaCl和琼脂粉10g、5g、10g和17g，加入蒸馏水定容至1L，121℃，20min灭菌后倒平板，待凝固后4℃冰箱备用。

M9缓冲液：Na

1mg/mLMgSO

1mg/mLCaCl

5mol/L胆固醇溶液：取0.25g胆固醇溶解于50mL无水乙醇中，使用针式滤器无菌过膜备用。

50％甘油：100％甘油5mL于5mL蒸馏水中121℃、20min灭菌，待冷却后放于4℃冰箱中备用。

线虫冻存液：NaCl 0.3g，KH

2、方法

实施例1:甲氧基尿石素A及尿石素酰胺类衍生物延长秀丽隐杆线虫寿命

试验药物：

阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

寿命实验：

采用同步化的L4期线虫20℃进行恒温培养。溶剂对照组为0.1％DMSO，阳性对照组为10-100μM甲氧基尿石素A。从转移时刻起即可计数，转入当天记为寿命实验第0天。每日记录线虫的存活、死亡和丢失数目，得到各组平均寿命，并对数据进行生存分析。

甲氧基尿石素A与其酰胺衍生物寿命实验：

甲氧基尿石素A作为对照，与其酰胺类衍生物在最佳浓度下进行对比，每日记录线虫的存活、死亡和丢失数目，得到各组平均寿命，并对数据进行生存分析。

结果分析：

结果如图1是10μM-100μM甲氧基尿石素A对线虫寿命的影响。以10μM、25μM、50μM、75μM、100μM作为不同浓度的给药组，同时以0.1％DMSO为对照组，进行寿命试验。结果显示75μM的甲氧基尿石素A延长了野生型线虫平均寿命，使得生存曲线右移。其中从图1可知75μM的N2线虫平均均寿命达14.10％，图2中6,7酰胺衍生物与甲氧基尿石素A相比，高于阴性对照16.54％和14.81％，且从图中可以看出6，7酰胺衍生物比甲氧基尿石素A延长了线虫的寿命时间，本实例说明甲氧基尿石素A可以延长秀丽隐杆线虫的寿命，在75μM的剂量下，甲氧基尿石素A抗衰老效果显著的提高了线虫的寿命，但是提高程度低于6，7酰胺衍生物。

实施例2：甲氧基尿石素A及酰胺衍生物提高了线虫运动能力

试验药物：阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

实验方法：

运动能力测定：

采用同步化培养至L4期的线虫给药干预第四天，第八天和第十二天。用M9缓冲液取10条线虫放置在空白的NGM培养基上，待其恢复1min后，记录1min内头部摆动的次数和20s内身体弯曲次数。

结果分析：

给药干预的第四天，第八天和第十二天的线虫20s内身体弯曲的次数和1min内头部摆动的次数如图3所示。75μM的甲氧基尿石素A分别在第四天，第八天和第十二天线虫的身体弯曲次数和头部摆动次数较对照组有较好的提高，同时如图3所示6，7酰胺衍生物与甲氧基尿石素A对比具有明显的提高效果。本实例说明6，7酰胺衍生物比甲氧基尿石素A能够提高线虫的运动能力，使得其健康状况有所改善，侧面的反应了其具有抗衰老的效果。

实施例3：甲氧基尿石素A及酰胺衍生物提高了线虫的应激能力

试验药物：阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

实验方法：

(1)百草枯氧化应激：采用同步化后培养基至L4期的线虫给药48h后，将其转移至160mM浓度百草枯的液体培养基中，每隔1h记录线虫的死亡数和存活数。

结果分析：

给药干预48h的线虫氧化应激结果如图4所示。结果显示，75μM甲氧基尿石素A给药组线虫氧化应激平均寿命较对照组提高了11.68％。6,7酰胺衍生物与甲氧基尿石素A相比，分别高于阴性对照为49.06％，17.43％，同时从图中可看出6，7酰胺衍生物提高了线虫应激能力的生存时间，本实例结果说明6，7酰胺衍生物比甲氧基尿石素A提高了线虫的应激能力，具有抗衰老作用。

实施例4：甲氧基尿石素A及酰胺衍生物提高了线虫的抗重金属性

试验药物：阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

实验方法：

采用同步化L4期线虫给药48h，48h后加入终浓度为180μM的氯化铜溶液，此后每过一天记录一次线虫的存活数量，直至线虫全部死亡。

实验结果：

给药48h后的线虫的抗重金属性如图5所示。结果显示75μM的甲氧基尿石素A的平均寿命较对照组相比提高了6.75％，6，7酰胺衍生物与甲氧基尿石素A相比，分别高于阴性对照19.07％，13.64％。本实例的结果说明6，7酰胺衍生物比甲氧基尿石素A具有更好的抗重金属能力的效果。

实施例5：甲氧基尿石素A及酰胺类衍生物提高了线虫的学习能力

试验药物：阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

实验方法：

化学趋向性能力测定

采用同步化的L4期线虫分别暴露于实验组和对照组72h，配制100mM Nacl培养基高温高压灭菌，将线虫M9冲洗2-3次至新的培养基中饥饿培养4h。用软木钻孔器分别钻取空白培养基以及含有100mM NaCl的培养基于测试板中过夜14h，形成趋化板，将待测的线虫转至测试板中，测试板如图8所示：在距离平板两端0.5cm处用软木钻孔器钻取空白NGM和100mM NaCl空白NGM分别作样品和对照的标记，使两点标记与圆心点成一条直线。在圆心两侧2cm的位置画两条直线。测试前加入0.5mol/L的NaN

结果分析：

甲氧基尿石素A及6，7酰胺衍生物学习能力如图6所示。可见对照组的学习能力为0.023，75μM甲氧基尿石素A学习能力为0.1，6，7酰胺类衍生物学习能力为0.28，0.17。结果表明，75μM甲氧基尿石素A及其6，7酰胺衍生物可使成年线虫第四天的学习能力有较显著的提高。

实施例6：75μM尿石素酰胺类衍生物对大肠杆菌生长状态的影响

试验药物：阴性对照配制0.1％DMSO。

阳性对照甲氧基尿石素A及其酰胺衍生物，溶于0.1％DMSO，配制成储备液。

实验方法：

配制高压灭菌后的LB液体培养基，处理如下：1、空白组2、加入op50 3、加入甲氧基尿石素A及其6、7酰胺衍生物4、加入op50及甲氧基尿石素A及其6、7酰胺衍生物。以空白组为对照，先测加入氧基尿石素A及其6、7酰胺衍生物组，而后将另外两组放到37℃摇床中，于390min内，每隔30min测其再OD595处的吸光度并记录绘制大肠杆菌OD值生长曲线。

结果分析：

图7是75μM甲氧基尿石素A及其6，7酰胺衍生物对大肠杆菌生长状态的影响。如图7所示，加入75μM甲氧基尿石素A及其6，7酰胺衍生物LB液体培养基中OP50生长曲线与未加入给药组的LB液体培养基中OP50生长曲线相似，本实例结果说明75μM的甲氧基尿石素A及其6，7酰胺衍生物的寿命延长效应与其抗微生物的效果和食物的可用性无关。