SETD5活性多肽的构建及其促胰岛β细胞再生的活性应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，涉及一种SETD5活性多肽的构建及其促胰岛β细胞再生的活性，具体是明确一段重组多肽构建、生物活性及潜在促进胰岛β细胞再生作用。

背景技术

糖尿病是全球范围内高发的代谢性疾病，目前估计总患者多达4.2亿人。糖尿病包括1型和2型两种，前者主要好发于青年人中，后者主要发病于中老年人群。糖尿病发病过程中，胰岛β细胞的损伤和丢失是核心的进展机制，受肥胖、慢性炎症和各种有害物质的影响，胰岛β细胞可发生各种损伤，进而导致β细胞的死亡和衰老等进程，诱发进程性的胰岛β细胞丢失，从而导致胰岛素分泌不足，加速糖尿病的进程。因此，探索胰岛β细胞的动态平衡并针对性促进胰岛β细胞的再生是糖尿病研究的核心课题。

目前的研究已表明，胰岛β细胞具有自我再生能力，其再生过程通常是成熟的胰岛β细胞自我分裂和增殖。胰岛β细胞的再生过程需要多种分子信号通路的参与，其中 Wnt/β-catenin通路是一条关键的促胰岛β细胞再生通路。Wnt/β-catenin通路是一条由wnt 配体活化其受体导致细胞内β-catenin积聚、入核并转录下游基因表达的基本信号通路。众多研究发现，Wnt/β-catenin通路在干细胞性和组织再生能力中发挥核心的功能，其可以促进多种促再生能力基因的表达，如c-Myc，Survivin，Sox2和CD44等，促进细胞恢复干细胞性及再生能力。Wnt/β-catenin通路在胰岛β细胞的再生过程中发挥关键功能，其活化对于发育及糖尿病早期中胰岛β细胞的再生具有举足轻重的意义。因此，通过生物工程的方法促进Wnt/β-catenin通路活化，进而诱导胰岛β细胞的再生，对于缓解糖尿病的进程具有非常重要的价值。

本发明中，我们发现SETD5可通过结合并调控β-catenin的转录活性，进而介导了β-catenin下游胰岛β细胞的再生相关基因的表达。并且，我们寻找到了其介导β-catenin活性的多肽片段，我们命名为SETD5活性多肽。脂质体导入此多肽片段可以显著促进β-catenin 的转录活性，并促进胰岛β细胞的体外增殖及再生相关基因的表达。本发明可以作为胰岛β细胞再生诱导治疗性多肽，对于糖尿病的临床治疗具有非常广阔的应用开发前景。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供SETD5活性多肽的构建及其促胰岛β细胞增殖和再生的活性。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种SETD5活性多肽的构建的序列，其包括，多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1；cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

作为本发明的另一部分，本发明提供一种SETD5活性多肽的重组表达载体构建方法，其包括，全基因合成SETD5活性多肽编码核酸，进而限制性内切酶酶切并回收核酸片段后，与pCMV-Flag真核表达载体在T4连接酶作用下重组，获得SETD5活性多肽表达质粒；将所述重组质粒利用脂质体导入人胰岛β细胞系中。

作为本发明所述的SETD5活性多肽的表达方法的优选方案，其中：所述限制性内切酶包括EcoRI和HindIII。

作为本发明所述的SETD5活性多肽的表达方法的优选方案，其中：所述人胰岛β细胞系为EndoC-βH1。

作为本发明所述的SETD5活性多肽的表达方法的优选方案，其中：所述脂质体导入为将人胰岛β细胞系接种于6孔板中，接种时细胞融合度为60-70％左右，培养8h后脂质体导入SETD5活性多肽，转染后继续培养48h，检测胰岛β细胞的增殖及再生相关基因的表达。

本发明的有益效果：

本发明利用生物工程技术，将一段多肽对应的生物活性多肽编码序列克隆至pCMV-Flag真核表达载体中。通过PCR和DNA测序分析证明重组克隆构建成功，并将此活性多肽表达载体脂质体导入人胰岛β细胞系中，通过免疫印迹确定此活性多肽的表达，证明了其在人胰岛β细胞系中存在表达。进而利用多种功能手段分析其诱导人胰岛β细胞增殖和再生的功能。在细胞生物学层面明确了此生物活性多肽具有促进胰岛β细胞增殖及再生的重要功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为SETD5活性多肽的克隆的PCR鉴定；

图2为SETD5活性多肽的免疫印迹检测，大小为30KD；

图3为SETD5活性多肽促进β-catenin报告基因活性，(**，P<0.01)；

图4为SETD5活性多肽促进胰岛β细胞增殖活性，(**，P<0.01)；

图5为SETD5活性多肽促进胰岛β细胞中再生相关基因的表达，(**，P<0.01)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明是基于人胰岛β细胞中SETD5和β-catenin存在相互作用并调控β细胞增殖和再生能力的分子机制，设计一种SETD5生物活性多肽片段促进β-catenin介导的胰岛β细胞再生能力，进而糖尿病相关胰岛β细胞基因治疗，本多肽的特异性核酸序列如下：

本发明的是将此多肽的编码cDNA利用PCR扩增，并连接至pCMV-Flag真核表达载体中，多肽的氨基酸序列和对应cDNA序列如下：

多肽序列：

对应编码cDNA序列：

第一步，SETD5活性多肽的表达载体构建

利用全基因合成方法合成SETD5活性多肽的编码cDNA序列，进而利用限制性内切酶 EcoRI和HindIII酶切后与pCMV-Flag真核表达载体在T4连接酶作用下发生重组，经细菌转化、克隆筛选和质粒提取等步骤后获得表达SETD5活性多肽重组质粒后，PCR鉴定并测序验证重组质粒的构建成功。

第二步：SETD5活性多肽表达载体的转染及表达检测

将克隆成功的重组质粒利用脂质体导入人胰岛β细胞系EndoC-βH1中，孵育培养36小时后，收集胰岛β细胞并利用免疫印迹实验分析此生物活性多肽的表达。

第三步：SETD5活性多肽促进人胰岛β细胞增殖能力的检测

细胞学实验

1.免疫印迹明确SETD5活性多肽在人胰岛β细胞中的表达

将SETD5活性多肽表达载体转染EndoC-βH1细胞，培养48小时后，收集细胞并利用免疫印迹上样缓冲液裂解蛋白，以12％ SDS-PAGE进行蛋白样品分离，进而将蛋白样品转膜至PVDF膜中，最后以Flag标签抗体进行免疫印迹检测SETD5活性多肽的表达。

2.EdU增殖实验明确SETD5活性多肽对人胰岛β细胞增殖水平的影响。

将SETD5活性多肽表达载体以脂质体导入人胰岛β细胞系EndoC-βH1，培养48h后，以EdU细胞增殖试剂盒检测对照及SETD5活性多肽表达组中胰岛β细胞的增殖水平变化，统计分析两之间的显著性差异。

实施例1：SETD5活性多肽表达载体的构建及脂质体导入

1.SETD5活性多肽的哺乳动物细胞表达载体构建

利用全基因合成仪(上海生工制作)合成SETD5活性多肽的编码DNA序列，并在此序列上下游分别插入EcoRI和HindIII，将获得的样品核酸4μg加入无菌纯净水至34μl，加入4μl的10×酶切缓冲液，EcoRI和HindIII限制性内切酶各1μl。同时，稀释1μg pCMV-Flag载体34μl无菌纯净水中，加入4μl的10×酶切缓冲液，EcoRI和HindIII限制性内切酶各1μl。两样品均在37℃孵育2h后，以PCR核酸回收试剂盒回收上述DNA片段。将酶切后的SETD5活性多肽的编码核酸和pCMV-Flag载体以7:1的比例混合，加入 2μl的10×T4连接酶缓冲液和1μl的T4连接酶，加入无菌纯净水至总体积为20μl，室温孵育1h。将连接好的重组表达载体样品2μl转化入100μl的DH5α感受态大肠杆菌后涂板至Amp琼脂板中，37℃细菌培养箱中培养过夜。将单菌落接种至LB液体培养基中培养 8h，以菌液PCR鉴定重组表达载体，最后以Sanger测序验证重组载体序列的正确性。结果表明SETD5活性多肽重组表达载体构建成功[图1]。

2.脂质体导入SETD5活性多肽表达载体至人胰岛β细胞中

以DMEM添加20％胎牛血清和1×谷氨酰胺添加剂培养人胰岛β细胞系EndoC-βH1，将细胞以60-70％的融合度接种于6孔板中，在培养箱中孵育过夜。待细胞完全贴壁后，配制脂质体质粒复合物：将2μg的SETD5活性多肽表达载体和6μl的脂质体2000分别加入 100μl的Opti-mem培养基中，孵育5分钟后，将上述载体和脂质体混合，室温继续孵育15 分钟。之后均匀加入培养的EndoC-βH1细胞系中，轻柔晃动保证脂质体质粒复合物均匀分散至培养基中，孵育6h后，将细胞更换为正常的完全培养基培养。培养36h后，收集细胞以100μl的1×SDS-PAGE上样缓冲液裂解细胞，煮沸5分钟，将样品上样至12％ SDS-PAGE 电泳分离蛋白样品，进行免疫印迹检测SETD5活性多肽在人胰岛β细胞中的表达。结果表明，脂质体导入后SETD5活性多肽在人胰岛β细胞系中有显著表达[图2]。

实施例2：SETD5活性多肽促进人胰岛β细胞中β-catenin的转录活性

如上所述，以脂质体导入SETD5活性多肽至EndoC-βH1人胰岛β细胞系中，并且以脂质体导入TOPflashβ-catenin报告载体系统至EndoC-βH1人胰岛β细胞系中，以荧光素酶检测试剂盒检测β-catenin报告基因转录活性的变化，结果表明SETD5活性多肽可显著提升β-catenin报告基因转录活性[图3]。

实施例3：SETD5活性多肽促进人胰岛β细胞增殖

如上所述，以脂质体导入SETD5活性多肽至EndoC-βH1人胰岛β细胞系中。孵育36h后，加入50μM 5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)孵育4h，利用EdU细胞增殖检测试剂盒(锐博生物)检测对照及SETD5活性多肽表达的胰岛β细胞增殖能力的差异。结果表明， SETD5活性多肽可显著促进人胰岛β细胞中EdU核苷的掺入，提示其可促进人胰岛β细胞的增殖[图4]。

实施例4：SETD5活性多肽可促进人胰岛β细胞再生相关基因的表达

以脂质体导入SETD5活性多肽至EndoC-βH1人胰岛β细胞系中，待培养36h后，以Trizol试剂收集并分离细胞总RNA。将1μg的总RNA以RevertAid第一链cDNA反转录试剂盒按照产品说明书反转录成cDNA，进而进行RT-PCR检测人胰岛β细胞再生相关基因的表达，如Oct4，c-myc和CD44。结果表明，SETD5活性多肽可显著促进人胰岛β细胞再生相关基因的表达[图5]。

本发明是基于人胰岛β细胞具有自我再生和增殖的特点，发明一段促胰岛β细胞再生的生物活性多肽以诱导人胰岛β细胞自我再生，具有潜在的应用于人糖尿病治疗的潜能，本发明公开这段促胰岛β细胞再生多肽的蛋白序列及编码核酸序列。细胞水平的研究表明，促胰岛β细胞再生多肽具有促进Wnt/β-catenin通路活化和胰岛β细胞增殖及再生相关基因表达的潜能。本发明提供临床前促人胰岛β细胞再生干预性生物活性多肽，在糖尿病发生过程中胰岛β细胞再生相关靶向治疗方面开发具有重要的应用前景。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。