一种用于餐厨垃圾发酵的菌种组合物以及处理方法

技术领域

本发明属于餐厨垃圾处理的技术领域，具体涉及一种用于餐厨垃圾发酵的菌种组合物以及处理方法。

背景技术

根据联合国环境规划署发布的2021年餐厨垃圾指数报告，全世界每年产生的餐厨垃圾估计有9.31亿吨。目前，发展中国家90％以上的餐厨垃圾仍与城市固体废物混合一起，要么被送往垃圾场，要么被焚烧。餐厨垃圾来自人类的食物，因此营养丰富，与动物饲料的营养成分相似。将餐厨垃圾转化为动物饲料，除了成本低和提供附加值外，还具有环境效益。因此，利用餐厨垃圾作为动物饲料已经在环境研究者中获得了越来越多的关注。世界上有几个地区已经开始在现代养猪、养鸡和养鱼系统中使用加工后的餐厨垃圾作为动物饲料。

自2010年以来，中国一直在实施将餐厨垃圾转化成动物饲料的探索计划，并在许多城市建立了示范项目，Chen等人从三个城市的示范项目中收集了三种典型处理过程(发酵、热处理、水热处理与发酵耦合)的餐厨垃圾，并对动物饲料进行了安全分析。研究发现，餐厨垃圾衍生饲料的营养成分是平衡的，此外，有害微生物和化学污染物指数都符合相关的饲料标准，使餐厨垃圾成为一种有希望用于动物饲料的替代品。一般认为，通过水热处理加上发酵对食物垃圾进行加工，可以提高营养价值，增加有益菌和消化酶，改善原料的适口性，并延长保质期。这些研究为餐厨垃圾衍生饲料的生产和在牲畜中的应用提供了知道，但也存在一些不足，例如，大多数研究仅比较了餐厨垃圾中单一物质的含量，但没有对其微生物群落组成和发酵产物中存在的各种代谢物进行定性，这些未知的微生物和代谢物可能对发酵后的餐厨垃圾的稳定性和质量以及动物肠道健康产生重大影响。

因此，研制一种适用于餐厨垃圾集中处理中心生产发酵饲料的菌种配方可有效改善餐厨垃圾原料品质，对微生物群路和代谢产物有明显改善，这对提高餐厨垃圾饲料化转化的效率，对提高企业的生产水平，促进安全生产有重要作用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于餐厨垃圾发酵的菌种组合物以及处理方法。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于餐厨垃圾发酵的菌种组合物，所述菌种组合物包括植物乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的组合，其使用比例为1:3:1:2；

所述植物乳杆菌、粪肠球菌的活化培养基为MRS液体培养基，其扩大培养的液体培养基A为：胰蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖20g，无水醋酸钠3g，牛肉浸膏10g，柠檬酸三铵2g，酵母浸膏 5g，七水硫酸镁0.2g，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸，加蒸馏水至1000 mL；

所述枯草芽孢杆菌的活化培养基为NA液体培养基，其扩大培养的液体培养基B为：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL；

所述产朊假丝酵母的活化培养基为PDA液体培养基，其扩大培养的液体培养基C为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1000mL；

所述液体培养基A、B和C分别调节pH至6.8、7.3和自然pH， 121℃高压灭菌20min。

本发明还提供了一种用于餐厨垃圾发酵的处理方法，包括如下步骤：

1)餐厨垃圾的预处理

将餐厨垃圾进行自动分选和匀浆，将其中的非食物类的杂质去除，通过引入蒸煮后的循环水对餐厨垃圾进行匀浆，将得到的匀浆液输送至高温蒸煮灭菌锅进行高温蒸煮和灭菌，蒸煮温度＞90℃，时间为 2h；

之后进行三相分离，水、油、固三相分别回收；

2)发酵原料的制备

取餐厨垃圾预处理得到的固相物，添加玉米粉和豆粕粉，调节水分含量在65％左右，作为发酵原料；

3)分离纯化餐厨垃圾的发酵菌

从产生良好气味、粗蛋白含量提升以及长时间不变质的餐厨垃圾发酵物中反复分离纯化得到单菌落，对分离得到的单菌落进行16SrDNA和18SrDNA分子生物学鉴定，获得多株乳酸菌、芽孢菌、酵母菌和霉菌；

进一步地，通过单菌在餐厨废弃物平板上的生长情况、气味表现，菌株产酸、抑菌效率菌株，以及对淀粉、蛋白质等的利用率等，筛选出适合发酵餐厨废弃物的功能菌株植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌Y5和产朊假丝酵母J5；

4)菌株的扩大培养

在无菌条件下用接种环挑取植物乳杆菌R2和粪肠球菌R13分别于MRS液体培养基，枯草芽孢杆菌于NA液体培养基和产朊假丝酵母于PDA液体培养基，活化12h；

活化后的菌株接种于各自的液体培养基中进行扩大培养，备用，接种比为4％，培养温度分别为37℃、37℃、37℃和30℃，培养时间均为20h；

其中，所述植物乳杆菌R2和粪肠球菌R13的液体培养基A的组成为：胰蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖20g，无水醋酸钠3g，牛肉浸膏10g，柠檬酸三铵2g，酵母浸膏5g，七水硫酸镁0.2g，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸，加蒸馏水至1000mL；

所述枯草芽孢杆菌Y5的液体培养基B的组成为：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL；

所述产朊假丝酵母J5的液体培养基C的组成为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1000mL；

所述液体培养基A、B和C分别调节pH至6.8、7.3和自然pH，121℃高压灭菌20min；

固体培养基仅在此基础上添加20％的琼脂；

5)餐厨垃圾的发酵

在步骤2)的发酵原料中加入植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌Y5和产朊假丝酵母J5的发酵菌组合物，进行发酵；

6)发酵产物的微生物群落和代谢产物谱分析

采用16S rRNA基因测序，液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱 -质谱(GC-MS)对发酵产物进行微生物群落分析和代谢产物谱分析，获得产物微生物指标和代谢产物指标。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于餐厨垃圾发酵的菌种组合物，从产生良好气味，粗蛋白含量提升，长时间不变质的餐厨垃圾发酵物中反复分离纯化得到单菌落；对分离得到的单菌落进行了16SrDNA和18SrDNA分子生物学鉴定；通过单菌在餐厨废弃物平板上的生长情况、气味表现，菌株产酸、抑菌效率，对淀粉、蛋白质等的利用率等，筛选出适合发酵餐厨废弃物的功能菌种植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌 Y5和产朊假丝酵母J5，得到菌种组合物，用于餐厨垃圾的发酵，实现了餐厨垃圾发酵产物中微生物种群组成和代谢产物谱的变化，达到了为餐厨垃圾饲料转化提供方法，为发酵饲料的质量指标的制定提供依据的目的。

本发明的用于餐厨垃圾发酵的处理方法，将餐厨垃圾集中处理中心经过自动分选匀浆，高温蒸煮，三相分离获得的餐厨热处理固形物为原料，添加辅料和上述菌种组合物28℃发酵4天，产物在感官、营养、微生物组成和代谢产物方面均有大的提升，提高了餐厨垃圾发酵产物饲料化属性，增加了餐厨垃圾原料的营养价值，减少了餐厨垃圾中潜在致病微生物，且增加了许多有益的代谢物和香味诱导物质，降低了毒性物质比如苯的含量，改善了餐厨垃圾的质量，减少餐厨垃圾有害代谢物的产生，实现对循环经济理论的实际应用，对城市垃圾的无害化、减量化和资源化及我国环境污染治理等方面具有重要的理论及显示意义。

附图说明

图1为乳酸菌株的抑菌活性结果图；

图2为乳酸菌株的产酸速率曲线图；

图3为芽孢菌和酵母菌筛选气泡图；

图4为各处理组细菌群落在门水平(A)和属水平(B)的相对丰度比例图；

图5为餐厨垃圾发酵产物中重要的代谢产物结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于餐厨垃圾发酵的处理方法

1)集中处理中心餐厨垃圾热处理物基本情况

将餐厨垃圾进行自动分选和匀浆，将其中的非食物类的杂质去除，通过引入蒸煮后的循环水对餐厨垃圾进行匀浆，将得到的匀浆液输送至高温蒸煮灭菌锅进行高温蒸煮和灭菌，蒸煮温度＞90℃，时间为 2h，之后进行三相分离，水、油、固三相分别回收，采用现场随机抽样的方法，选取国家餐厨饲料化示范项目(深圳市腾朗再生资源开发有限公司)2019年12月至2020年12月的热处理物作为发酵原料，对其基础营养成分(干物质计)、酸价和pH进行分析，报告了各指标的均值和标准差，结果如表1所示；

表1餐厨垃圾发酵原料的特性

注：数据以均数±标准差表示；

a

b

c

d

热处理食品的粗蛋白质含量较高(34.9％，DM)。此外，样品的高糖还原(5.54％，DM)表明热处理后的餐厨垃圾含有促进细菌发酵的底物。样品中大肠菌群计数低可能是热处理所致。其他有害物质检测不到或存在的浓度极低。此外，批次间差异分析表明，每个月的成分和比例比较一致；

2)菌种的分离纯化

对分选匀浆处理后的餐厨垃圾进行自然发酵，对发酵后表现出良好气味，有高粗蛋白含量的餐厨垃圾的发酵物进行菌种的分离培养鉴定，筛选适合餐厨废弃物发酵的菌种；

经过多轮分离纯化，共得到37株单菌，经PCR扩增后进行 16SrDNA和18SrDNA基因测序，将序列信息在NCBI数据库中进行 BLAST相似性比对，获得26株细菌和11株真菌(表2)。

表2细菌16S rRNA基因和真菌18S rDNA序列分析结果

3)菌种在餐厨培养平板上的表现

将分离鉴定的37株单菌中不符合动物饲料安全允许直接饲喂动物的菌株剔除，包括蒙特氏假单胞菌菌株、肺炎克雷伯菌菌株、禽肠球菌菌株和蜡状芽孢杆菌共7株菌；

通过餐厨平板增殖实验对剩余的30株菌进行餐厨平板上生长情况的鉴定。具体将菌株培养物稀释至1×10

表3菌株在餐厨平板上的生长情况及感官评价

注：菌株生长情况判断：+表示菌落数≥10

感官评价：+表示对餐厨气味改善较小；++表示对餐厨气味稍有改善； +++表示较大地改善了餐厨原本的气味。

4)乳酸菌的抑菌能力和产酸能力的鉴定

乳酸菌可抑制有害菌的增殖并延长保质期，以绿脓杆菌和大肠杆菌为对象，开展抑菌实验，验证乳酸菌的抑菌效果。结果如图1所示，所有筛选到的乳酸菌在培养48h后对绿脓杆菌和大肠杆菌均有一定的抑菌效果，其中植物乳杆菌R2和粪肠球菌R13对绿脓杆菌和大肠杆菌的抑菌率均超过85％，具有较好的抑菌效果。随后，对抑菌率较好的菌株进行产酸能力试验，进一鉴定选增殖力强和产酸效率高的乳酸菌，结果如图2所示，在12h内，各乳酸菌菌株呈对数生长，培养基的pH值迅速下降，之后OD600值和pH值趋于稳定。其中R2、 R3、R5的pH值降至4以下，产酸能力强，而R2的OD值最高且稳定。

5)芽孢菌和酵母菌营养分解能力的鉴定

将在含20％餐厨的固体平板上生长状况良好的6株芽孢菌和8 株酵母菌进行淀粉、蛋白质、油脂的分解能力鉴定，结果如表4所示。

表4芽孢菌和酵母菌营养分解能力的鉴定

可见，各菌株均有一定的淀粉、蛋白质和脂肪水解能力和淀粉酶、蛋白酶活性。选取淀粉水解能力、淀粉酶活性及蛋白酶活性为衡量菌株生理性能的指标，结合SPSS软件分析，制成气泡图，见图3。结果表明筛选出来的枯草芽孢杆菌Y5菌株和产朊假丝酵母J5性能较好。

6)发酵配方的选择

将上述实验筛选出来的出发菌株植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌K5和产朊假丝酵母J5进行扩大培养：在无菌条件下用接种环挑取植物乳杆菌R2和粪肠球菌R13分别于MRS液体培养基，枯草芽孢杆菌于NA液体培养基和产朊假丝酵母于PDA液体培养基，活化12h；

活化后的菌株接种于各自的液体培养基中进行扩大培养，备用，接种比为4％，培养温度分别为37℃、37℃、37℃和30℃，培养时间均为20h；

其中，所述植物乳杆菌R2和粪肠球菌R13的液体培养基A的组成为：胰蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖20g，无水醋酸钠3g，牛肉浸膏10g，柠檬酸三铵2g，酵母浸膏5g，七水硫酸镁0.2g，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸，加蒸馏水至1000mL；

所述枯草芽孢杆菌Y5的液体培养基B的组成为：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL；

所述产朊假丝酵母J5的液体培养基C的组成为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1000mL；

所述液体培养基A、B和C分别调节pH至6.8、7.3和自然pH， 121℃高压灭菌20min；

然后将培养后的植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌 K5和产朊假丝酵母J5进行复配，通过发酵产物主要成分含量的变化来探讨最佳的菌种复配比例。其中主要考察粗蛋白、粗纤维、粗灰分、水分和氨基酸态氮的含量变化(粗蛋白、纤维素和粗灰分以干基计)，结果如表5所示。

表5发酵配方的选择

结果发现各比例配方对餐厨废弃物的发酵均在一定程度上改善了餐厨原料的气味，有效地降低了餐厨原有的哈刺味和酸臭味。从表 5中可以看出，产物粗蛋白的含量在原料的基础上得到不同程度的提升，而粗纤维、粗灰分和氨基酸态氮的含量发生了或高或低的变化。其中植物乳杆菌：粪肠球菌：枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母以1:3:1:2 组合的发酵产物中粗蛋白和氨基酸态氮的增加相对较大，感官评价也最好。

7)微生物接种减少了产物中有害微生物的比例

每天随机收集2.0kg的餐厨热处理物，持续一周，在4℃冰箱中保存，直到样本收集完成。将收集的餐厨热处理物与8％的玉米粉和 5％的豆粉混合，得到含水率约为65％的餐厨垃圾培养基。添加上述实验室分离纯化并复配的含植物乳杆菌R2、粪肠球菌R13、枯草芽孢杆菌Y5、和假丝酵母J5，菌株浓度10

表6餐厨垃圾发酵产物的发酵特性

a、b：同一行中不同的字母有显著的不同(P<0.05).

利用下一代测序技术(NGS)对餐厨垃圾发酵样品的细菌群落进行了测定和分析。在门水平上，共鉴定出20个门(图4左)。在2个组中，厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻门(Cyanobacteria)和变形菌门 (Proteobacteria)是优势门。无接种处理组(CT)中厚壁菌门数量最多。随着细菌的添加，厚壁菌门的相对丰度增加，而蓝藻和变形菌门的相对丰度降低。在属水平上，共鉴定出244属(图4右)。未接种组10个优势菌属分别为Lactobacillus(82.28％)、Leuconostoc(1.88％)、 Enterococcus(1.30％)、Lactococcus(0.83％)、Weissella(0.66％)、 Acinetobacter(0.34％)、Pseudomonas(0.34％)、Lelliottia(0.23％)、 Bacillus(0.06％)、Acetobacter(0.04％)。本发明的菌剂配方发酵组 (T)细菌数量最多的为肠球菌(53.81％)，其次为Lactobacillus (37.11％)和Bacillus(1.85％)。图4中观察到的Enterococcus和 Bacillus的高丰度可能是由于接种所致。此外，该组的Leuconostoc (0.167％)、Acetobacter(0.03％)、Lactococcus(0.11％)和Weissella(0.06％)以及潜在致病菌不动杆菌(Acinetobacter)(0.05％)、假单胞菌(Pseudomonas)(0.05％)和Lelliottia(0.02％)的丰度显著降低。该结果表明添加本发明的发酵菌剂配方可减少潜在致病菌的丰度，提高餐厨垃圾饲料的安全性。

8)菌剂添加促进了营养及有益的生物学功能物质的积累

经96h的发酵后，各组均产生一定的代谢产物，如图5A所示，其为餐厨垃圾发酵样品中关键代谢产物的LC-MS鉴定，接种发酵菌剂配方处理的样品比对照组的样品含有更多的氨基酸(L-缬氨酸、L -酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬氨酸、D-脯氨酸、DL- 丙氨酸和L-亮氨酸)以及必需脂肪酸亚油酸、9-HODE等。在已鉴定的代谢产物中，还检测到一些具有生物学功能的物质。与未处理组相比，接种本发明的菌剂配方处理组(T)含有更多的抗氧化剂酒石酸、丙二酸、2-羟基肉桂酸、抗炎化合物吲哚-3-乳酸、调味剂葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸，以及其他生物活性物质，如丙酮酸和大豆苷元。

气味是影响食物垃圾发酵产物可接受性的重要因素。因此，本发明通过GC-MS对食品垃圾发酵产物的挥发性气体成分进行了比较。如图5B所示，其为餐厨垃圾发酵样品中关键代谢产物的GC-MS鉴定，鉴别出的差异化合物包括怡人香气化合物、刺激性气味化合物和部分无味化合物。T组表现出高丰度的苯乙醇、乙酸和1-丁醇，均能产生宜人的香味。相比T，CT组苯浓度很高。苯是一种甜而芳香的气味，但与几种急性和长期的健康不良影响和疾病有关，包括急性髓系白血病和癌症。因此，必须严格控制发酵产物中苯的含量。

由代谢产物的分析可见，添加本发明的菌剂配方发酵餐厨垃圾，可以有效提高餐厨垃圾的有益代谢产物的积累，减少毒性化合物的丰度，是有前景和应用价值的菌剂配方。