CX3CR1拮抗剂在制备用于治疗认知障碍的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药制备技术领域，涉及CX3CR1拮抗剂在制备用于治疗认知障碍的药物中的应用，尤其涉及JMS-17-2作为CX3CR1拮抗剂在制备用于治疗认知障碍的药物中的应用。

背景技术

平原人群急进高原因低氧低压、寒冷干燥等地理气候特点可引发机体组织器官的强烈不适，诱发急性高原病，引发高原认知障碍。临床上，高原认知障碍表现为反应时间延迟、注意力持续时间缩短、执行能力下降以及工作记忆丧失，认知障碍与海拔高度、暴露时间呈正相关。目前，临床上没有特效针对高原认知障碍的药物，常规药物手段以增强睡眠为手段，通过缓解睡眠障碍来防治认知障碍。包使用唑吡坦、扎来普隆、乙酰唑胺等。或者使用老年痴呆的药物，譬如多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏等抗胆碱酯酶抑制剂或美金刚等兴奋性氨基酸受体拮抗剂等。上述药物均存在针对性弱、效果差异大、价格昂贵等缺点。

近年来的最新研究认为，小胶质细胞在突触修建和维持突触可塑性中起重要的调节作用。特异性表达在小胶质细胞上的CX3CR1可以识别来自神经元分泌的CX3CL1，通过“Find me”信号，介导小胶质细胞对受损神经元的吞噬。由于CX3CR1是CX3CL1的唯一受体，靶向CX3CR1可通过阻断神经元与小胶质细胞的交流，阻止高原低氧下过分活化的小胶质细胞对突触体的吞噬作用，从而有效防治高原认知障碍。

JMS-17-2是一种新型小分子，是一种有效的选择性CX3CR1拮抗剂，IC50为0.32nM。JMS-17-2是一种抑制的抗肿瘤药物，可降低乳腺癌细胞的转移和定植，显著减少小鼠骨骼和内脏器官中的肿瘤。目前，关于JMS-17-2在神经系统疾病中中的治疗未见研究和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供CX3CR1拮抗剂在制备用于治疗认知障碍的药物中的应用。CX3CR1拮抗剂可以通过抑制CX3CL1/CX3CR1信号，减轻小胶质细胞对神经元的吞噬，减少海马区神经突触的丢失，减轻记忆损伤，对低压低氧暴露诱发的认知障碍具有良好的治疗作用。

为解决上述技术问题，本发明提供了CX3CR1拮抗剂在制备用于治疗认知障碍的药物中的应用，所述认知障碍为低压低氧环境暴露导致的认知障碍。

进一步的，所述CX3CR1拮抗剂为JMS-17-2，JMS-17-2的分子式为C

进一步的，所述低压低氧环境暴露为急性高原暴露。

进一步的，所述治疗认知障碍的药物为通过减轻神经元突触丢失进行认知障碍治疗的药物。

进一步的，所述治疗认知障碍的药物为通过抑制CX3CL1和/或CX3CR1信号减轻神经元突触丢失进行认知障碍治疗的药物。

进一步的，所述JMS-17-2为单独使用或与其他药物联合使用。

进一步的，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。

在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用JMS-17-2或与将JMS-17-2与其他药物配合制备成在临床上可以使用的颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。

进一步的，所述药物的给药方式为口服给药或注射给药。

与现有技术相比，本发明通过利用JMS-17-2抑制CX3CL1/CX3CR1信号，减轻小胶质细胞对神经元的吞噬，减少海马区神经突触的丢失，减轻记忆损伤，对低压低氧环境暴露诱导的认知障碍有明显的治疗作用，具有效果明显，针对性强等优点。由于JMS-17-2是一种抗肿瘤类药物，已在临床推广，故本发明的临床推广风险较低。

附图说明

图1为对照小鼠、低压低氧暴露小鼠、CX3CR1敲除小鼠、低压低氧暴露的CX3CR1敲除小鼠，通过Morris水迷宫实验考察其记忆能力的结果系列图；A：低压低氧暴露诱导的认知障碍小鼠模型的构建及处理图；B：4组小鼠在Morris Training期间，每日寻找到平台的时间；C：Morris Test实验中，4组小鼠在水迷宫中的运行轨迹图；D：Morris Test实验中，4组小鼠寻找到平台区域的延迟时间；E：Morris Test实验中，4组小鼠在平台区域的游动距离占总游动距离的比例；F：Morris Test实验中，4组小鼠进入区域的次数；G：Morris Test实验中，4组小鼠的平均游泳速度；图中缩写含义如下：HH：低压低氧；MWM：Morris水迷宫；WT-NN：对照组；WT-HH：模中的型组；KO-NN：CX3CR1敲除的对照组；KO-HH：CX3CR1敲除的模型组。n.s.表示无显著差异；

图2为对照小鼠、低压低氧暴露小鼠、CX3CR1敲除小鼠、低压低氧暴露的CX3CR1敲除小鼠，大脑海马CA1区的神经突触数量变化图；A：4组小鼠脑部CA1区Synaptophysin免疫荧光染色图；B：图A中Synaptophysin信号强度统计图；C：4组小鼠脑部CA1区PSD95免疫荧光染色图；D：图D中PSD95信号强度统计图；图中缩写含义如下：WT-NN：对照组；WT-HH：模型组；KO-NN：CX3CR1敲除的对照组；KO-HH：CX3CR1敲除的模型组。n.s.表示无显著差异；

图3为对照小鼠、低压低氧暴露小鼠、腹腔注射JMS-17-2并低压低氧暴露的小鼠大脑海马CA1区的神经突触数量变化图；A：3组小鼠脑部CA1区Synaptophysin免疫荧光染色图；B：图A中Synaptophysin信号强度统计图；C：3组小鼠脑部CA1区PSD95免疫荧光染色图；D：图D中PSD95信号强度统计图；图中缩写含义如下：NN：对照组；HH：模型组；JMS-17-2+HH：治疗组；

图4为对照小胶质细胞、CX3CL1联合低氧暴露的小胶质细胞、CX3CL1+JMS-17-2联合低氧暴露的小胶质细胞对突触小体吞噬能力改变的荧光示踪图及统计图；图中缩写含义如下：Nor-Con：常氧对照组；Hyp-Con：低氧组；Nor-CX3CL1：CX3CL1处理组；Hyp-CX3CL1：低氧联合CX3CL1处理组；Nor-JMS-17-2+CX3CL1：JMS-17-2联合CX3CL1处理组；Hyp-JMS-17-2+CX3CL1：JMS-17-2、CX3CL1联合低氧处理组。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所用的JMS-17-2，CAS号为2341841-07-2，分子式为C

本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。

实施例1

敲除CX3CR1减轻低压低氧暴露诱导的高原认知障碍小鼠记忆损伤实验：

使用32只56日龄CX3CR1的敲除小鼠(KO)及32只56日龄同窝野生型对照小鼠(WT)进行实验。首先，对32只小鼠进行为期7天的Morris training实验。具体方法如下：

56日龄(day0)：小鼠在Morris水迷宫中自由游泳，每只小鼠游泳5分钟以适应环境。

57日龄(day1.1)：16只WT、16只KO小鼠进行Morris training训练第一阶段：

1)水迷宫为1.5米正圆形水池，并划分为4个象限，分别为东南(SE)、东北(NE)、西南(SW)、西北(NW)。首先在SE象限正中放置一直径为20cm的圆形平台。在水池中注入深度为18cm、温度为22±1℃的温水，将平台露出水面2厘米，确保小鼠在水中可以观察到平台。

2)将1号小鼠背对水池放入SE象限中，使其自由游泳90s，如果小鼠在90s中攀登至平台，则允许其在平台上停留30s；如小鼠在90s中未能找到平台，则使用导引棒将其引导至平台上，并允许其在平台上停留30s。

3)将1号小鼠依次放入NE、SW、NW三个象限，重复2)的实验，以加深小鼠对平台的记忆。

4)1号小鼠完成4个象限的寻找平台训练后，更换下一只小鼠，直至32只小鼠全部完成寻找平台训练。

5)更换平台至象限NE，并重复实验2)至4)。

6)更换平台至象限SW，重复实验2)至4)。

7)更换平台至象限NW，重复实验2)至4)。

8)最终，每只小鼠共接收了16次训练。该训练方案的目的是确保小鼠可以准确识别平台，且不受光照位置、坐标以及其他干扰因素影响。由于32只小鼠完成Morristraining训练第一阶段需要20个小时，故另32只小鼠次日完成Morris training训练第一阶段。

58日龄(day1.2)：余下的16只WT、16只KO小鼠进行Morris training训练第一阶段。

59日龄-63日龄(day2-day6)：32只WT、32只KO小鼠进行Morris training训练第二阶段：

1)在与第一阶段相同的水迷宫中，在SE象限正中放置一直径为20cm的圆形平台。在水池中注入深度为21cm、温度为22±1℃的温水，将平台没入水下1cm。在水中投放食品级白色素，以确保小鼠无法在水中观察到平台。

2)将1号小鼠背对水池放入NW象限中，使其自由游泳90s，使用小鼠轨迹跟踪软件记录小鼠游动到平台上所需的时间。如果小鼠无法找到平台，则使用导引棒将其引导至平台上，允许其在平台上停留30s，并记录其游动到平台上所需的时间为90s。

3)更换下一只小鼠，直至32只小鼠全部完成训练。

4)每日进行一次训练，连续6日。记录每日小鼠游动到平台上所需的时间，并绘制训练日-找寻时间(Escape Latency)折线图。

根据连续5日的第二阶段训练结果，对小鼠进行筛选，剔除不符合实验标准的小鼠。剔除标准如下：

1)小鼠无法寻找到平台，即认为该小鼠的学习能力显著低于其他的小鼠，予以剔除。

2)小鼠的曲线不符合“训练日程与找寻平台时间呈负相关”的基本规律，例如，在day2和day3小鼠寻找到平台的时间为20s，但day4和day5小鼠寻找平台延迟至40s，则认为该小鼠的记忆能力显著低于其他小鼠，予以剔除。

3)小鼠在水迷宫中的具有异常表现，包括但不限于：具有明显的恐水现象，譬如发抖、沉底；游泳速度过快、过慢或静止不动；拒绝平台，无论如何导引都不愿登上平台等。

根据上述标准完成筛选后，WT、KO两基因型最终均保留24只表现正常、可进行后续的实验的小鼠。对每个基因型的24只小鼠进行分配，各分为NN和HH两个小组，并确保训练曲线组间无差异。随后，4组小鼠进行下述实验：

(1)对照组(WT-NN)：12只25g雄性野生型64日龄小鼠。

(2)模型组(WT-HH)：12只25g雄性野生型64日龄小鼠，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

(3)CX3CR1敲除的对照组(KO-NN)：12只25g雄性64日龄CX3CR1敲除小鼠。

(4)CX3CR1敲除的模型组(KO-HH)：12只25g雄性64日龄CX3CR1小鼠，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

低压低氧(HH)暴露完成后，66日龄小鼠立即进行Morris水迷宫检测实验(MWMTest)：

1)使用与MWM Training阶段相同的水迷宫，但SE象限不再放置平台。在水池中注入深度为21cm、温度为22±1℃的温水。在水中投放食品级白色素，以确保小鼠无法在水中视物。

2)将1号小鼠背对水池放入NW象限中，使其自由游泳90s，使用小鼠轨迹跟踪软件记录小鼠游动到原平台区域所需的时间，跟踪小鼠游泳轨迹，记录小鼠穿越平台区域的次数和停留时间，计算小鼠在平台区域游动的距离占整体游动距离的占比。

3)更换下一只小鼠，直至32只小鼠全部完成检测。

4)由于小鼠已获得了SE象限存在平台的记忆，小鼠会自觉游向平台位置，并在该位置盘旋找寻以期望登上平台脱离水环境。此时，小鼠游动到原平台区域所需要的时间越短、游泳轨迹在平台区域越集中、穿越平台的次数越多、在平台区域游动的距离比例越大、停留在平台区域的时间越长，表明小鼠对平台的记忆越深刻。

综上，实验设计及实验结果如图1所示：

图1A为上述全部实验的设计流程，即56日龄小鼠进行水迷宫实验适应，57-63日龄小鼠进行为期7天的Morris training训练，64日龄小鼠进行为期48h的HH暴露，暴露结束即刻进行Morris Test实验。图1B为在MWM Training实验后，4组小鼠找到平台的训练日-找寻时间(Escape Latency)图，可观察到4组小鼠寻找到平台的时间曲线无明显差异，反映各组小鼠对平台的记忆没有差异。图1C为HH暴露后，4组小鼠在MWM Test实验中的运行轨迹图。可观察到WT-HH与WT-NN相比，WT-HH小鼠的游泳轨迹更为混乱；而KO-HH与KO-NN相比，KO-HH小鼠的游泳轨迹没有明显差别。图1D为HH暴露后，4组小鼠在MWM Test实验首次游动到平台所在区域所使用的时间。可观察到WT-HH与WT-NN相比，WT-HH小鼠所使用的时间更长；而KO-HH与KO-NN相比，KO-HH小鼠的所使用的时间没有明显差别。图1E为HH暴露后，4组小鼠在MWMTest实验在平台区域游动的距离占总游动距离的比例。可观察到WT-HH与WT-NN相比，WT-HH小鼠在平台区域的游动距离更短；而KO-HH与KO-NN相比，KO-HH小鼠在平台区域的游动距离没有明显差别。图1F为低压低氧暴露后，4组小鼠在MWM Test实验进入平台区域的次数。可观察到WT-HH与WT-NN相比，WT-HH小鼠进入平台区域的次数减少，而KO-HH与KO-NN相比，KO-HH小鼠进入平台区域的次数没有明显差别。图1F为低压低氧暴露后，4组小鼠MWM Test实验中的平均游泳速度。可观察到4组小鼠的游泳速度没有明显差别。因此，证明HH暴露后，WT小鼠的认知功能明显受损，表现为记忆能力的显著下降；而敲除CX3CR1的小鼠，在HH前后没有表现出记忆能力的改变，证明抑制CX3CR1可以有效改善HH暴露对小鼠认知能力的影响。

实施例2

敲除CX3CR1减轻低压低氧暴露诱导的高原认知障碍小鼠大脑海马CA1区的神经突触丢失实验：

(1)对照组(WT-NN)：12只25g雄性野生型64日龄小鼠。

(2)模型组(WT-HH)：12只25g雄性野生型64日龄小鼠，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

(3)CX3CR1敲除的对照组(KO-NN)：12只25g雄性64日龄CX3CR1敲除小鼠。

(4)CX3CR1敲除的模型组(KO-HH)：12只25g雄性64日龄CX3CR1敲除小鼠，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

上述实验结束后，迅速剥离小鼠大脑，使用4％中性多聚甲醛固定小鼠大脑。使用30％的蔗糖溶液对大脑进行脱水后，OCT包埋脑组织，并使用冰冻切片机将大脑沿冠状面切成40μm厚度的脑切片。使用免疫荧光法标记大脑切片中的突触体标志物Synaptophysin或兴奋性突触后膜标志物PSD95，采用DAPI染细胞核，最后使用激光共聚焦显微镜，拍摄海马CA1区域。拍摄结果由图2所示。图2A为Synaptophysin与DAPI双染的显微成像结果图，其中，上下两条致密的蓝色DAPI所围的中间区域为CA1区。图2B为2A的统计图，统计CA1区域中，绿色荧光信号Synaptophysin的平均荧光强度。由图2A和图2B可知，WT-HH小鼠海马CA1区Synaptophysin较WT-NN明显减少；而CX3CR1-HH小鼠海马CA1区Synaptophysin与CX3CR1-NN组相比，没有明显差异，表明抑制CX3CR1后，低压低氧暴露对海马CA1区Synaptophysin水平不发生影响。图2C为PSD95与DAPI双染的显微成像结果图，其中，上下两条致密的蓝色DAPI所围的中间区域为CA1取。图2D为2C的统计图，统计CA1区域中，红色荧光信号PSD95的平均荧光强度。由图2C和2D可知，WT-HH小鼠海马CA1区PSD95较WT-NN明显减少；而CX3CR1-HH小鼠海马CA1区PSD95与CX3CR1-NN组相比，没有明显差异，表明抑制CX3CR1后，低压低氧暴露对海马CA1区PSD95水平不发生影响。由于Synaptophysin的含量反映了神经突触数量，PSD95的含量反应了兴奋性神经突触的数量，因此，证明抑制CX3CR1可以有效改善低压低氧暴露诱导的突触丢失现象。

实施例3

JMS-17-2减轻低压低氧暴露诱导的高原认知障碍小鼠大脑海马CA1区的神经突触丢失实验：

(1)对照组(NN)：4只25g雄性64日龄小鼠。

(2)模型组(HH)：4只25g雄性64日龄小鼠，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

(3)治疗组(JMS-17-2+HH)：4只25g雄性64日龄小鼠，腹腔注射10mg/kg JMS-17-2后，在模拟海拔7000米的低压低氧舱中暴露48小时。

上述实验结束后，迅速剥离小鼠大脑，使用4％中性多聚甲醛固定小鼠大脑。使用30％的蔗糖溶液对大脑进行脱水后，OCT包埋脑组织，并使用冰冻切片机将大脑沿冠状面切成40μm厚度的脑切片。使用免疫荧光法标记大脑切片中的突触体标志物Synaptophysin或兴奋性突触后膜标志物PSD95，采用DAPI染细胞核，最后使用激光共聚焦显微镜，拍摄海马CA1区域。拍摄结果由图3所示。由图3A为Synaptophysin与DAPI双染的显微成像结果图，其中，上下两条致密的蓝色DAPI所围的中间区域为CA1区。图3B为3A的统计图，统计CA1区域中，绿色荧光信号Synaptophysin的平均荧光强度。由图3A和图3B可知，HH小鼠海马CA1区Synaptophysin较NN组明显减少；而JMS-17-2+HH组与HH组相比，JMS-17-2+HH组小鼠海马CA1区Synaptophysin明显增加，表明抑制CX3CR1后减轻了低压低氧暴露造成的Synaptophysin减少。图3C为PSD95与DAPI双染的显微成像结果图，其中，上下两条致密的蓝色DAPI所围的中间区域为CA1取。图3D为3C的统计图，统计CA1区域中，红色荧光信号PSD95的平均荧光强度。由图3C和3D可知，HH小鼠海马CA1区PSD95较NN明显减少；而JMS-17-2+HH组与HH组相比，JMS-17-2+HH组小鼠海马CA1区PSD95明显增加，表明抑制CX3CR1后，表明抑制CX3CR1后减轻了低压低氧暴露造成的PSD95的减少。由于Synaptophysin的含量反映了神经突触数量，PSD95的含量反应了兴奋性神经突触的数量，因此，证明抑制CX3CR1可以有效改善低压低氧暴露诱导的突触丢失现象。

实施例4

JMS-17-2减轻低氧联合CX3CL1诱导的小胶质细胞吞噬突触小体的数量实验：

(1)对照组(Nor-Con)：原代培养的新生小鼠小胶质细胞。

(2)低氧组(Hyp-Con)：原代培养的新生小鼠小胶质细胞，在1％的O

(3)CX3CL1处理组(Nor-CX3CL1)：原代培养的新生小胶质细胞，经50ng/ml CX3CL1处理4小时。

(4)低氧联合CX3CL1处理组(Hyp-CX3CL1)：原代培养的新生小胶质细胞，在1％的O

(5)JMS-17-2联合CX3CL1处理组(Nor-JMS-17-2+CX3CL1)：原代培养的新生小胶质细胞，在50ng/ml JMS-17-2处理20小时后，联合50ng/ml CX3CL1处理4小时。

(6)JMS-17-2、CX3CL1联合低氧处理组(Hyp-JMS-17-2+CX3CL1)：原代培养的新生小胶质细胞，在50ng/ml JMS-17-2联合1％的O

上述实验结束后，立即给细胞添加神经元突触体，并继续培养30min，随后立即使用4％中性多聚甲醛固定。利用免疫荧光法标记小胶质细胞标志物Iba1和突触体标志物Synaptophysin，并使用激光共聚焦显微经对细胞进行拍照，并统计单个细胞中Synaptophysin信号强度，结果如图4所示，Iba1阳性的细胞中Synaptophysin信号强度越高，表明小胶质细胞吞噬突触体的能力越强。图4左边为免疫荧光的显微成像图，图4右边为每个Iba1阳性的细胞中Synaptophysin信号强度统计图。由图4可知，Hyp-Con与Nor-Con相比，Hyp-Con组Iba1阳性细胞吞噬的突触小体数量明显增加，表明低氧促进了小胶质细胞对突触体的吞噬；Hyp-CX3CL1与Nor-CX3CL1相比，Hyp-CX3CL1吞噬的突触小体数量明显增加，证明添加CX3CL1可在低氧和常氧情况下均增强小胶质细胞对突触小体的吞噬作用；Hyp-JMS-17-2+CX3CL1与Nor-JMS-17-2+CX3CL1相比，Hyp-JMS-17-2+CX3CL1组没有表现出吞噬突触小体能力的明显变化，证明抑制CX3CR1后，低氧联合CX3CL1处理对小胶质细胞吞噬突触的影响能力消失。因此，证明抑制CX3CR1可以有效减轻低氧联合CX3CL1诱导的小胶质细胞对突触小体的吞噬作用。