一种富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌多糖制备领域，具体的说涉及一种提取鹿茸菇中β-葡聚糖的方法。

背景技术

鹿茸菇，学名荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)，又名何叶菇、荷叶蘑，是食药兼用的大型野生优良真菌，在欧洲被称为“Fried chicken mushroom“。鹿茸菇含有高蛋白质和多种氨基酸以及B1、B2、C族等维生素，具有很高的营养价值和特殊的药用效果。多糖是鹿茸菇的主要活性成分之一，尤其是鹿茸菇中的β-葡聚糖，长期食用具有增强免疫、抗肿瘤和降血压等的功效。

目前关于鹿茸菇子实体多糖提取方法的研究较少，多使用传统的热水提取，方法比较单一，且存在提取得率和多糖含量均不高，尤其是β-葡聚糖含量较低的问题。因此，需要提供一种效率更高的提取鹿茸菇中β-葡聚糖的方法。

发明内容

本发明提供了一种富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)鹿茸菇子实体烘干后粉碎过筛40-60目；

(2)将粉末使用蒸汽爆破仪器进行处理，其条件为压力1.5-2.5MPa，保压时间30-90s；

(3)将其蒸汽爆破后的原料烘干，粉碎过筛40-60目后加入水进行浸提，加入转子，温度为80-100℃，在磁力搅拌器上提取1-3h；离心(4000r/30min),留上清液；

其中鹿茸菇粉末与水的质量体积比为1g：20mL；上述步骤可重复两次后合并上清液；

(4)将上清液使用旋转蒸发仪旋蒸后收集浓缩液，添加乙醇至溶液中乙醇的质量浓度为70-80％时停止加入乙醇进行醇沉，静置12-24小时后离心(4000r/30min)留沉淀；

(5)将上述沉淀物加水复溶后冻干为富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖，复溶温度为60℃。

本发明还提供了由上述制备方法制备得到的富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖。

本发明提供的鹿茸菇多糖中富含β-葡聚糖，制备方法具有无化学残留、生态环保、生产效率高等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1对比例和实施例1的鹿茸菇子实体多糖免疫活性比较

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料

鹿茸菇(Lyophyllum decastes)子实体(江苏菇本堂生物科技有限公司)

主要试剂

硫酸、乙醇等购自上海国药集团化学试剂有限公司；HEK-Blue

实施例1

制备鹿茸菇中多糖，包括以下步骤：

(1)鹿茸菇子实体烘干后粉碎过筛40-60目；

(2)将粉末使用蒸汽爆破仪器处理，其条件为压力2.0MPa，保压时间60s；

(3)将其蒸汽爆破后的原料烘干，粉碎过筛40-60目后加入水进行浸提，加入转子，温度为90℃，在磁力搅拌器上提取2h；离心(4000r/30min),留上清液；

其中鹿茸菇粉末与水的质量体积比为1g：20mL；上述步骤可重复两次后合并上清液；

(4)将上清液使用旋转蒸发仪旋蒸后收集浓缩液，添加乙醇至溶液中乙醇的质量浓度为75％时停止加入乙醇进行醇沉，静置24小时后离心(4000r/30min)留沉淀；

(5)将上述沉淀物加水复溶后冻干为富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖，复溶温度为60℃。

对比例

(1)鹿茸菇子实体烘干后粉碎过筛40-60目；

(2)将鹿茸菇子实体粉末中加入水进行浸提，加入转子，温度为90℃，在磁力搅拌器上提取2h；离心(4000r/30min),留上清液；

其中鹿茸菇粉末与水的质量体积比为1g：20mL；上述步骤可重复两次后合并上清液；

(3)将上清液使用旋转蒸发仪旋蒸后收集浓缩液，添加乙醇至溶液中乙醇的质量浓度为75％时停止加入乙醇进行醇沉，静置24小时后离心(4000r/30min)留沉淀；

(4)将上述沉淀物加水复溶后冻干为富含β-葡聚糖的鹿茸菇多糖，复溶温度为60℃。

实施例2

(1)鹿茸菇多糖得率

多糖得率(％)＝冻干沉淀物重量/提取原料重量×100％

多糖得率比较结果(表1)显示，对比例中鹿茸菇子实体多糖得率仅为9.88％，实施例1中的多糖得率达到了19.64％，比对比例提高了98.8％，说明蒸汽爆破处理有效提高了鹿茸菇子实体多糖得率。

表1鹿茸菇子实体蒸汽爆破处理前后多糖得率对比

(2)多糖含量检测

分别称取冻干后的鹿茸菇多糖适量粉末溶解，采用苯酚硫酸法对其总糖含量进行测定。具体方法为：配置5％的苯酚溶液、浓硫酸、0.1mg/mL葡萄糖标准溶液(美国Sigma-Aldrich公司)。取葡萄糖标准品溶液(浓度为0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)和样品测定液1mL分别置于长试管中，加0.5mL5％的苯酚溶液、2.5mL浓硫酸，混匀，置于100℃水浴15min，取出冷却至室温，取200μL于酶标板中，490nm下测定吸光度值。根据葡萄糖标准品的浓度和对应吸光度值绘制标准曲线，计算总糖含量。

鹿茸菇多糖中还原糖含量按照DNS法进行测定。具体方法为：配制DNS试剂、1mg/mL葡萄糖标准溶液、样品测定液。取葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL至于25mL容量瓶中，加水补足至2mL(葡萄糖标准品浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/mL)；取2mL样品测定液至于25mL容量瓶中；加分别加入5mLDNS试剂，至于100℃水浴5min，冷却，定容至25mL，摇匀，取200μL到酶标板中，在520nm下测定吸光度值，根据葡萄糖标准品浓度和对应的吸光度值绘制标准曲线，计算还原糖含量。

多糖含量计算公式如下：

多糖含量(％)＝总糖含量(％)-还原糖含量(％)

多糖含量比较结果(表2)显示，对比例所得多糖组分的多糖含量为27.77％，而实施例1所得多糖组分中的多糖含量达到75.29％，比对比例提高了170％，说明蒸汽爆破处理有效促进了鹿茸菇子实体多糖的释放，提高了所得多糖组分中的多糖含量。

表2鹿茸菇子实体蒸汽爆破处理前后所得多糖组分中多糖含量对比

(3)鹿茸菇多糖中β-葡聚糖含量检测

β-葡聚糖的含量参考蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒(爱尔兰Megazyme公司)测得A.测定葡聚糖总量(α-葡聚糖+β-葡聚糖+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖)

a.总葡聚糖(α-葡聚糖+β-葡聚糖)+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖的溶解和部分水解

1.称量多糖90mg到50mL离心管中。轻拍，使样品落入试管底部中。

2.向每个管中加入2.0mL冰的浓硫酸，盖上盖子，用涡旋仪混合器强力混匀。放置在冰水浴中2h，在这期间，每隔10-15分钟混匀一次。

3.向每个管中加入4mL水，盖上盖子，涡旋10s。然后加入6mL的水，盖上盖子，涡旋10s。

4.将盖子拧松，置于100℃沸水浴中5min之后，拧紧盖子，继续孵育2h。5.

将反应管冷却至室温，小心松开盖子。

6.转移每管中的内容物至100mL容量瓶，用200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)漂洗试管。

7.加入6mL的8MNaOH溶液到容量瓶中，用200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容，混匀。

8.取1.5mL于2mL离心管中离心，13000rpm，5min，上清液即为测定液。

b.总葡聚糖+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖的测定。

1.取测定液0.1mL加至玻璃试管(16×100mm)底部，每个样品(样品、质控物)/标准品/空白对照做3-4个平行样。

2.取0.1mL溶于200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中的1,3-β-葡聚糖外切酶(20U/mL)和β-葡糖苷酶(4U/mL)，至每一个试管底部，涡旋混匀，40℃孵育1h。

3.每管加GOPOD试剂3.0mL，40℃孵育20min。4.510nm下测定吸光度值。

B.α-葡聚糖(植物糖原和淀粉)和蔗糖中的D-葡萄糖及游离D-葡萄糖的测定α-葡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖及游离D-葡萄糖的溶解，水解

1.称量多糖100mg到50mL离心管中。轻拍，使样品落入试管底部中

2.向每个试管中加入8mL1.2M的醋酸钠缓冲液(pH3.8)，混匀。立即加入0.2mL淀粉葡糖苷酶(1630U/mL)加转化酶(500U/mL)，混匀，并放入40℃水浴孵育。

3.40℃孵育30min，期间用涡旋器间歇混匀。

4.对于α-葡聚糖含量>10％的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶，并定容至100mL，混匀。以单位体积离心溶液，13000rpm，10min或用WhatmanNO.1滤纸过滤(9cm)。

5.对于α-葡聚糖含量<10％的样品，直接离心13000rpm，10min(无需稀释)。对于这些的样品，试管里的最终体积大约为10.3mL(体积可能会变化，样品类型不同，体积可能会稍稍变化)，在计算公式内，要注意及时变化。

6.取0.1mL稀释的或非稀释的上清液(样品、质控物)、0.1mL标准品、0.1mL醋酸钠缓冲溶液至玻璃试管(16×100mm)，每个样品做3-4个平行。

7.取0.1mL醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)+3.0mLGOPOD试剂，至每一个试管底部，涡旋混匀，40℃孵育20分钟。9.5 10nm下测定所有管中的吸光度值。

计算公式如下：

总葡聚糖含量(％)＝ΔE×F×90/W

α-葡聚糖含量(％)＝ΔE×F×9.27/W

β-葡聚糖含量(％)＝总葡聚糖含量-α-葡聚糖含量

其中：ΔE：反应吸光光度值减去空白试剂的吸光光度值F：吸光光度值转换为葡萄糖(μg)的因子＝100/100μg D-葡萄糖在510nm下的吸光光度值

W：样品重量mg

β-葡聚糖含量比较结果(表3)显示，对比例中鹿茸菇子实体多糖的β-葡聚糖含量为13.89％，而实施例1中鹿茸菇子实体多糖的β-葡聚糖含量达到36.73％，比对比例提高了160％，说明蒸汽爆破处理有效提高了鹿茸菇子实体中β-葡聚糖的释放，从而提高了对应多糖组分中β-葡聚糖的含量。

表3鹿茸菇子实体蒸汽爆破处理前后多糖中β-葡聚糖含量对比

(4)鹿茸菇子实体多糖通过Dectin-1受体结合激活NF-κB途径增强免疫活性测定

试剂配制：(1)生长培养基：DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Invitrogen公司)，100U/mL青霉素(美国Sigma-Aldrich公司)和100μg/m链霉素(美国Sigma-Aldrich公司)，100μg/mL Normocin(美国InvivoGen公司)。(2)选择培养基：取50mL完全培养基，加入200μL HEK-Blue CLR Selection(美国InvivoGen公司)中，4℃条件下保存。(3)检测培养基：将HEK-Blue Detection(美国InvivoGen公司)溶于50mL无菌水，4℃避光条件下保存。

细胞培养：用DMEM完全培养基培养HEK-Blue hDectin-1a细胞株(美国InvivoGen公司)，两代后在选择培养基中进行培养，培养箱条件均为5％CO

测定方法：取对数生长期的HEK-Blue hDectin-1a细胞，用检测培养基调节其细胞密度为3×10

活性比较结果显示(图1)，对比例的鹿茸菇子实体多糖和实施例1的鹿茸菇子实体多糖均具有一定的激活NF-κB的活性，但活性强弱上有差异。实施例1的富集β-葡聚糖的鹿茸菇多糖活性显著优于对比例的鹿茸菇子实体多糖。