一种人脂肪脱细胞外基质膜及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种人脂肪脱细胞外基质膜及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤是人体重要的组织器官，皮肤屏障作用可以保护人体免受外源性物质的入侵。当皮肤受到损伤时，愈合机制启动从而减少危害的发生，创面愈合不良会导致患者生活质量下降，严重时将危害人体健康，所以促进创面愈合问题是一个值得关注的社会问题。使用敷料来辅助创面愈合是常用的手段，其中纱布、棉垫、绷带等传统敷料由于价格低廉受到广泛应用。然而，传统敷料容易与伤口粘连并且没有促进创面愈合的功能。因此，生物活性高、生物相容性好、具有生物降解性及促愈合性的新型生物敷料受到广泛关注，其中以胶原蛋白为主的天然生物材料由于具有吸收渗液、止血、减少新生胶原蛋白降解、降低创面pH值、趋化成纤维细胞等功能而受到广泛关注。

胶原蛋白敷料不仅具有自身独特的性能，并且能够满足其他理想敷料的要求：比如作为保护屏障，阻隔细菌等外界因素，降低感染风险；具有透气性，能够提供和维护创面湿润的环境；进行敷料更换时，对创面无机械性损伤等。现在用于制备敷料产品的胶原蛋白原材料主要是从猪和牛等动物的皮肤或跟腱组织中提取，在提取过程中去除掉角蛋白、脂质以及其他抗原成分，提取制备工艺已相对成熟。然而，由于上述原材料多为猪和牛等异种来源，存在一定的免疫排斥风险，并且得到的胶原与人体胶原有差异且容易降解，性能较差。而以人源原材料多取自尸体，来源严重不足，导致制备成本和大规模生产成为问题，如何解决上述问题成为关键。

随着社会发展，中国肥胖人群增多，通过吸脂手术进行减肥的病人不断增加，吸脂手术后多余的脂肪组织来源丰富，但是未被合理利用，而是被作为一种医疗废物丢弃。脂肪细胞外基质主要由各类胶原蛋白组成，同时含有纤连蛋白，弹性蛋白、蛋白聚糖和生长因子等活性成分，可以为细胞提供良好的微环境，调节细胞行为，促进细胞增殖。因此，以吸脂脂肪为原材料制备以人源胶原为主要成分的生物材料，具有来源广泛，成本较低的优点，以及可大规模生产的可能，具备极好的临床应用前景和产品转化潜能。

以吸脂人脂肪为原材料，通过清洗，离心，机械破碎，酶处理制备成无细胞成分和油脂的人脂肪脱细胞外基质，进一步制备的水凝胶能够通过促进血管新生与调节巨噬细胞极化，在促进创面愈合中发挥良好治疗效果，此外在多种软组织再生修复中也发挥重要作用。然而，目前研究使用的脂肪脱细胞外基质水凝胶具有凝胶稳定性差、力学性能低、保存条件要求苛刻等局限性，极大限制了其产品化进程。因此亟需制备出一种具有机械强度高，稳定性好，生物活性好，易于保存和运输等优点，能够增加工业生产便捷性和临床应用的功能性的以吸脂人脂肪为原材料的生物敷料。

发明内容

为了制备出一种具有机械强度高，稳定性好，生物活性好，易于保存和运输等优点，能够增加工业生产和临床应用的便捷性的以吸脂获得的人脂肪为原材料的生物敷料，本发明提供了一种人脂肪脱细胞外基质膜的制备方法，所述制备方法以人源脂肪组织为原料，所述人源脂肪组织中含有人源脂肪细胞外基质中的生长因子、胶原和糖胺聚糖等成分。

进一步地限定，所述人源脂肪组织为异体人源或自身来源的吸脂获得的脂肪。

进一步地限定，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：

S1、选取异体人源或自身来源的吸脂获得的脂肪，经清洗，离心，机械破碎，离心，清洗，离心，析出油脂，清洗，酶处理，冻干，研磨制成无细胞成分和油脂的人脂肪脱细胞外基质粉末；

S2、将S1制得的人脂肪脱细胞外基质粉末溶解于含有0.01mol/LHCl的胃蛋白酶溶液中，配置成均匀流体状态的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液；所述胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，脂肪脱细胞外基质粉末与胃蛋白酶的质量比为10:1；

S3、利用0.1mol/LNaOH溶液将S2获得的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液的pH调节至7.4，根据机械强度需要在NaOH溶液中加入不同浓度的PBS溶液，使获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶溶液的PBS终浓度为0M-0.1M，形成人脂肪脱细胞外基质预凝胶，再将人脂肪脱细胞外基质预凝胶置于37℃，30min后即得到人脂肪脱细胞外基质水凝胶；

S4、将S3获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶置于无菌、温度不超过37℃的条件下干燥，初步获取人脂肪脱细胞外基质膜，然后加入足量S3中相同浓度不含NaOH的PBS溶液将初步获取的人脂肪脱细胞外基质膜浸湿并进一步增加强度，然后在无菌、温度不超过37℃条件下干燥，上述浸湿、干燥步骤重复3-5次，即得到不同机械强度的人脂肪脱细胞外基质膜。

进一步地限定，S1所述无细胞成分和油脂的人脂肪脱细胞外基质粉末具体制备方法如下：选取异体人源或自身来源的吸脂获得的脂肪，使用生理盐水清洗3-5次，每次清洗完毕进行离心，去除血细胞和下层水分；将脂肪使用大型组织研磨仪进行机械破碎，每次2-3分钟，重复3-5次，每次机械破碎间隔20-30秒，破碎完毕将组织进一步离心，去除上层油脂，取下层富含脂肪脱细胞外基质层备用；将上述离心得到的脂肪脱细胞外基质层经生理盐水清洗1-3次，每次清洗完毕进行离心，去除下层水分，加入等体积异丙醇，37℃恒温摇床，震荡1-2h，离心，去除异丙醇溶液，得到析出油脂后的脂肪组织；经生理盐水清洗1-3次；向获取的去除油脂的脂肪组织中加入含有55mmol/LNa

进一步地限定，所述清洗为每次15-20min，所述离心为每次5-10min，离心转速为12000rpm；所述摇床转速为50-100rpm；所述真空冷冻干燥具体方法为先抽真空到8.0Pa，温度保持在-30℃，干燥15h，再保持在-20℃，干燥15h，然后保持在20℃，干燥10h；所述匀浆机转速为300rpm/min。

进一步地限定，所述制备方法还包括在S2获得人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液中，和/或S3所述的人脂肪脱细胞外基质水凝胶溶液中，和/或S4所述的PBS溶液中添加生物活性剂和生物相容性聚合物中的一种或两种。

优选地，将生物活性剂与S2中制备的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液或S3中制备获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶溶液均匀混合进行活性物质的均匀负载；将生物活性剂溶于S4浸润的PBS溶液中，进行活性物质负载，进一步增强促进损伤修复、预防控制感染、减少炎症反应等功能。

进一步地限定，所述生物活性剂包括促损伤修复、预防感染、抗炎、抗菌等活性物质。

所述生物活性剂可以选自各种细胞来源的细胞外囊破，包括干细胞来源的外泌体、凋亡小体，微囊泡等；还可以选自组织细胞活性提取物，包括细胞培养上清液、组织萃取液等。

所述生物活性剂可以选自多种效应物，当存在于损伤部位时，它们可以促进受影响组织的愈合和再生。除了促进或加速愈合的化合物或试剂之外，效应物可能还包括预防感染的化合物或试剂(如抗菌剂和抗生素)、减少炎症的化合物或试剂(如抗炎剂)、防止或最小化粘连形成的化合物，例如，氧化再生纤维素、抑制免疫系统的化合物或试剂(如免疫抑试剂)，以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自富含血小板的血浆、自体生长因子、细胞因子、血小板、异源生长因子、蛋白质、肽、抗体、酶、糖蛋白、激素、糖胺聚糖、核酸、止痛剂、病毒、病毒颗粒、细胞类型、治疗剂、抗炎剂、抗排异剂、趋化剂、生长剂、分化剂、生长剂片段、分化剂片段以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自各种临床批准应用的抗菌因子包括庆大霉素、头孢噻肟、夫西地酸、克林霉素、万古霉素等抗生素；碘胺嘧啶银、亚甲蓝、结晶紫、蜂蜜等抗菌成分以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自临床批准使用的促进创面愈合的乙二胺四乙酸(EDTA)、尿囊素、泛醇、核黄素等小分子物质以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自抗生素、甾类止痛剂、非甾类止痛剂、免疫抑制剂、抗癌药物、短期肽、骨形态发生蛋白、糖蛋白、脂蛋白、细胞附着介体、生物活性配体、整合素结合序列、配体，以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自表皮生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素衍生生长因子、转化生长因子、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽、音猬因子、生长分化因子、重组人类生长因子、软骨源形态发生蛋白、小分子、影响特异性生长因子上调的小分子，以及上述物质的组合。

此外，生长因子可以是由血液中的血小板提供的自体生长因子，血液中可能有与血小板正态相关的各种生长因子。如果其他这类物质在整形外科领域有治疗价值，则预计至少其中的一些物质可用于本发明中，这类物质应被“生物活性剂”的含义所涵盖，除非以其它方式明确定义。

所述生物活性剂可以选自生腱蛋白-C、透明质酸、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、饰胶蛋白聚糖、凝血弹力蛋白、凝血酶衍生肽、肝素结合域、肝素、硫酸乙酰肝素、DNA片段、DNA质粒，以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自姜黄素、槐角染料木黄酮、大黄素等中药提取物，以及上述物质的组合。

所述生物活性剂可以选自非诺贝特、二甲双胍、多西紫杉醇等临床广泛应用药物。

优选地，将生物相容性聚合物与S2制备的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液或S3制备的人脂肪脱细胞外基质水凝胶溶液共同制备人脂肪脱细胞外基质和聚合物的复合物，进一步增强人脂肪脱细胞外基质膜的生物相容性，加固以提高其机械强度。

进一步地限定，所述生物相容性聚合物选自生物相容性合成聚合物或生物相容性天然聚合物，所述生物相容性合成聚合物包括聚乙烯醇聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯、脂族聚酯、聚氨基酸、共聚醚-酯、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰氨基酯、含胺基的聚氧杂酯、聚酸酐、聚磷腈，所述生物相容性天然聚合物包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、肝素、氧化再生纤维素、胶原、弹性蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、明胶、生物可吸收淀粉。

本发明还提供了一种由上述制备方法获得的人脂肪脱细胞外基质膜。

本发明还提供了上述制备方法获得的人脂肪脱细胞外基质膜在制备用于软组织修复和组织再生生物医用材料中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次提出人脂肪脱细胞外基质膜的概念，并提供了人脂肪脱细胞外基质膜的制备方法，本方法制备的人脂肪脱细胞外基质膜具有机械强度高，稳定性好和生物活性好，易于保存和运输等优点，增加了工业生产和临床应用的便捷性，具体优点如下：

1.使用脂肪组织为原材料来源于人体，与猪和牛等动物组织制备产品相比，具有生物相容性好，生物活性高和免疫排斥风险小等优点。

2.使用的脂肪组织来源于吸脂手术的医疗废物，与其他人尸体来源产品相比，具有来源丰富，价廉易得，可大规模工业化生产的优点。

3.人脂肪脱细胞外基质膜具备机械强度高，稳定性好，易于保存和运输等优点，增加了工业生产和临床应用的便捷性。

4.在创面愈合治疗中，人脂肪脱细胞外基质膜作为保护屏障，能够阻隔细菌等外界因素，降低感染风险；能够提供和维护湿润的环境，具有良好透气性，可降解吸收，无需更换敷料，可降低更换敷料造成的伤口机械性损伤。

5.人脂肪脱细胞外基质膜制备过程中S2和S3步骤为均流流体，便于生物活性物质的负载，包括促进或加速愈合的效应物、预防感染的化合物或试剂、促进组织再生的效应物、减少炎症的化合物或试剂等；同时，人脂肪脱细胞外基质膜制备过程中S4需要反复浸润液体，浸润液体中可溶解活性物质，进而进一步进行上述活性物质的负载，并具有缓释功能。

附图说明

图1为实施例1制备获得的人脂肪脱细胞外基质膜的大体外观图；其中，图1中的a为实施例1中S2获得的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液，图1中的b为实施例1中S3获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶，图1中的c为实施例1中S4获得的人脂肪脱细胞外基质膜，图1中的d为将实施例1中S4获得的人脂肪脱细胞外基质膜进行折叠后的状态图，图1中的e为将实施例1中S4获得的人脂肪脱细胞外基质膜进行折叠后展开过程的状态图，图1中的f为实施例1中S4获得的人脂肪脱细胞外基质膜进行折叠后展平后的状态图；

图2为将实施例1获得的人脂肪脱细胞外基质膜敷于大鼠烧伤创面模型创口处的效果图；

图3为将实施例1获得的人脂肪脱细胞外基质膜敷于创面愈合模型后14天内的大体外观图及治疗效果图；其中，图3中的a为ADF促进创面愈合的创面实拍图，图3中的b为ADF促进创面愈合的模式整理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

实施例1：人脂肪脱细胞外基质膜的制备方法

S1、选取异体人源或自身来源的吸脂获得的脂肪，经生理盐水清洗3-5次，每次15-20分钟，每次清洗完毕进行离心5-10分钟，离心机转速为12000rpm，去除血细胞和下层水分；离心清洗完毕，将脂肪使用大型组织研磨仪进行机械破碎，每次2-3分钟，重复3-5次，每次机械破碎间隔20-30秒，研磨完毕将组织进一步离心5-10分钟，离心机转速为12000rpm，离心去除上层油脂，取下层富含脂肪脱细胞外基质层备用；将上述离心得到脂肪脱细胞外基质层经生理盐水清洗1-3次，每次15-20分钟，每次清洗完毕进行离心5-10分钟，离心机转速为12000rpm，去除下层水分加入等体积异丙醇，37℃恒温摇床，转速为50-100rpm，震荡1-2h；12000rpm离心5min，去除异丙醇溶液，得到析出油脂后的脂肪组织，经生理盐水清洗1-3次，每次15-20分钟；将获取的去除油脂脂肪组织加入含有55mmol/LNa

S2、配制人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液：将S1制得的人脂肪脱细胞外基质粉末溶解于含有0.01mol/LHCl的胃蛋白酶溶液中，配置成均匀流体状态的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液；所述胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，脂肪脱细胞外基质粉末与胃蛋白酶的质量比为10:1；

S3、制备人脂肪脱细胞外基质水凝胶：利用0.1mol/LNaOH溶液将S2获得的人脂肪脱细胞外基质蛋白溶液的pH调节至7.4，在NaOH溶液中加入PBS溶液，使获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶溶液的PBS终浓度为0.025M，形成人脂肪脱细胞外基质预凝胶，再将人脂肪脱细胞外基质预凝胶置于37℃，30min后即得到人脂肪脱细胞外基质水凝胶；

S4、制备人脂肪脱细胞外基质膜：将S3获得的人脂肪脱细胞外基质水凝胶置于无菌、温度不超过37℃的条件下干燥，初步获取人脂肪脱细胞外基质膜，然后加入足量浓度为0.025M的PBS溶液将初步获取的人脂肪脱细胞外基质膜浸湿并进一步增加强度，然后在无菌、温度不超过37℃条件下干燥，上述浸湿、干燥步骤重复3-5次，即得人脂肪脱细胞外基质膜。

性能研究：

下述性能研究选用的人脂肪脱细胞外基质膜均由实施例1制备获得。

1.大体外观以及微观结构

实施例1制备获得的人脂肪脱细胞外基质膜大体外观如图1所示，由图1可知水凝胶稳定性增强，基质膜强度高。其能够被随意折叠而不破碎，能耐受较强拉力而不断裂，便于临床应用。干燥状态下人脂肪脱细胞外基质膜其抗拉强度达到30.2±2.11MPa，润湿状态下人脂肪脱细胞外基质膜其抗拉强度达到5.2±1.32MPa。

2.治疗效果验证

在大鼠烧伤创面模型中，将人脂肪脱细胞外基质膜敷于创口，迅速吸收创面渗液，并紧密贴合创缘，能够提供和维护湿润的环境，作为保护屏障，阻隔细菌等外界因素，降低感染风险，并具有良好透气性。膜片呈现透明样，便于实时观察创面改变并及时处理(见图2)。

在创面愈合模型中14天的大体外观可以看出，相较于对照组，人脂肪脱细胞外基质膜(adiposetissue-derivedextracellularmatrixhydrogelfilm,ADF)处理组治疗的创面面积小上皮化更完整，创面长度更小，创面愈合效果明显优于空白对照组(见图3)。

综上可知，本发明制备获得的人脂肪脱细胞外基质膜适用于创面以及软组织再生治疗，能够密切贴合临床需要，具有较好的临床转化价值。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。