一种IL21-NKG2D CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗的细胞药物领域，特别是涉及一种IL21-NKG2D CAR-T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM)是一类致命的进行性血液系统恶性肿瘤，来源于产生抗体的浆细胞。MM是第二大血癌，占全球癌症相关死亡人数的2％。在过去的几十年里，MM的病理生理学和药物发现都取得了进展，然而对于晚期复发难治型肿瘤患者，目前治疗手段依然存在明显不足在。

近年来，一种新的肿瘤免疫疗法---嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR-T)逐渐走入人们的视野，CAR-T疗法英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，并且一些临床前和临床试验结果显示，CAR-T疗法在对MM治疗中取得了令人鼓舞的治疗效果，但是这种特定的疾病依然还没有治愈的方法。

因此，寻找更有效的靶点从而增强CAR-T细胞治疗MM的疗效依然是现阶段迫在眉睫的事件。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种IL21-NKG2D CAR-T细胞及其制备方法和应用，得到的IL21-NKG2D CAR-T细胞可特异性靶向NKG2D配体蛋白高表达的多发性骨髓瘤(MM)细胞，可以在制备治疗MM的药物中进行应用。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种IL21-NKG2D CAR-T细胞，所述IL21-NKG2D CAR-T细胞在T细胞内表达IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。

优选地，所述T细胞能够共表达细胞因子IL21，并且其表面表达NKG2D分子，所述T细胞的胞内由4-1BB-CD3ζ分子传递T细胞活化信号。

优选地，所述IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中IL21、NKG2D-ECT、CD8hinge、CD8TM、4-1BB、CD3ζ的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～6所示。

优选地，IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

优选地，所述T细胞来源于人外周血T淋巴细胞。

本发明还提供了一种IL21-NKG2D CAR-T细胞的制备方法，包括：

(1)合成和扩增IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；

(2)将慢病毒表达载体质粒和包装质粒共转染于HEK293T细胞中，进行慢病毒包装和制备慢病毒；

(3)分离人外周血T细胞、培养扩增，并利用步骤(2)得到的慢病毒感染T细胞，使所述T细胞表达IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到IL21-NKG2D CAR-T细胞。

优选地，步骤(1)中，IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。

优选地，步骤(2)中，采用慢病毒表达载体质粒pRRLSIN和包装质粒pMD2.G/pCMVR8.74共转染。

优选地，步骤(3)中，将T细胞密度调整至500万/ml，然后按病毒：细胞＝1：5比例添加病毒。

本发明又提供了上述IL21-NKG2D CAR-T细胞在制备治疗多发性骨髓瘤(MM)的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明采用嵌合抗原受体修饰和改造T细胞，将IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ分子在T细胞内表达，使改造后的T细胞能够特异性识别和杀伤MM细胞，得到的细胞具备更高效的抗MM活性。

附图说明

图1显示了慢病毒质粒pRRLSIN-IL21-NKG2D和pRRLSIN-NKG2D载体图。

图2显示了NKG2D CAR及IL21-NKG2D CAR的构建图及利用FITC标记的NKG2D抗体通过流式检测不同CAR转导到T细胞中后第七天的侵染效率图。

图3显示了NKG2D-CAR T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。

图4显示了共表达细胞因子IL21能够增强NKG2D-CAR T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用及促进CAR T细胞的增殖。

图5显示了地塞米松增强IL21-NKG2D-CAR T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。

图6显示了IL21-NKG2D-CAR T细胞在体内的抗多发性骨髓瘤活性。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

一、慢病毒介导的CAR分子构建及慢病毒的制备，步骤如下：

慢病毒介导的CAR分子构建：通过基因合成NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ(NKG2D CAR)及IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ(IL21-NKG2D CAR)的融合基因序列(氨基酸序列见序列表SEQID NO：7和8；CAR结构设计图见图2A)，然后通过酶切、连接将融合基因序列插入到慢病毒载体pRRLSIN中(原始质粒购自Addgene，货号：#12252；在原始质粒基础上，我们进行了改造，去除了GFP序列)。接着，进一步经过质粒转化、氨苄青霉素筛选获得阳性克隆，通过克隆质粒提取、质粒测序，获得构建成功的重组质粒，质粒图谱见图1所示。

IL21-NKG2D-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中IL21、NKG2D-ECT、CD8 hinge、CD8 TM、4-1BB、CD3ζ的氨基酸序列以及NKG2D CAR及IL21-NKG2D CAR融合蛋白的氨基酸序列如下表所示：

慢病毒的制备：在转染前24小时，将八百万个HEK293T细胞接种到直径为15cm的培养皿中，并充分混匀使得细胞均匀分布于培养皿中。第二天，待细胞汇合度达80％左右进行转染实验，采用深圳市百恩维生物科技有限公司的高效转染试剂盒(货号：BW11002)按照说明书将pRRLSIN重组质粒及包装质粒pMD2.G/pCMVR8.74共转染到HEK293T细胞中。转染过夜后，更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液(收完病毒上清后暂时放在4℃)。将2次收集的病毒上清液合并，并500g、25℃离心10分钟，再用0.45μm的PES膜过滤。最后，将已过滤的含慢病毒的上清液利用超速离心法进行病毒浓缩，离心结束后，去除上清，加入100μlPBS进行病毒重悬，收集病毒上清，置于-80℃保存备用。

二、IL21-NKG2D CAR-T细胞的制备，步骤如下：

募集志愿者用肝素瓶采外周血50ml，在无菌条件下，利用Lympholyte-H人淋巴细胞分离液(Cedarlane，货号：CL5020)，按照试剂说明书进行外周血单核细胞(PBMC)的分离。然后，利用CD3/CD28 beads(德国美天旎)纯化出T细胞，加到相应完全培养基中进行培养。第二天，将T细胞密度调整至500万/ml，然后按病毒：细胞＝1：5比例添加病毒，同时添加4μg/ml polybrene和40ng/ml IL-2。继续培养四小时后，补加新鲜的完全培养基并将细胞密度调整至100万/ml，继续培养。每隔2～3天进行半量换液。大概10天后，CAR-T细胞可达10

结果显示：病毒侵染T细胞7天后，结果显示有40％～60％的细胞被侵染成功(图2B)，制备成IL21-NKG2D CAR-T及NKG2D CAR-T细胞。

测试例

一、IL21-NKG2D CAR-T细胞体外抗多发性骨髓瘤功能检测，步骤如下：

将多发性骨髓瘤细胞H929、OCI-My5和U266作为靶细胞，IL21-NKG2D CAR-T、NKG2DCAR-T及未转导病毒的T细胞(CTR)作为效应细胞，按不同效靶比(2:1、4:1、8:1、16:1)将效应细胞及靶细胞混合培养。利用LDH-Glo

结果显示：IL21-NKG2D CAR-T细胞及NKG2D CAR-T细胞在体外对多发性骨髓瘤细胞都具有显著的杀伤作用，且都能促进TNF-α以及IFN-γ的分泌(图3和图4)。另外发现，地塞米松能够增强IL21-NKG2D-CAR T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用(图5)。

二、IL21-NKG2D CAR-T细胞体内抗多发性骨髓瘤活性检测，步骤如下：

皮下瘤模型评估IL21-NKG2D CAR-T细胞的体内杀伤能力：取18只6～8周的NSG小鼠，每只小鼠皮下注射500万个OCI-My5细胞。然后待肿瘤可触及时，将小鼠随机分成3组，每组6只，分别为阴性组(PBS组)、对照组(NKG2D CAR-T组)及实验组(IL21-NKG2D CAR-T组)。每隔一周进行一次T细胞的尾静脉注射给药，连续3次。每4天测量一次肿瘤大小并称量一次小鼠体重，到第28天将小鼠进行安乐死。

结果显示：小鼠给予IL21-NKG2D CAR-T细胞治疗后，肿瘤体积显著较NKG2D CAR-T组小，以上进一步提示，IL21-NKG2D CAR-T细胞具备更强的肿瘤杀伤作用(图6)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。