EAAT3抑制剂在制备预防和/或治疗脱髓鞘药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种EAAT3抑制剂在制备预防和/或治疗脱髓鞘药物中的应用。

背景技术

人类大脑约有50％是由白质构成的，但目前对白质损伤的病理机制了解有限。白质损伤导致的脱髓鞘是主要病理变化，脱髓鞘导致轴突变性和神经系统功能的逐渐恶化，是多种疾病如多发性硬化、视神经脊髓炎发病原因，也是脑外伤、痴呆症、阿尔兹海默症和抑郁症等主要病理变化。因此促进髓鞘的修复对白质损伤引起的上述疾病的治疗具有重要的意义。在大脑中负责髓鞘形成的细胞主要是少突胶质细胞，少突胶质细胞由少突胶质前体细胞经过增殖分化，继而分化为髓鞘化的少突胶质细胞包裹到轴突周围，进而形成髓鞘。因此促进髓鞘的修复的关键是促进少突胶质前体细胞的增殖、分化与髓鞘化为少突胶质细胞。

兴奋性氨基酸转运体3，作为EAATs家族的一员，既往研究表明其在维持神经传递和防止兴奋性毒性方面起着关键作用。值得注意的是，与其他EAA转运体相比，EAAT3表现出特异性，因为它主要存在于细胞内，只有约20％存在于质膜。因此，EAAT3可能参与了其他作用，而不是对EAA突触清除的贡献。当前已经发现多种小分子化合物与天然药物可以通过不同途径促进少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，但没有以兴奋性氨基酸转运体3(EAAT3，由SLC1A1编码)作为干预靶点去调控少突胶质细胞分化的研究报道。同时尽管白质损伤导致脱髓鞘的病理生理研究已有巨大进步，但尚无有效治疗手段。从疗效上看，脱髓鞘后痴呆发生率高，并发症、后遗症仍很多，严重损害患者情感、记忆、运动功能等。为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种EAAT3抑制剂在制备预防和/或治疗脱髓鞘药物中的应用。

为实现上述目的，在本发明的第一方面，本发明提供了EAAT3抑制剂在制备预防和/或治疗脱髓鞘药物中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂为PDC。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述脱髓鞘为白质损伤所致。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂能促进少突胶质前体细胞存活。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂能促进少突胶质前体细胞增殖。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂能促进少突胶质细胞存活。

本发明中的EAAT3抑制剂PDC，CAS号：120005-55-2，PubChem识别号3868，分子式：C

发明人前期研究发现，与其他神经细胞相比，EAAT3在少突胶质前体细胞(OPCs)中高度表达，而少突胶质前体细胞可增殖分化为成熟少突胶质细胞或髓鞘，因此说明EAAT3在白质修复或脱髓鞘中发挥潜在的作用；经发明人进一步研究发现，EAAT3抑制剂，具体地，EAAT3抑制剂PDC以EAAT3为靶点，能够干预EAAT3的水平，进而能够有效的用于白质损伤导致的脱髓鞘的治疗；同时，本发明通过体内实验采用双侧颈总动脉狭窄模型(BCAS手术模型)，体外实验采用细胞氧糖缺失模型(OGD模型)，模拟临床上慢性低灌注诱导的脑白质损伤，研究兴奋性氨基酸转运体3抑制剂PDC对白质损伤后少突胶质细胞的保护作用，得到的实验数据明确证实EAAT3抑制剂PDC能够有效的促进少突胶质前体细胞存活、增殖，并且能够促进少突胶质细胞存活，从而实现对脱髓鞘的治疗。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种预防和/或治疗脱髓鞘的药物，所述药物包括EAAT3抑制剂。

作为本发明所述预防和/或治疗脱髓鞘的药物的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂为PDC。

作为本发明所述预防和/或治疗脱髓鞘的药物的优选实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体。

优选地，所述药学上可接受的载体包括但不限于为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的至少一种。

作为本发明所述预防和/或治疗脱髓鞘的药物的优选实施方式，所述药物为片剂、丸剂、胶囊剂、口服剂、注射剂中的任意一种。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种预防和/或治疗脱髓鞘的药物组合物，所述药物组合物包括EAAT3抑制剂，和其他常见的预防和/或治疗脱髓鞘的药物。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述EAAT3抑制剂为PDC，所述其他常见的预防和/或治疗脱髓鞘的药物包括芬格莫德、特氟隆、醋酸格拉默、糖皮质激素、苯妥英钠、卡马西平中的任意一种。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开了EAAT3抑制剂在制备预防和/或治疗脱髓鞘药物中的应用，并且本发明通过实验证实了EAAT3抑制剂PDC能够有效的促进少突胶质前体细胞存活、增殖，促进少突胶质细胞存活，从而改善髓鞘损伤，进而促进白质损伤修复；因此能够将EAAT3抑制剂PDC用于单独的制备成预防和/或治疗脱髓鞘的药物，也可以作为其他预防和/或治疗脱髓鞘药物的辅助用药进行联合用药；即本发明拓宽了预防和/或治疗脱髓鞘药物类型，也为EAAT3抑制剂PDC挖掘出了新的药用价值。

附图说明

图1为EAAT3抑制剂PDC促进成熟少突胶质细胞标记物CNPase的表达水平结果图；

图2为EAAT3抑制剂PDC促进白质损伤代表性区域-胼胝体区的成熟少突胶质细胞(CNPase阳性细胞)的存活结果图；

图3为EAAT3抑制剂PDC促进成熟少突胶质细胞标记物MBP的表达水平结果图；

图4为EAAT3抑制剂PDC促进白质损伤代表性区域-胼胝体区的成熟少突胶质细胞(MBP阳性细胞)的存活结果图；

图5为EAAT3抑制剂PDC改善白质损伤代表性区域-胼胝体区的脱髓鞘作用结果图；

图6为EAAT3抑制剂PDC促进少突胶质细胞前体细胞标记物NG2的表达水平结果图；

图7为EAAT3抑制剂PDC促进白质损伤代表性区域-胼胝体区的少突胶质细胞前体细胞(NG2阳性细胞)的存活结果图；

图8为EAAT3抑制剂PDC促进白质损伤后少突胶质细胞前体细胞主要来源地区(侧脑室下区SVZ区)的少突胶质细胞前体细胞增殖结果图；

图9为体外原代培养的少突胶质细胞前体细胞验证结果图；

图10为EAAT3抑制剂PDC促进少突胶质细胞前体细胞的存活结果图；

图11为EAAT3抑制剂PDC促进少突胶质细胞前体细胞的增殖结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明所采用的试剂、动物和设备如下：

1、试剂

EAAT3抑制剂PDC，购买于Sigma-Aldrich，美国，由恒顺成生物有限公司代购，纯度＞98％，保存条件：避光，-20℃下保存；

TritonX-100：T8200，北京索莱宝科技有限公司；

封闭用山羊血清：SL038，北京索莱宝科技有限公司；

抗荧光衰减封片剂：S2110，北京索莱宝科技有限公司；

DMEM/F-12培养基：11330032，Gibco；

Neurobasal培养基：21103049，Gibco；

PDGF-AA：100-13A，Peprotech；

FGF：AF-100-18B，Peprotech；

B27添加剂(50X)无血清：17504044，Gibco；

N-2Supplement(100X)：17502048，Gibco；

T3：T-074，Sigma；

CNTF：HY-P7147，MCE；

EdU增殖检测试剂盒：C10310-1，广州锐博生物科技有限公司；

抗体：MBP(AF4085，Affinity)、NG2(DF12589，Affinity)。

2、实验动物

C57BL/6j：SPF级，雄性，9只，体重：25～30g，长沙斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002；动物饲养于桂林医学院附院医院SPF级实验动物中心，实验动物室温度20～26℃(日温差≤4℃)，湿度40～70％，照明12h：12h明暗交替。

3、实验设备及耗材

脑立体定位仪与高速颅骨磨钻：瑞沃德生命科技有限公司，深圳；

Thermo NX50冰冻切片机：ThermoFisher scientific公司，美国；

荧光显微镜：Leica DM4B，德国；

STS-3脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司，中国；

雪科制冰机：常熟市雪科电器有限公司，中国；

高速离心机：Eppendorf公司，德国；

Milli-Q超纯水机：Millipore公司，美国；

细胞操作超净台：苏州安泰空气技术有限公司，中国；

二氧化碳细胞培养箱：Thermo Scientific公司，中国；

水平恒温摇床：Eppendorf公司，德国；

高压蒸汽灭菌锅：厦门致微仪器有限公司，中国；

电热恒温鼓风干燥箱：北京中科环试仪器有限公司，中国；

倒置生物显微镜：Nikon公司，日本。

如无特殊说明，其余试剂、方法和设备均为本领域常规试剂、方法和设备。

实施例

本发明实施例探究EAAT3抑制剂PDC在预防和/或治疗脱髓鞘中的作用，具体包括以下方面：

1、分组

1.1动物分组及剂量设计

取9只C57BL/6j小鼠，分为3组，每组3只，分别为假手术组(Sham)、双侧颈动脉狭窄模型组(BCAS)、EAAT3抑制剂PDC实验组(PDC)，所有试验小鼠每天给药1次，连续给药14天，给药方式为侧脑室注射，其中EAAT3抑制剂PDC实验组给药为PDC的无菌生理盐水溶液(PDC给药剂量为40μg/kg)，假手术组和双侧颈动脉狭窄模型组给药为与EAAT3抑制剂PDC实验组等体积无菌生理盐水。其中在本发明的附图中，双侧颈动脉狭窄模型组记为BCAS模型组，EAAT3抑制剂PDC实验组记为BCAS+EAAT3抑制剂组。

1.2细胞分组

获取原代少突胶质前体细胞(OPC)后，将细胞按均匀密度接种于孔板中，随机分配形成3组，分别为对照组、OGD模型组和EAAT3抑制剂PDC实验组。其中在本发明的附图中，EAAT3抑制剂PDC实验组记为OGD+EAAT3抑制剂组。

2、试验

2.1双侧颈总动脉狭窄模型的建立

将健康小鼠固定在连有气体麻醉机的手术操作台上，调节空气流量计至3.0L/min，调节麻药剂量至3.5mL/min，待小鼠麻醉完全后将麻药浓度调整为1.5mL/min，气体流量计调至0.5L/min以维持后续操作，注意，本实验所使用的麻醉药为异戊烷。将小鼠固定，使手术部位充分暴露。备皮并消毒颈部皮肤，从颈部正中做一纵行切口。在体视镜下小心钝性分离皮下组织，用显微弯镊架起一侧颈总动脉，另一只显微弯镊夹持一个内径为0.18mm的微型簧线圈，从颈动脉分叉部下端快速旋转到颈总动脉上，同法套扎另一侧颈总动脉。操作过程中当心弹簧头端刺破颈总动脉。操作结束后手术线缝合伤口，消毒。术后将小鼠单笼放置在保温箱直至苏醒。

2.2原代少突胶质前体细胞提取及纯化

取新生乳鼠，麻醉后冰上取出其大脑皮层。在体视显微镜下小心剥离脑膜及血管。将组织剪碎加胰酶于培养箱中消化15分钟。加入含血取培养基终止消化，并将组织悬液过200目细胞筛。将收集的细胞悬液接种于多聚-D-赖氨酸包被的T75培养瓶中，并在含有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养12天。待混合胶质细胞生长铺满瓶底后，将细胞置于37℃的恒温摇床以200rpm/min摇晃1小时，以去除小胶质细胞。然后更换新的培养基静置4小时后再以220/min的速度水平震摇18小时。收集悬液于培养箱中静置30分钟以去除星形胶质细胞和小胶质细胞。收集非粘附细胞，并将其接种于添加有1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、10ng/mL PDGF-AA(100-13A，Peprotech)、10ng/ml FGF(AF-100-18B，Peprotech)、2％B27(17504044，Gibco)、1％N

2.3原代OPC的增殖情况

将纯化后的OPC接种于孔板中，培养至正常生长阶段。不同组别做相应的处理之后用含50μM的EdU培养基孵育2小时后，PBS清洗细胞三次，4％多聚甲醛固定30分钟，2mg/mL甘氨酸脱色摇床孵育5分钟，0.5％TritonX-100孵育10分钟，PBS清洗5分钟，每孔加入1XApollo染色反应液室温避光孵育30分钟，0.5％TritonX-100的PBS清洗两次。山羊血清封闭1小时，加入相应NG2一抗4℃过夜。PBS清洗，每次5min，共3次，加入相应的二抗后室温孵育2h。PBS清洗，每次5min共3次，最后封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

2.4LFB髓鞘染色

取小鼠脑组织并在4％多聚甲醛中固定48小时。用冷冻切片机将组织切成10微米薄的冠状脑片，在组织用含有30％蔗糖的多聚甲醛干燥后进行染色。染色前，脑片用PBS清洗5分钟，双蒸水清洗5分钟，然后用分级乙醇(75％、95％、100％)脱水2分钟。将切片浸泡在LFB染色液(G3245，Solarbio)中，并在室温下保存一整晚。第二天用95％的乙醇处理多余的浮色，然后用双蒸水清洗以消除浮色。将大脑切片在LFB分化液中浸泡15秒，70％乙醇浸泡30秒。显微镜下观察染色洗脱后，灰质和白质被清楚地区分。将切片用焦油紫染色液重新染色30至40秒，然后用双蒸馏水冲洗。切片经过95％到100％的乙醇梯度脱水。然后用二甲苯使这些部分透明，并用中性树脂密封。使用徕卡显微镜(Leica Dm2500,Leica Co.,Heidelberg,Germany)，拍摄明视野照片并分析胼胝体区域为代表的白质病变程度。其中，白质病变根据其严重程度(严重程度指数)被评为正常(0级)、神经纤维混乱(1级)、明显空泡发展(2级)和有髓纤维损失(3级)。

2.5免疫荧光

用于免疫荧光染色的冷冻组织切片与上述LFB染色的切片相同。简单地说，组织切片和细胞用PBS洗三次，每次5分钟，然后用含有10％山羊血清的PBS溶液阻断2小时。然后用下面列出的小鼠抗CNPase(1:200，66729-1-Ig，Proteintech)、兔抗NG2(1:200，DF12589，Affinity)和兔抗MBP(1:200，AF4085，Affinity)的一级抗体在4℃处理过夜。第二天，用PBS清洗切片和细胞，用Alexa Fluor结合的488或594兔或小鼠二抗(1:200，Affinity)在室温下孵育一小时。用PBS除去二抗后，用抗荧光衰减阻断剂来封片。然后用荧光显微镜对切片进行拍照；所有图像都用ImageJ软件进行分析。

2.6免疫印迹

在冰上，用500微升RIPA蛋白裂解液和5微升PMSF蛋白酶抑制剂将大脑的分离部分均质化。将悬浮液放置在冰上并裂解30分钟。收集脑蛋白的样品进行检测。用电泳(SDS-PAGE)在10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上。用含有5％脱脂奶粉的TBST溶液对膜进行封锁一小时。洗掉阻断液，用一抗包括小鼠抗CNPase(1:1000，66729-1-Ig，Proteintech)、兔抗NG2(1:1000，DF12589，Affinity)和兔抗MBP(1:500，AF4085，Affinity)在4℃的摇床上过夜。第二天，将辣根过氧化物酶结合的抗小鼠(1:2000，CST)或抗兔抗体(1:2000，CST)孵育一小时。使用增强型化学发光检测系统(Beyotime Biotech)来检测条带。使用ImageJ来检查条带。

2.7SYTOX染色检测活细胞

高亲和力的SYTOX核酸染色剂(S11348，Thermo Scientific，Waltham，MA，US)不会通过活细胞的膜，但能够轻松渗透到质膜受损的细胞中。简而言之，5MSYTOX绿色荧光探针在环境温度下与所有细胞孵化5分钟。在荧光显微镜下，采集明视野和SYTOX-绿色荧光的图像。

3、观察指标

3.1一般状态观察

观察时间和频率：给药后每天固定时间观察1次；

观察结果：给药期受试动物整体状态，包括但不限于给药局部反应。

3.2观察小鼠脑白质损伤后，EAAT3抑制剂PDC对少突胶质细胞的作用：包括检测成熟少突胶质细胞标记物CNPase、MBP的蛋白表达水平及成熟少突胶质细胞存活水平。

3.3观察小鼠脑白质损伤后，EAAT3抑制剂PDC对脱髓鞘的作用。

3.4观察小鼠脑白质损伤后，EAAT3抑制剂PDC对少突胶质细胞前体细胞的作用：包括检测少突胶质细胞前体细胞标记物NG2的蛋白表达水平及少突胶质细胞前体细胞的存活水平；同时检测少突胶质细胞前体细胞主要来源区域-侧脑室下区-的少突胶质细胞前体细胞的增殖水平。

3.5观察原代少突胶质细胞前体细胞培养后，在构建细胞OGD体外模型后，检测EAAT3抑制剂PDC对少突胶质细胞前体细胞的作用包括检测少突胶质细胞前体细胞的数量、活细胞的数量与增殖水平。

4、统计分析

试验数据以Mean±SEM表示，两组之间采用student t检验，三组之间采用one-wayANOVA检验(M-W法)对组间差异进行比较。统计学分析结果P<0.05认为有显著性差异。

5、试验结果

5.1EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后成熟少突胶质细胞的标记物CNPase蛋白表达水平

如图1所示，采用BCAS手术构建白质损伤模型，并检测损伤第14天后白质部分成熟少突胶质细胞标记物的表达水平，结果显示14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组成熟少突胶质细胞标记物CNPase的蛋白表达水平显著下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后CNPase的蛋白表达水平显著升高。

5.2EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后成熟少突胶质细胞(CNPase阳性细胞)的存活

如图2所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质的代表性区域-胼胝体区的成熟少突胶质细胞的数量(CNPase阳性细胞)显著减少，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后成熟少突胶质细胞(CNPase阳性细胞)的数量显著增多。

5.3EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后成熟少突胶质细胞的标记物MBP蛋白表达水平

如图3所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质部位的成熟少突胶质细胞标记物MBP的蛋白表达水平显著下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后MBP的蛋白表达水平显著升高。

5.4EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后成熟少突胶质细胞(MBP阳性细胞)的存活

如图4所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质的代表性区域-胼胝体区的成熟少突胶质细胞的数量(MBP阳性细胞)显著减少，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后成熟少突胶质细胞(MBP阳性细胞)的数量显著增多。

5.5EAAT3抑制剂PDC治疗显著改善白质损伤后髓鞘的损伤

如图5所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质的代表性区域-胼胝体区的LFB髓鞘染色统计的白质损伤评分显著升高，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后白质损伤评分显著下降。

5.6EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后少突胶质细胞前体细胞标记物NG2蛋白表达水平

如图6所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质部位的少突胶质细胞前体细胞标记物NG2的蛋白表达水平显著下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后NG2的蛋白表达水平显著升高。

5.7EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后少突胶质细胞前体细胞(NG2阳性细胞)的存活

如图7所示，14天后白质部位BCAS诱导的白质损伤模型组白质的代表性区域-胼胝体区的少突胶质细胞前体细胞(NG2阳性细胞)的数量显著减少，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后少突胶质细胞前体细胞(NG2阳性细胞)的数量显著增多。

5.8EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高白质损伤后少突胶质细胞前体细胞主要来源地区(侧脑室下区SVZ区)的少突胶质细胞前体细胞增殖

如图8所示，14天后BCAS诱导的白质损伤模型组中，少突胶质细胞前体细胞主要来源地区-SVZ区的少突胶质细胞前体细胞增殖(NG2/EdU双阳性细胞)显著增加，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后SVZ区的少突胶质细胞前体细胞增殖进一步增加。NG2是少突前体细胞标记物，EdU是细胞增殖标记物。

5.9EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高体外模型中原代少突胶质细胞前体细胞的数量

如图9所示，通过OGD模型构建了体外的细胞损伤模型，通过NG2染色(少突胶质细胞前体细胞标记物)结果显示显示OGD模型组中，原代少突胶质细胞前体细胞的数量下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后原代少突胶质细胞前体细胞的数量显著升高。

5.10EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高体外模型中原代少突胶质细胞前体细胞的存活

如图10所示，通过OGD模型构建了体外的细胞损伤模型，通过SYTOX染色检测活细胞数量，结果显示OGD模型组中，原代少突胶质细胞前体细胞的活细胞数量显著下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后原代少突胶质细胞前体细胞的活细胞数量显著升高。

5.11EAAT3抑制剂PDC治疗显著提高体外模型中原代少突胶质细胞前体细胞的增殖

如图11所示，OGD模型组中，原代少突胶质细胞前体细胞的增殖的细胞数量显著下降，而给予EAAT3抑制剂PDC治疗后原代少突胶质细胞前体细胞的增殖的细胞数量显著升高，其中EdU是细胞增殖标记物。

从图1-5的结果中可以看出，EAAT3抑制剂PDC可通过促进成熟少突胶质细胞的存活，改善髓鞘损伤进而促进白质损伤修复。

从图6-8中可以看出，EAAT3抑制剂PDC可通过促进少突胶质细胞前体细胞的存活与增殖，进而促进成熟少突胶质细胞的存活，改善髓鞘损伤进而促进白质损伤修复。

从图9-11中可以看出，在体外模型中也证明了EAAT3抑制剂PDC可促进少突胶质细胞前体细胞的存活与增殖。

最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。