作为蛋白磷酸酶5激动剂的化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一类2-亚胺-2H-色烯-3-硫代酰胺类蛋白磷酸酶5(PP5)激动剂及其衍生物的制备和其在制备由PP5异常导致的相关疾病的药物中的用途。

背景技术

蛋白磷酸酶5(PP5)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，主要调控着蛋白质的去磷酸化过程，在正常的生理状态下PP5通常处于自抑制状态。在该状态下，PP5蛋白N端的TPR结构域和催化域产生相互作用，使PP5的磷酸酶活性催化位点被完全覆盖，进而阻止底物进入催化活性位点。此外C端的αJ螺旋与TPR结构域相互作用，进一步稳定PP5的自抑制状态。目前，已报道的PP5激活剂可分为TPR依赖的激活剂和非TPR依赖的激活剂。TPR依赖的激活剂包括超过16个碳的长链脂肪酸、苏拉明、Hsp90(热休克蛋白90)C端的MEEVD基序等，该类激活剂通过与PP5的TPR结构域结合来变构激活PP5。非TPR依赖的激活剂目前只有P5SA-2这一个化合物报道，它通过与PP5的非TPR变构激活位点结合来激活PP5。

PP5的激活对于细胞有着至关重要的作用，如在阿尔兹海默症患者细胞以及因糖皮质激素治疗而导致脂肪过度积累的内脏细胞中均发现了PP5激活水平下降的趋势，原因可能是在这些细胞中内源性激活物质的减少导致PP5活性下降，从而使PP5的底物蛋白质过度磷酸化，导致其正常功能失调，加速疾病的发生与发展。因此，PP5激动剂可以调控过度磷酸化蛋白质去磷酸化达到治疗因去磷酸化功能失调而导致的一系列疾病的目的。

目前，针对PP5介导的相关疾病研究主要集中于对其抑制剂的研发，因为在许多不同癌症细胞中都不同程度的发现了PP5过表达的情况。但是对PP5激动的研究也同样重要。因为PP5的活性必须保持在正常水平，过度表达或者过度抑制都会导致不同的疾病，并且目前对于PP5的激活并没有特别深入的研究，当前已发现的PP5激活剂存在以下问题：(1)TPR依赖的激活剂为非特异性的PP5激活剂，容易引发脱靶从而导致一系列的毒副作用；(2)目前报道的激活剂均存在成药性差的问题，例如MEEVD序列的透膜性较差、长链脂肪酸的水溶性差等；(3)非TPR依赖的PP5小分子激动活性较弱，难以高效地激活PP5的活性，而TPR依赖的小分子会对PP5的共伴侣功能产生影响，无法发挥出应有的功能。并且PP5的活性过低会导致一系列的信号传导问题，从而引发各种各样的疾病，因此选择性高且激动效应强的PP5激动剂能帮助更进一步的了解PP5在细胞信号传导中所扮演的角色，以解决因PP5活性过低而引发的诸多疾病，具有较大的临床研究前景。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一类2-亚胺-2H-色烯-3-硫代酰胺类PP5激动剂及其衍生物，可用于制备治疗由PP5异常导致的相关疾病。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面中，提供了式Ⅰ或式II所示的化合物，

其中：

式Ⅰ中的R

其中式Ⅰ中的所述取代或未取代的芳基为/>

该式Ⅰ中的R

式Ⅰ中R

式Ⅰ中R

式Ⅰ中X

式II中的R

其中式II中所述取代或未取代的芳基为/>

该式II中的R

式II中R

式II中R

式II中X

在某些优选的实施方案中，所述化合物是如下的任一化合物或其药学上可接受的盐：

/>

在又一方面，本发明提供了上述作为蛋白磷酸酶5激动剂的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗/预防PP5相关疾病药物中的用途。

在又一方面，本发明提供了药物组合物，包含本发明的化合物，或它们的药学上可接受的盐，或任选的药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。

在又一方面，本发明提供了如式Ⅰ所示的化合物的制备方法，所述制备方法的反应式如下：

其中，上述反应式中X

具体包括以下步骤：

由原料I-1和I-2溶于异丙醇中后，以哌啶作为催化剂，发生Knoevenagel缩合反应和亲核加成反应后生成不同的目标产物I-3；I-3与烷基/烷氧基胺盐酸盐以醋酸为溶剂和催化剂发生亲核取代反应或者与市售不同种类硼酸酯化合物发生Suzuki偶联或者与市售取代或未取代的苯胺类化合物发生Buchwald-Hartwing偶联后生成目标化合物I-4；I-4与不同的烷基酸溶液发生酰胺缩合反应生成式I化合物；

本发明还提供了所述式II相关化合物的制备方法的反应式如下：

其中，上述反应式中X

具体包括以下步骤：

上述化合物II-1通过上述式I的合成方法制得，II-1与市售甲醛类化合物在以哌啶为催化剂，四氢呋喃为溶剂发生Knoevenagel缩合反应和亲核取代反应生成式II化合物。

本发明另一方面提供了本发明的化合物，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔兹海默症，肥胖以及某些转录因子或蛋白酶的去磷酸化功能失调而导致的癌症中的任意一种或多种疾病在药物中的用途。

定义

下面更详细地描述具体官能团和化学术语的定义。

像本发明所描述的，本发明中的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如本发明的通式化合物，或者像实施例里特殊的例子、子类，和本发明所包含的一类化合物。应了解“取代与未取代的”这个术语与“任选取代的”这个术语可以交换使用。一般而言，除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。

本发明所使用的术语“烷基”包括1-6个碳原子饱和直链或支链的单价烃基。其中一些实施例为甲基，乙基。

本发明所使用的术语“烷氧基”是指-OR取代基，其中R包括C

本发明所使用的术语“芳基”为具有6个碳原子的不饱和芳香基团，芳基可以是未经取代的或被一个或两个独立选自下组的取代基取代：(1)C

本发明所使用的术语“杂芳基”包括含有一个选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6-元环；5元环具有两个双键，6元环具有三个双键；其中所述杂芳基的一些实例为吡啶基，噻吩基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、喹啉基和吗啉环。

术语“卤素”为选自氟(-F)、氯(-Cl)和溴(-Br)的基团。本文所用术语“氨基”表示-NH

除非其他方面表明，本发明所描述的结构式包括所有的同分异构形式(如对映异构、非对映异构，和几何异构(或构象异构))；例如含有不对称中心的R、S构型，双键的(Z)、(E)异构体，和(Z)、(E)的构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体，非对映异构体，或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。

本发明中所述的“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。

除非其他方面表明，本发明的化合物的所有互变异构形式都包含在本发明的范围之内。另外，除非其他方面表明，本发明所描述的化合物的结构式包括一个或多个不同的原子的富集同位素。

本发明的有益效果是：本发明提供了一类作为PP5激动剂化合物，试验表明其直接针对PP5产生激动作用，发现了结构新颖、具有良好理化性质的活性小分子，该小分子在各类实验中均表现出了良好的活性，有希望开发成为特异性药物治疗阿尔兹海默症，糖皮质激素治疗而导致的肥胖以及蛋白酶去磷酸化功能失调而导致的癌症。

附图说明

图1为化合物DDO3728、DDO3733、DDO3750和DDO3752的EC

图2为化合物DDO3728分别与PP5截断体蛋白和PP5全长蛋白的ITC结合亲和力活性评价；

图3为阳性化合物P5SA-2在不同浓度下给药24h后HCT116细胞内ASK1、p-ASK1

图4为化合物DDO3728在不同浓度下给药24h后HCT116细胞内ASK1、p-ASK1

图5为化合物DDO3733在不同浓度下给药24h后HCT116细胞内ASK1、p-ASK1

图6为化合物DDO3733在50μM下给药不同时间后HCT116细胞内ASK1、p-ASK1

具体实施方式

提供以下实施例以便为领域技术人员提供如何实施、制备和评估本文请求保护的方法和化合物的完整公开和说明，旨在仅仅示例本发明而非限制本发明的范围。

合成方法

如无其它特殊说明，原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述的方法制备。化合物的结构通过核磁共振(

下面更具体地描述本发明化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。

实施例1制备2-亚氨基-6-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3753)

将5-甲氧基水杨醛(1.52g,10mmol)溶于异丙醇后，将2-氰基硫代乙酰胺(1g,10mmol)的异丙醇溶液加入5-甲氧基水杨醛的异丙醇溶液中，加入催化量的哌啶，将混合物在45℃条件下回流搅拌1h，反应结束后观察反应混合物中有固体析出，抽滤，滤饼用异丙醇淋洗3次，得到黄色固体化合物2-亚氨基-6-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺1.98g，产率85％。

实施例2制备2-亚氨基-5-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3721)

本品由6-甲氧基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1的方法合成，产率65％。

实施例3制备6-羟基-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DD03724)

本品由5-羟基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率85％。

实施例4制备2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3715)

/>

本品由水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率32％。

实施例5制备2-亚氨基-6-甲基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3722)

本品由5-甲基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率65％。

实施例6制备6,8-二溴-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3754)

本品由3,5-二溴水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率85％。

实施例7制备6-溴-2-亚氨基-8-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3718)

本品由3-甲氧基-5-溴水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率82％。

实施例8制备6,8-二氯-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3727)

本品由3,5-二氯水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率83％。

实施例9制备化合物6-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3731)

本品由5-氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率84％。1HNMR(300MHz,DMSO-d

实施例10制备6,8-二氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3728)

本品由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰氨按照实施例1合成，产率83％。

实施例11制备2-亚氨基-7-硝基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3755)

本品由4-硝基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率85％。

实施例12制备5,7-二氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3733)

本品由2,6-双氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率73％。

实施例13制备5-乙氧基-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3756)

本品由6-乙氧基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率88％。

实施例14制备5-溴-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3725)

本品由4-溴水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率73％。

实施例15制备7-溴-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3726)

本品由6-溴水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率73％。

实施例16制备2-亚氨基-7-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺(DD03720)

本品由4-甲氧基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率88％。

实施例17制备2-亚氨基-8-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3719)

本品由3-甲氧基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率82％。

实施例18制备6,7-二氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3734)

本品由5,6-双氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率78％。

实施例19制备5-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3732)

本品由6-氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率77％。

实施例20制备2-亚氨基-2H-吡喃并[3,2-b]吡啶-3-硫代酰胺(化合物DDO3716)

本品由3-羟基吡啶醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率32％。

实施例21制备7-羟基-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3723)

本品由4-羟基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺合成，产率22％。

实施例22制备5,8-二氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3735)

本品由3,6-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率55％。

实施例23制备8-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3729)

本品由3-氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率55％。

实施例24制备7-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3730)

本品由4-羟基水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺制备，产率77％。

实施例25制备3-亚氨基-3H-苯并[f]色烯-2-硫代酰胺(化合物DDO3717)

本品由萘水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成，产率63％。

实施例26制备2-氨基-6,8-二氟-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物DDO3736)

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，将DDO3728(0.24g,1mmol)溶于1,4-二氧六环后，加入三乙酰氧基硼氢化钠，于室温下搅拌8h，反应完毕后减压蒸馏出去溶剂，硅胶柱层析(PE:EA＝20:1)纯化出目标产物，得到黄色固体55.66mg，产率23％。

实施例27制备6,8-二氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-甲酰胺(化合物DDO3740)

本品由3,5-二氟水杨醛和2-氰基酰胺按照实施例1合成，产率88％。

实施例28制备(E)-6,8-二氟-2-(甲基亚氨基)-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728(200mg,0.83mmol)溶于醋酸中(1ml)，于45℃下搅拌7h，反应结束后，用乙酸乙酯(20ml)和水(30ml)进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩，之后硅胶柱层析纯化(PE:EA＝20:1)，得到淡黄色固体目标化合物176mg，产率83.52％。

实施例29制备(E)-6,8-二氟-2-(甲氧基亚氨基)-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728(200mg,0.83mmol)溶于醋酸中(1ml)，于45℃下搅拌7h，反应结束后，用乙酸乙酯(20ml)和水(30ml)进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩，之后硅胶柱层析纯化(PE:EA＝20:1)，得到淡黄色固体目标化合物176mg，产率83.52％。

实施例30制备6,8-二氟-N-甲酰基-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化合物

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。将DDO3728(240mg,1mmol)溶于甲酸后在65℃下加热回流5小时后发生酰胺缩合反应，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得黄色固体243.88mg,产率92％。

实施例31制备7,9-二氟-2-(4-甲氧基苯基)-3,5-二氢-4H-色烯[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由化合物DDO3728(240mg,1mmol)和市售化合物对甲基苯甲醛(204mg,1.5mmol)溶于适量四氢呋喃中后加入哌啶(5.95mg,0.07mmol)后回流8小时，反应结束后将反应液冷却至室温，观察到有黄色固体析出，抽滤，滤饼用四氢呋喃淋洗两次后在红外灯下干燥至恒重，得到目标产物42.96mg，产率12％。

实施例32制备7,9-二氟-2-(4-(羟甲基)苯基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和4-(羟甲基)苯甲醛按照实施例31合成，产率14％。

实施例33制备7,9-二氟-2-(4-氟苯基)-3,5-二氢-4H-色门[2,3-d]嘧啶-4-硫酮

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和对氟苯甲醛按照实施例31合成，产率6％。

实施例34制备7,9-二氟-2-(哌嗪-1-基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-4-硫

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和哌嗪-1-甲醛按照实施例31合成，产率15％。

实施例35制备7,9-二氟-2-(4-(三氟甲基)苯基)-3,5-二氢-4H-色烯[2,3-d]嘧

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和对三氟甲基苯甲醛按照实施例31合成，产率12％。

实施例36制备7,9-二氟-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-硫酮(化合物

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和甲醛按照实施例31合成，产率6％。

实施例37制备4-(7,9-二氟-4-硫氧基-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和对氰基甲醛按照实施例31合成，产率16％。

实施例38制备7,9-二氟-2-苯基-3,5-二氢-4H-铬[2,3-d]嘧啶-4-硫酮(化合物

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和苯甲醛按照实施例31合成，产率11％。

实施例39制备7,9-二氟-2-(3-甲氧基苯基)-3,5-二氢-4H-色门[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和苯甲醛按照实施例31合成，产率6.9％。

实施例40制备7,9-二氟-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3,5-二氢-4H-色烯[2,3-d]嘧

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和4,5,6-三甲氧基苯甲醛按照实施例31合成，产率5.5％。

实施例41制备7,9-二氟-2-(吡啶-4-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-硫酮

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和吡啶甲醛按照实施例31合成，产率8％。

实施例42制备2-(2,5-二氟苯基)-7,9-二氟-3,5-双氢-4H-色门[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和2,5-二氟苯甲醛按照实施例31合成，产率12％。

实施例43制备7,9-二氟-2-(2-甲氧基吡啶-4-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和2-甲氧基异烟醛按照实施例31合成，产率6.3％。

实施例44制备7,9-二氟-2-(2H-吡咯-5-基)-3,5-二氢-4H-铬[2,3-d]嘧啶-4-硫

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和2H-吡咯-5-甲醛按照实施例31合成，产率13％。

实施例45制备7-溴-9-甲氧基-2-苯基-3,5-二氢-4H-铬[2,3-d]嘧啶-4-硫酮(化

中间体6-溴-2-亚氨基-8-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺由5-溴-2-羟基-3-甲氧基苯甲醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实例1合成。本品由6-溴-2-亚氨基-8-甲氧基-2H-色烯-3-硫代酰胺和苯甲醛按照实例31合成，产率21％。

实施例46制备7,9-二氟-2-(喹啉-6-基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-4-硫

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和喹啉-6-甲醛按照实施例31合成，产率13％。

实施例47制备7,9-二氟-2-(1H-吲哚-3-基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和3H-吲哚-3-甲醛按照实施例31合成，产率3.5％。

实施例48制备7,9-二氟-2-(2-氟吡啶-4-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和2-氟异烟醛按照实施例31合成，产率5％。

实施例49制备7,9-二氟-2-(1H-吡咯-3-基)-3,5-二氢-4H-铬[2,3-d]嘧啶-4-硫

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和1H-吡咯-3-甲醛按照实施例31合成，产率15％。

实施例50制备7,9-二氟-2-(吡嗪-2-基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-4-硫

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和吡嗪-2-甲醛按照实施例31合成，产率5％。

实施例51制备7,9-二氟-2-(1H-吡唑-4-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和1H-吡唑-4-甲醛按照实施例31合成，产率6.6％。

实施例52制备7,9-二氟-2-(4-吗啉苯基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和4-吗啉苯甲醛按照实施例31合成，产率4.5％。

实施例53制备7,9-二氟-2-(1H-咪唑-2-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和1H-咪唑-2-甲醛按照实施例31合成，产率6％。

实施例54制备2-(3-氨基吡啶-4-基)-7,9-二氟-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和3-氨基异烟醛按照实施例31合成，产率3.4％。

实施例55制备7,9-二氟-2-(1H-吲唑-3-基)-3,5-二氢-4H-色烯并[2,3-d]嘧啶-

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和1H-吲唑-3-甲醛按照实施例31合成，产率4％。

实施例56制备7,9-二氟-2-(呋喃-3-基)-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-4-硫酮

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和呋喃-3-甲醛按照实施例31合成，产率10.3％。

实施例57制备3-(7,9-二氟-4-硫氧基-3,5-二氢-4H-铬并[2,3-d]嘧啶-2-基)吡

化合物DDO3728由3,5-二氟水杨醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成。本品由DDO3728和2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲醛按照实施例31合成，产率5％。

实施例58制备8-氟-6-((4-氟苯基)氨基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代氨基(化合

将5-溴-3-氟-2-羟基苯甲醛(2.10g,9.60mol)和(4-氟苯基)甲酰胺(100mg,8.00mmol)溶于适量DMF中。然后加入碳酸铯(2.18g,16.0mmol)、Xantphos(231mg,0.4mmol)和醋酸钯(89.8mg,0.4mmol)，在120℃，氮气保护下搅拌10h。反应结束后用乙酸乙酯和水进行萃取，有机层用无水硫酸钠进行干燥，干燥之后浓缩有机层，混合物用硅胶柱层析纯化(PE:EA＝20:1)，得到中间体3-氟-5-((4-氟卞基)氨基)-2-羟基苯甲醛2.38g，产率86.23％。本品由3-氟-5-((4-氟卞基)氨基)-2-羟基苯甲醛和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率31.56％。

实施例59制备8-氟-6-(4-氟苯基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代碳酰胺(化合物

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将5-溴-3-氟水杨醛(2.17g,10mmol)和对氟苯硼酸酯(2.67g,12mmol)溶于适量的DMF中，加入碳酸铯(16.29g，50mmol)和三苯基膦二氯化钯(200mg，0.5mmol)，于120℃下回流搅拌8h，反应结束后反应液用水和乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩，得到粗产物的中间体4'，5-二氟-4-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲醛后无需纯化，直接与2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1进行下一步反应，得到黄色固体的目标产物1.35g，产率31.56％。

实施例60制备8-氟-6-(4-氨基苯基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代碳酰胺(化合物

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和对氨基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率28.78％。

实施例61制备8-氟-6-(4-羟基苯基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代碳酰胺(化合物

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和对羟基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率40.21％。

实施例62制备4-(3-氨基甲酰基-8-氟-2-亚氨基-2H-铬-6-基)苯甲酸(化合物

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和对羧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率43.25％。

实施例63制备8-氟-2-亚氨基-6-(4-(三氟甲基)苯基)-2H-色烯-3-硫代酰胺(化

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和对三氟甲基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率32.26％。

实施例64制备2-(4-(3-氨基甲酰基-8-氟-2-亚氨基-2H-色烯-6-基)苯基)乙酸

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和对乙羧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率43.25％。

实施例65制备8-氟-6-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和4-羟基-3-甲氧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率32.75％。

实施例66制备6-(3,5-二甲氧基苯基)-8-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和3,5-二甲氧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率32.75％。

实施例67制备6-(2,4-二甲氧基苯基)-8-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和2,4-二甲氧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率44.25％。

实施例68制备6-(2,5-二甲氧基苯基)-8-氟-2-亚氨基-2H-色烯-3-硫代酰胺(化

中间体1由5-溴-3-氟水杨醛和2,5-二甲氧基苯硼酸酯按照实施例59合成。本品由中间体1和2-氰基硫代乙酰胺按照实施例1合成，产率24.35％。

生物活性测试

(一)磷酸酶酶活实验(pNPP法)

表1化合物对PP5酶活激活活性

注：因化合物溶解度的原因，

如表1所示，实施例化合物对PP5均表现出激活活性。化合物浓度在200μM下对PP5的激活活性范围在108％～420％，与阳性化合物花生四烯酸和P5SA-2基本保持在同一个水平。表明本专利实施例化合物具有较强的PP5酶活活性。如图1所示为使用pNPP法对化合物DDO3728、DDO3733、DD03750、DDO3752进行EC

其中，使用pNPP法测试PP5单点酶活及EC

首先配置含有100mM Tris,50mM NaCl,0.5Mm MnCl

(二)等温滴定量热法(ITC)实验

等温量热滴定法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)是一种热力学分析技术，使用目标化合物滴定靶标蛋白质。蛋白质与分子结合将使整个体系熵减，因此结合的过程会释放出热量。通过测量反应体系放热的变化可以计算出化合物分子与蛋白相互作用时的亲和常数K

如图2为化合物DDO3728分别与PP5截断体蛋白和PP5全长蛋白的ITC结合亲和力活性评价。由图可知，其对PP5截短体的结合亲和力常数K

(三)Westernblots测试PP5激活剂对细胞内PP5底物蛋白去磷酸化水平的影响

其中，Western blots测试的操作方法参照标准实验流程。具体实验过程包括细胞给药、细胞裂解、总蛋白收集、制备聚丙烯酰胺凝胶、SDS-PAGE分析、一抗孵育、二抗孵育及结果扫描。实验中测试ASK1、p-ASK1、Cdc37、p-Cdc37的表达量。

本发明实施例化合物对ASK1和Cdc37的去磷酸化作用如下：

如图3、4、5、6所示，测试结果表明DDO3728和DDO3733以浓度和时间依赖的方式去磷酸化ASK1和Cdc37。图3为50μM阳性化合物P5SA-2给药不同时间后HCT116细胞内ASK1、p-ASK1

由以上实施例可知，本发明作为PP5激动剂的部分化合物具有较强的PP5激动作用，在各类生物活性测试中表现出了良好的活性，可用于制备治疗由PP5异常导致的相关疾病的药物。

尽管已经示出了和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。