调控玉米早花和矮秆相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控玉米早花和矮秆相关的分子标记及其应用。

背景技术

开花期对于玉米是极为重要的性状，不仅影响玉米的生长区域适应性、对各种逆境的抗性，对于玉米的产量、品质、籽粒脱水速率等性状都具有重要的影响。开花期提前对玉米生产有较大意义：(1)缩短生育期，促进下一茬作物的种植，改变不同作物的轮作模式；(2)缩短营养生长时间，使籽粒灌浆时间延长，促使籽粒饱满，进而提高玉米籽粒产量；(3)提早开花意味着籽粒提早脱水，促使收获时籽粒含水量降低，促进机械化收获玉米籽粒，推动收获方式的变革，提高劳动生产率。玉米开花期调控网络包括四个通路，分别是光周期路径、自主开花路径、赤霉素路径和年龄路径。

合理株型是作物品种高产的重要基础。株高是决定玉米产量的最主要的株型性状之一。矮秆玉米具有抗倒、耐密、适宜机械化生产和群体光能利用率高等特点，适当增加矮秆玉米的种植密度将大大提高玉米产量。目前玉米中虽然已经鉴定到较多影响株高的基因，例如an1,d8,d9,bv1等，但是这些基因突变后的植株极端矮化，影响正常的生长发育，无法直接应用到玉米育种中，因此鉴定株高适度降低的自然等位基因变异是解决玉米矮秆育种的关键。

较多研究表明开花期和株高具有一定相关性，开花期早的材料由于营养生长时间较短，其株高相对较矮。鉴于当前玉米生产上对早花、矮秆材料的需求，开发能有效区分不同玉米自交系开花期和株高的分子标记显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是提供调控玉米早花和/或矮秆相关的分子标记及其应用。

第一个方面，本发明提供了检测玉米基因组中SNP位点275基因型的物质在如下至少一种的应用：

1)鉴定或辅助鉴定玉米开花时间；

2)鉴定或辅助鉴定玉米株高；

3)鉴定或辅助鉴定玉米散粉期；

4)鉴定或辅助鉴定玉米吐丝期；

5)选育早花玉米；

6)选育矮秆玉米；

所述SNP位点275为SEQ ID NO：4的第101位。

上述所述应用中，所述SNP位点275的基因型为AA、CC或AC。

上述所述应用中，所述检测玉米基因组中SNP位点275基因型的物质为A1)或A2)：

A1)成套引物；

A2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；

所述成套引物包括引物1、引物2及引物3；

所述引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1第22-41位所示的序列；

所述引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2第22-41位所示的序列；

所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

上述所述应用中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

第二个方面，本发明提供了如下任一物质：

第一方面中的所述成套引物；

或，含有第一方面中的所述的成套引物的PCR试剂或试剂盒。

所述PCR试剂包括引物1、引物2、引物3、KASP Master mix；

所述引物1、引物2、引物3的配比为12uM：12uM：30uM。

第3个方面，本发明提供了第二方面所述成套引物、PCR试剂或试剂盒在如下至少一种的应用：

1)鉴定或辅助鉴定玉米开花时间；

2)鉴定或辅助鉴定玉米株高；

3)鉴定或辅助鉴定玉米散粉期；

4)鉴定或辅助鉴定玉米吐丝期；

5)选育早花玉米；

6)选育矮秆玉米。

第4方面，本发明提供了如下方法：

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米开花时间和/或株高的方法，为检测玉米基因组中SNP位点275基因型为AA还是CC，

SNP位点275基因型为AA的待测玉米的开花时间早于或候选早于SNP位点275基因型为CC的待测玉米；

或/和，SNP位点275基因型为AA的待测玉米的株高小于或候选小于SNP位点275基因型为CC的待测玉米。

或本发明提供了一种选育早花玉米的方法，为检测玉米基因组中SNP位点275基因型为AA还是CC，选择SNP位点275基因型为AA的玉米进行选育，得到目的玉米。

或本发明提供了一种选育矮秆玉米的方法，为检测玉米基因组中SNP位点275基因型为AA还是CC，选择SNP位点275基因型为AA的玉米进行选育，得到目的玉米；

本发明提供了一种选育早花且矮秆玉米的方法，为检测玉米基因组中SNP位点275基因型为AA还是CC，选择SNP位点275基因型为AA的玉米进行选育，得到目的玉米。

上述各个方法获得的目的玉米具有如下特性：早花和/或矮秆，且正常生长、产量无显著变化。

上文所述方法中，

所述检测玉米基因组中SNP位点275基因型为AA还是CC的方法包括如下步骤：以待测玉米基因组为模板，用第二方面中所述PCR试剂进行KASP反应，获得基因型。

本研究通过利用玉米骨干自交系京2416和京92构建的重组自交系(RIL)群体，通过调查该群体在北京的散粉期、吐丝期、株高、穗位高、产量等性状，鉴定到一个同时影响散粉期、吐丝期、株高、穗位高的主效QTL位点。

扩增京2416和京92在该QTL区域内的序列，在基因组Chr3:161196684位置鉴定到1个关键的SNP，针对这个SNP开发了1对KASP标记即kmads_275。kmads_275的早花、矮秆等位基因为AA，来自于京2416，另一个等位基因为CC，来自于京92。

利用kmads_275标记对239份RIL群体进行检测，发现该标记荧光信号较强，具有较明确的分型。将标记基因型与散粉期、吐丝期、株高、穗位高、单穗粒数和单穗粒重表型对应，发现AA基因型比CC基因型材料在北京散粉期提早1天、吐丝期显著提早1天、株高显著降低14cm、穗位高显著降低10cm，而单穗粒数和单穗粒重表型差异不显著。利用kmads_275标记对42份国内外玉米骨干自交系材料分型，并结合这些材料在辽宁、河南的表型进行分析，发现AA基因型的材料与CC基因型的材料散粉期、吐丝期都显著提早4天，株高显著降低24厘米。因此，SNP位点275基因型及其对应的kmads_275标记可用于判断玉米的开花期和株高状态，作为选育早花或矮秆且不影响正常生长发育和产量的玉米提供基础。

附图说明

图1为RIL群体在北京的散粉期、吐丝期、株高、穗位高、单穗粒重、单穗粒数的QTL定位；横坐标为染色体，纵坐标为LOD值；图中黑色虚线为阈值线，超过该阈值线的即认为存在QTL；箭头所指为散粉期、吐丝期、穗位高和株高共同定位的QTL位点。

图2为kmads_275标记对RIL群体的基因分型结果；X轴为FAM荧光，Y轴为HEX荧光，坐标轴原点的黑色为空白对照，坐标轴上的数值为荧光信号值。

图3为kmads_275标记在42份骨干玉米自交系中的基因分型结果；X轴为FAM荧光，Y轴为HEX荧光；坐标轴原点的黑色为空白对照；坐标轴上的数值为荧光信号值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测玉米株高和开花期的SNP标记的发现及方法的建立

实验材料：

玉米自交系京92和京2416均为北京市农林科学院玉米研究所选育的优良骨干自交系。其中京2416开花期比京92早，且京2416的植株比京92矮。京2416的植物新品种权号为CNA004319G，京92的植物新品种权号为CNA005911G。

以京2416为母本，京92为父本，杂交一次获得F

一、开花期、株高、穗位高性状的获取

将双亲京2416、京92及239份RIL群体种植在北京，每个材料种一行(20株)，记录播种日期，生长期间给与正常的田间管理。各性状的调查方法如下：

散粉期：从播种到每个材料有一半以上植株雄穗有1/3花药开始散粉所需的天数。

吐丝期：从播种到每个材料有一半以上植株雌穗花丝从苞叶吐出2cm所需的天数。

株高：植株主茎从地面到雄穗顶端的高度。每个材料调查10株。

穗位高：植株主茎从地面到最上部有效雌穗(由上而下第一穗)着生节的高度。每个材料调查10株。

单穗粒数：每个果穗的籽粒总数。每个材料选取长势均匀的10个果穗调查。

单穗粒重：每个果穗的晒干后籽粒的总重量。每个材料选取长势均匀的10个果穗调查。

结果如表1所示。

表1为239份RIL群体及其双亲在北京的散粉、吐丝期、株高、穗位高、单穗粒数、单穗粒重表型

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2、开花期、株高、穗位高、单穗粒数、单穗粒重的QTL定位

利用该RIL群体的遗传标记，采用复合区间作图方法，分别对散粉期、吐丝期、株高、穗位高、单穗粒数、单穗粒重进行QTL定位。结果显示(图1)，散粉期、吐丝期、株高、穗位高都在第3号染色体上相同区间定位到一个主效QTL位点，对应玉米参考基因组B73的V5版本的物理位置为160-163Mb。然而单穗粒数、单穗粒重都没有检测到这个QTL位点。表明该QTL只影响散粉期、吐丝期、株高和穗位高。

二、检测开花期和株高的SNP标记的发现

提取了京2416和京92的叶片的基因组DNA，根据参考基因组B73-Ref V5序列设计分段引物扩增了该区段的DNA序列，对PCR扩增产物进行一代测序。测序结果发现Chr3:161196684位置京2416和京92存在差异，该位点在京2416中基因型为A，在京92为C。该位点在京2416和京92的基因型及其上下游100bp的序列如SEQ ID NO：4所示，其中N为A或C；将该位点命名为SNP位点275，该SNP位点275的基因型为AA、CC或AC，该SNP位点为SEQ ID NO：4第101位。

SEQ ID NO：4：

TATTTTTCTGTTAATTATAGCTGACTAAAGAGACATTCTGTTATTTTTCTGATAAATACAGCTGACTAAAGTAT

TTTGCCCCAGAACCGGGATGTAGCTGNTTCAGATTTACAGTCGAGACTTAAGGAGATCGCAACATGGTAACACT

AAGTTTTCACTACTCTCTCCCAACTTTCTATGTTCAATGGTGGCAACAATGTA

三、SNP位点275的KASP分子标记的开发及检测方法的建立

1、KASP分子标记的开发

针对SNP位点275开发了一对KASP标记，命名为kmads_275，该KASP标记的引物信息如表2所示：

表2为KASP引物序列

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在表2中，引物1的5'末端的大写字母为FAM序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，蓝色)，在X轴。引物2的5'末端的大写字母为HEX序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，红色)，在Y轴。

上述引物交由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

2、KASP方法的建立：

1)DNA提取

采用常规的CTAB方法提取待测玉米的基因组DNA，并将浓度稀释到10ng/ul。

2)KASP扩增

将以上述待测样本的基因组DNA为模板，以kmads_275为引物进行KASP扩增。引物工作液由每个KASP标记的FAM引物、HEX引物和Common引物组成，且FAM和HEX引物浓度均为12μM,Common引物浓度是30μM。

KASP扩增体系为1ul(使用1536微孔板)，包括30ng烘干的DNA，0.5μl的KASP2xMaster Mix(LGC公司，型号为KBS-1016-011)，0.486μl去离子水或超纯水，0.014μl引物工作液，其中，FAM引物、HEX引物和Common引物在扩增体系中的终浓度为12uM、12uM和30uM。

KASP扩增体系也可以为3ul(使用384微孔板)，包括30ng烘干的DNA，1.5μl的KASP2X Mastermix 96/384(LGC公司，型号为KBS-1016-003)，1.5μl去离子水或超纯水，0.042μl引物工作液其中，FAM引物、HEX引物和Common引物在扩增体系中的终浓度为12uM、12uM和30uM。

KASP扩增程序如下：95℃15min预热；94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环，结束。

3)荧光扫描

利用荧光扫描仪Pherastar仪对完成PCR程序的PCR板进行扫描，利用Kraken软件读取并输出分型结果。

若扩增产物的荧光颜色为引物1中荧光标签序列对应的荧光基团的颜色，则待测玉米SNP位点275的基因型为CC纯合；

若扩增产物的荧光颜色为引物2中荧光标签序列对应的荧光基团的颜色，则待测玉米SNP位点275的基因型为AA纯合。

四、检测KASP标记与开花期、株高的关联

利用kmads_275标记对239份RIL群体的DNA的SNP位点275进行检测，方法按照上述三中的2，并设置空白对照(不加DNA)。

结果如图2和表3所示，可以看出，该标记对SNP位点275具有较好的分型效果，能有效区分不同基因型的材料，具有较高的扩增效率。这些材料中共有157份材料为SNP位点275为AA基因型，82份材料为SNP位点275为CC基因型(表3)。

表3为kmads_275标记在239份RIL群体的基因型

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将kmads_275标记鉴定的上述239份RIL群体的SNP位点275基因型与开花期、株高、穗位高、单穗粒重和单穗粒数表型一一对应，并进行显著性检验，发现含AA基因型材料相比CC基因型的材料散粉期提早1天、吐丝期提早1天，株高降低14cm，穗位高降低10cm，而单穗粒数和单穗粒重表型差异不显著(表4)。表明与SNP位点275的CC基因型的玉米相比，SNP位点275的AA基因型的玉米具有提早开花、降低株高和/或穗位高，但不影响产量的作用。

表4为kmads_275标记与表型关联的显著性

因此，可以通过检测玉米基因组中SNP位点275的基因型为AA还是CC，鉴定或辅助鉴定待测玉米的散粉期、吐丝期和/或株高；

SNP位点275基因型为AA的待测玉米的散粉期和/或吐丝期早于或候选早于SNP位点275基因型为CC的待测玉米；表明，SNP位点275基因型为AA的待测玉米的开花时间早于或候选早于SNP位点275基因型为CC的待测玉米；

SNP位点275基因型为AA的待测玉米的株高小于或候选小于SNP位点275基因型为CC的待测玉米。

上述检测检测玉米基因组中SNP位点275的基因型为AA还是CC的方法，为用kmads_275标记对待测玉米进行KASP扩增(方法同上述三中的2)，检测基因型。

实施例2、kmads_275标记的应用

一、散粉期、吐丝期、株高、单穗粒数、单穗粒重的检测

根据Xiao等人的研究，收集了9类42份国内外不同的玉米杂种优势群骨干材料如表5所示，包括黄改群、旅系、P群、X群、自330亚群、瑞得、改良瑞得、兰卡、热带材料；各个材料记载在如下文献中：Xiao Y,Jiang S,Cheng Q,Wang X,Yan J,Zhang R,Qiao F,Ma C,Luo J,Li W,Liu H,Yang W,Song W,Meng Y,Warburton ML,Zhao J,Wang X,Yan J.Thegenetic mechanism of heterosis utilization in maize improvement.GenomeBiology.2021May 10；22(1):148.。获取了这些材料在辽宁春播、河南夏播环境下的散粉期、吐丝期、株高、单穗粒数和单穗粒重表型数据，如表5所示。

表5为42份玉米骨干自交系在河南和辽宁的开花期、株高和产量表型

二、SNP位点275基因型检测

按照实施例1的三的2的方法，利用kmads_275标记对这42份材料进行基因分型。

SNP位点275基因型为AA的待测玉米的开花时间早于或候选早于SNP位点275基因型为CC的待测玉米；

SNP位点275基因型为AA的待测玉米的株高小于或候选小于SNP位点275基因型为CC的待测玉米。

结果如图3和表6所示，AA基因型对应的材料有9个，仅分布在一部分黄改群中，而CC基因型对应的材料有33个。

基因型与表型的显著性分析发现，该标记能显著区分开花期和株高，与实际表型结果一致。AA基因型的材料在河南和辽宁的散粉期、吐丝期都比CC基因型对应的材料提早4天；同时，AA基因型对应的材料在河南、辽宁的株高都比CC基因型对应的材料降低24厘米(表7)。然而，AA基因型和CC基因型材料的单穗粒数和单穗粒重表型在河南和辽宁都没有显著性，表明这个位点不影响产量性状。因此，SNP位点275基因型及其对应的kmads_275标记可用于判断玉米的开花期和株高状态。

表6为42份玉米骨干自交系的基因型

表7为kmads_275标记在42份骨干自交系群体的基因型和表型的显著性

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