一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法和试剂盒。

背景技术

5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)被认为是基因组DNA中的第五碱基，它可以被TET(ten-eleven translocation)双加氧酶进一步氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。5fC和5caC可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶(thymine DNAglycosylase，TDG)识别并从DNA中切除，最终转化为未修饰的胞嘧啶(cytosine，C)。因此，5fC和5caC清楚地标记了哺乳动物基因组中甲基化的激活。2011年，首次在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESC)中发现了5fC和5caC。然而，mESC中5fC的丰度(占所有C的0.002％)远低于5hmC(占所有C的0.39％)和5mC(占全部C的3％)。尽管5fC的丰度非常低，但它代表了哺乳动物的重要表观遗传学标记，并在基因调控和某些疾病的发生中发挥重要的作用。为了进一步了解5fC的生物学功能，必须精准的确定5fC在基因组上的分布。

目前已经有一些方法来对5fC进行定位分析，一类是非单碱基分辨率的方法，如化学标记法(O-(biotinylcarbazoylmethyl)hydroxylamine，ARP)是利用醛基与氨基之间的醛胺缩合反应来实现对5fC的特异性标记和富集；酶法(β-葡萄糖基转移酶)是利用硼氢化钠特异性的将5fC还原为5hmC再利用β-葡萄糖基转移酶使生成的5hmC上加上一个带有叠氮的基团，以此来实现对5fC的富集；基于抗体的方法(修饰特异性抗体)利用抗体对5fC进行富集。这些方法都是通过反应(化学反应或酶反应)对含有5fC修饰的DNA片段进行富集后测序，因此分辨率不高。另一类是亚硫酸氢盐法，如5fC辅助亚硫酸氢盐测序(5fC-assistedbisulfite sequencing，fCAB-seq)和还原亚硫酸氢盐测序(reduced bisulfitesequencing，redBS-seq)。在标准亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing，BS-seq)中，亚硫酸氢盐处理会使DNA中的C、5fC和5caC脱氨基，并在PCR扩增过程中被读作胸腺嘧啶(thymine，T)，而5mC和5hmC不被脱氨基，在后续PCR过程中保持C不变。在fCAB测序中，羟胺首先与5fC反应，反应后的基团充当保护基团使5fC不被脱氨。因此，通过比较从BS-seq获得的数据(其中5fC读为T)和从fCAB-seq获取的数据(此时5fC读为C)，就可以对5fC进行定位。redBS-seq测序法与之类似，该方法利用硼氢化钠把5fC还原成5hmC，因此在后续亚硫酸氢盐处理时不被脱氨基，并且在测序时保持C不变。这两种基于亚硫酸氢盐的测序方法需要苛刻的化学脱氨条件，从而导致大量DNA被降解；并且由于5fC含量极低，后续测序需要花费非常高的成本；而且位点分析需要对比两种不同实验得到的测序数据。

因此，为了解决上述技术问题，有必要开发一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，有强选择性、高灵敏度及易操作，无亚硫酸氢盐处理过程。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，所述方法包括：

将含5-醛基胞嘧啶的DNA与生物素羟胺进行化学衍生标记反应，后纯化，获得标记DNA双链；

将所述标记DNA双链进行变性获得DNA单链，后采用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白对所述单链DNA进行脱氨基反应，再酶解消化除去所述胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白，获得脱氨基单链DNA；

将所述脱氨基单链DNA进行PCR反应，获得扩增产物；

将所述扩增产物测序，获得5-醛基胞嘧啶的位点信息。

进一步地，所述含5-醛基胞嘧啶的DNA与生物素羟胺进行化学衍生标记反应，包括：

将含5-醛基胞嘧啶的DNA、生物素羟胺和2-吗啉乙磺酸缓冲液混匀并震荡。

进一步地，所述2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为80～120mM，pH 5.0；所述生物素羟胺的浓度为4-6μM。

进一步地，所述脱氨基反应的条件为：DNA在含2-(N-吗啉)乙磺酸10～30mM、Triton X-100 0.05～0.5％、pH 5.5～7.5、A3A蛋白1～10μM的反应体系中，于30～45℃反应0.5～4小时。

进一步地，所述酶解消化除去所述胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白，包括：

所述脱氨基反应完成后，加入蛋白酶K并在52～58℃下反应25～35分钟以消化除去A3A蛋白，后高温灭活处理所述蛋白酶K，所述高温灭活处理的条件包括：于92～98℃水浴中孵育5～20min。

在本发明的第二方面，提供了一种生物素羟胺和胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白的组合在对DNA中5-醛基胞嘧啶进行单碱基分辨率定位的分析方法中的应用。

在本发明的第三方面，提供了一种用于对DNA中5-醛基胞嘧啶进行单碱基分辨率定位的试剂盒，所述试剂盒包括生物素羟胺和胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白。

进一步地，所述试剂盒还包括：

采用生物素羟胺进行化学衍生标记反应的反应体系：生物素羟胺和2-吗啉乙磺酸缓冲液；

采用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白进行脱氨基的反应体系：2-(N-吗啉)乙磺酸、TritonX-100。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，原理见图1，A3A脱氨酶能够使DNA中的C、5mC、5hmC和5fC脱氨基成为U，从而将C转化为T。生物素羟胺中的氨基基团可以特异性的与5fC的醛基发生反应，反应后的基团会破坏A3A蛋白对5fC上氨基的脱氨作用。因此，只有标记的5fC不会脱氨基。所以，我们利用A3A蛋白对5fC-biotin和C，5mC，5hmC的差异脱氨作用，实现对DNA中5fC修饰的单碱基定位分析的目的。具备如下优点：

(1)本发明操作简单，不需要繁杂的样本处理过程，且脱氨基后可直接进行PCR。

(2)本发明不涉及亚硫酸氢盐处理。

(3)本发明使用的A3A蛋白对C、5mC及5hmC具有很高的脱氨效率(C>99.9％、5mC>99.5％、5hmC>93％)，而对5fC-biotin的脱氨基效率极低(<4％)，因此可以实现5fC的单碱基分辨率定位分析。

(4)本发明不需要昂贵的三代测序技术，二代测序即可完成全基因组上的5fC修饰的单碱基分辨率定位分析。

(5)本发明的方法可广泛用于不同样本中5fC位点的分析，有利于进一步研究5fC的生物学功能。

(6)本发明不涉及亚硫酸氢盐处理，且能实现5fC的单碱基分辨率定位分析，相较于之前的方法更加简单，有利于推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明中5fC与生物素羟胺反应的化学方程式(图1A)及利用A3A蛋白的脱氨基作用进行5fC的单碱基分辨率定位的示意图(图1B)。

图2为本发明中实验例1的结果；其中图2A为生物素羟胺对5fC标记前后LC-MS/MS的检测效果；图2B为富集结果。

图3为本发明中人工合成的含有5mC、5mC及5fC-biotin的DNA链经A3A蛋白处理前后LC-MS/MS检测效果。

图4为本发明中人工合成的分别含有5mC、5hmC及5fC-biotin的DNA链经A3A蛋白处理前后Sanger测序效果对比图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，所述方法包括：

S1、将含5-醛基胞嘧啶的DNA与生物素羟胺进行化学衍生标记反应，后纯化，获得标记DNA双链；

所述步骤S1中，

所述化学衍生标记反应，包括：将含5-醛基胞嘧啶的DNA、生物素羟胺和2-吗啉乙磺酸缓冲液混匀并震荡。

优选地，所述2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为80～120mM，pH 5.0；所述生物素羟胺的浓度为4-6μM。

在具体的实施方式中，用100mM 2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonicacid，MES)缓冲液(pH 5.0)及5μM生物素羟胺在37℃下震荡反应4小时来特异性的对5fC进行标记。

所述化学衍生标记反应标记反应的条件有利于保证生物素羟胺的活性和化学衍生标记反应标记反应的效率。

本申请的生物素羟胺可购买自深圳市瑞吉特生物科技有限公司、长沙奕抚生物科技有限公司、上海甄准生物科技有限公司等，CAS号:139585-03-8。

本申请的生物素羟胺也可通过合成而得，合成的具体方法为：

①向圆底烧瓶中加入下列试剂：二甘醇(1.0g、三苯基膦(7.4g)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.6g)搅拌反应15分钟后，在冰浴下滴加偶氮二甲酸二异丙酯。将混合物升温至25℃后搅拌反应12小时。去除溶剂，用乙醚溶解所得的固体，并在4℃下剧烈搅拌30分钟。通过过滤收集得到的沉淀物，并将得到的沉淀物从乙醚中再结晶一次然后在真空中干燥，收集白色固体(化合物1)并直接用于下一步肼解。

②将化合物1(1.0g)溶解在乙醇中，然后加入水合肼(1.2mL)。在25℃下剧烈搅拌反应6小时，然后在真空下蒸发溶剂。将所得到的产物过滤去除固体，剩余的油状物质通过硅胶柱层析法纯化，所得到的干净的油状物为化合物2。

③将生物素、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和三乙胺加到烧瓶中，在25℃下将混合物搅拌反应2小时，然后将含有DMF的化合物2加到上述反应溶液中。在25℃下继续反应12小时后，在真空下去除溶剂。通过硅胶柱层析纯化所得的白色固体，所得的白色固体即为生物素羟胺。

S2、将所述标记DNA双链进行变性获得DNA单链，后采用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白对所述单链DNA进行脱氨基反应，再酶解消化除去所述胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白，获得脱氨基单链DNA；

所述步骤S2中，

所述脱氨基反应的条件为：DNA在含2-(N-吗啉)乙磺酸10～30mM、Triton X-1000.05～0.5％、pH 5.5～7.5、A3A蛋白1～10μM的反应体系中，于30～45℃反应0.5～4小时。选择上述成分组成的缓冲液的原因可以保证脱氨酶的活性和脱氨反应的效率。

所述酶解消化除去所述胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白，包括：

所述脱氨基反应完成后，加入蛋白酶K并在52～58℃下反应25～35分钟以消化除去A3A蛋白，后高温灭活处理所述蛋白酶K，所述高温灭活处理的条件包括：于92～98℃水浴中孵育5～20min。该反应条件有利于胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白灭活，从而有利于后续的PCR扩增过程。

所述的胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白见文献“Emily K.Schutsky,Jamie E.DeNizio1,Peng Hu,Monica Yun Liu,Christopher S.Nabel,Emily B.Fabyanic,Young Hwang,Frederic D.Bushman,Hao Wu,*,and Rahul M.Kohli.Nondestructive,base-resolutionsequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase.NatBiotechnol.36.1083–1090.”，氨基酸序列如下所示：

MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN。

S3、将所述脱氨基DNA样品进行PCR反应，获得扩增产物；

所述PCR反应中需要使用与特异性引物对羧甲基保护及脱氨后的DNA进行扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，进行Sanger测序。针对不同的待测DNA需要设计相对应的引物。

S4、将所述扩增产物测序，获得5-醛基胞嘧啶的位点信息。

若PCR扩增得到的是特定序列的DNA片段，扩增产物可以直接进行Sanger测序；若PCR扩增形成DNA文库，则将扩增产物进行高通量测序。

本发明提供的方法，因为含有生物素，所以可以对DNA中含量极低的5fC进行富集。

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种生物素羟胺和胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白的组合在对DNA中5-醛基胞嘧啶进行单碱基分辨率定位的分析方法中的应用。

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种用于对DNA中5-醛基胞嘧啶进行单碱基分辨率定位的试剂盒，所述试剂盒包括：生物素羟胺和胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白。

所述试剂盒还包括：

采用生物素羟胺进行化学衍生标记反应的反应组分：生物素羟胺和2-吗啉乙磺酸缓冲液；

采用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白进行脱氨基的反应组分：2-(N-吗啉)乙磺酸、TritonX-100。

本发明涉及到的常用术语为：

fC-DNA：含5-醛基胞嘧啶的DNA；

下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取、酶解以及聚合酶链式反应为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、一种DNA中5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法

1、合成分别含有5mC、5hmC及5fC-biotin修饰的DNA链(5mC-DNA、5hmC-DNA和5fC-biotin-DNA)，如表1所示。

表1

2、分别取50ng上述三种DNA样品，将双链DNA变性为单链，加入A3A蛋白(终浓度为5μM)，MES反应缓冲液，pH 6.5(终浓度为100mM)，加水至反应体系为20μL。将上述体系置于37℃反应4小时；反应结束后加入2μL蛋白酶K，并在55℃下孵育30分钟，95℃下加热10分钟灭活蛋白酶K。

3、取一定量上述反应后的DNA进行PCR扩增。反应体系(50μL)包含一定量的脱氨后的DNA链、10μL

结果见图4，A3A蛋白可以将5mC-DNA及5hmC-DNA中的C、5mC及5hmC完全脱氨基，并在后续测序过程中读为T；5fC-biotin-DNA中的C被完全脱氨基，并在测序时读为T，但5fC-biotin-DNA中的5fC完全未被A3A蛋白脱氨基，在测序过程中仍被读为C。该结果表明化学衍生结合A3A脱氨酶可以对DNA中的5fC进行定位分析。

实验例1、生物素羟胺标记富集5fC

1、将5μM生物素羟胺、100mM MES缓冲液(pH 5.0)及200ng 5fC-DNA在37℃下以1200rpm的速度震荡反应4小时。然后，通过乙醇沉淀纯化反应体系中的DNA，以去除过量的生物素羟氨。

2、乙醇沉淀反应：向上一步反应物中加入二分之一体积的NH

3、生物素羟胺富集含5fC的DNA：

(1)清洗链霉素磁珠，取两份10μL链霉素磁珠，用100μL 1x wash(bind)buffer洗三次。

(2)上样，向50μL DNA(0.1～10ng 5fC-biotin-DNA和1μg普通的DNA双链)中加入50μL 2x bind buffer室温下转动结合20分钟。

(3)清洗DNA，去上清保留磁珠，然后用1mL 1x bind buffer清洗3次；1mL H

结果见图2，与生物素羟胺反应后的5fC几乎被消耗完全，标记效率高达95％，说明生物素羟胺可以特异性且高效的标记DNA中的5fC。qPCR结果显示，经过生物素标记和富集后的5fC-DNA的富集倍数高达4000倍，说明我们的方法可以对基因组中极低丰度的5fC进行富集。

实验例2、A3A蛋白的胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白活性分析

1、配制反应缓冲液：将MES溶于去离子水中，终浓度为200mM，并调节其pH至6.5。

2、合成分别含有C、5mC、5hmC及5fC-biotin的DNA链。

3、分别取50ng上述四种DNA样品，将双链DNA变性为单链，加入A3A蛋白(终浓度为5μM)，MES反应缓冲液，pH 6.5(终浓度为100mM)，加水至反应体系为20μL。将上述体系置于37℃反应4小时；反应结束后加入2μL蛋白酶K，并在55℃下孵育30分钟，95℃下加热10分钟灭活蛋白酶K。

4、对步骤3中经脱氨基处理的DNA链进行酶解，酶解后的产物用LC-MS/MS分析检测。

结果见图3，分别含有C、5mC、5hmC及5fC-biotin的DNA链经A3A蛋白处理前后的提取离子色谱图显示，处理后C、5mC及5hmC的色谱峰几乎完全消失，表明A3A蛋白可以高效的脱去C、5mC及5hmC上的氨基；但是处理后5fC-biotin的色谱峰强度并未发生明显变化，这表明A3A蛋白对5fC-biotin没有脱氨基的能力。实验结果证明，A3A蛋白的差异脱氨基能力可以使胞嘧啶中的5fC与C、5mC及5hmC区分开。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。