一类氰基化合物、其制备方法及用途

本申请是申请号为2022800054540(国际申请号为：PCT/CN2022/122384)，申请日为2022年9月29日，发明名称为“一类氰基化合物、其制备方法及用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于药物化学和化学合成领域，具体而言，本发明涉及一类氰基化合物、其制备方法及用途。

背景技术

冠状病毒为单链正义RNA病毒，部分冠状病毒能够在人群中大范围传播并可以引起严重症状。目前已知的可以感染人的冠状病毒有7种，分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。冠状病毒大多数功能蛋白由ORF1ab基因编码，先翻译成一个多聚蛋白，再由3CL蛋白酶和PL蛋白酶切割成多个活性蛋白，因此抑制3CL蛋白酶活性能够有效抑制病毒的复制。不同冠状病毒3CL蛋白酶具有高度的结构同源性，因此3CL蛋白酶抑制剂具有广谱抗冠状病毒活性。

除冠状病毒以外，3CL蛋白酶在小RNA病毒编码的多聚蛋白水解中也扮演重要角色，3CL蛋白酶抑制剂能够有效抑制小RNA病毒复制。肠病毒71是一种小RNA病毒，它引起手足口病的常见病毒之一，还可能引起脑膜炎、脑干脑炎、心肌炎等多种疾病。近年来，肠病毒71多次在婴幼儿人群中爆发，临床上仍缺乏高效的治疗药物。

因此，仍需要可以抑制包括冠状病毒/肠病毒71等RNA/小RNA病毒的化合物。

发明内容

发明人基于3CL蛋白酶的晶体结构，合理设计了一类氰基化合物，所述化合物可以有效抑制冠状病毒和/或小RNA病毒的3CL蛋白酶活性、在体外能够有效抑制包括肠病毒71在内的多种小RNA病毒的3CL蛋白酶活性，在细胞水平有效抑制小RNA病毒的复制，可以用于制备冠状病毒和/或小RNA病毒诱发疾病的药物。发明人在此基础上完成了本公开。

本发明的首要目的在于提供如通式I所示的氰基化合物、其外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其药学上可接受的盐。

本发明的第二目的在于提供该类化合物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供包含该类化合物的药物组合物。

本发明的第四目的在于该类化合物在制备3CL蛋白酶抑制剂方面的用途。

本发明的第五目的在于该类化合物在制备预防或治疗冠状病毒和/或小RNA病毒诱发疾病的药物方面的用途。

为了完成上述目的，本发明采用的技术方案为：

一方面，本发明提供一种如通式I所示的氰基化合物、其外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明提供通式I的化合物的制备方法。

本发明的技术方案至少具有以下技术效果：

本发明的化合物具有3CL蛋白酶抑制活性，能抑制冠状病毒和小RNA病毒的基因表达的蛋白复合体水解，进而抑制病毒复制和发展，可用于冠状病毒或小RNA病毒感染引起疾病的预防与治疗。

本发明涉及通式I所示的氰基化合物、其外消旋体、对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐：

其中，

R

R

X选自O、S、S(＝O)

Y不存在或选自O、S、S(＝O)

R

R

或者，R

R

R

R

R

R

R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

R

或者，R

在一些实施方式中，X选自O、S、S(＝O)

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，X、Y各自独立地选自O、S和S＝O，R

在一些实施方式中，X、Y各自独立地选自O和S，R

在一些实施方式中，X、Y均选自S，或者X、Y均选自O，R

在一些实施方式中，X选自S，Y不存在，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，通式I所示的氰基化合物选自通式IA所示的氰基化合物：

其中，R

在一些实施方式中，通式I所示的氰基化合物选自通式IB所示的氰基化合物：

其中，各取代基定义如上所述。

在一些实施方式中，通式I所示的氰基化合物选自如下通式所示的氰基化合物中的任一种：

其中，R

在一些实施方式中，本发明通式I所示的化合物选自以下化合物：

本发明提供了制备通式I所示化合物的方法，所述方法为以下方法之一：

方法i：

ia)由式II所示化合物与式III所示化合物通过缩合反应得到式IV所示化合物；

优选地，所述步骤ia)为：式II所示化合物在-20℃～50℃温度下，在溶剂中，通过缩合剂和碱的作用与式III所示化合物反应0.1-12h，从而得到式IV所示化合物；

其中，所述溶剂为以下的一种或几种混合，四氢呋喃、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙酸乙酯和1，4-二氧六环；

任选地，所述缩合剂为以下的一种或几种混合：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-羟基吡啶-N-氧化物、1-丙基磷酸酐、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、N,N'-羰基二咪唑和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；

任选地，所述碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和N-甲基吗啉；

ib)式IV所示化合物通过脱水得到通式I所示化合物；

优选地，所述步骤ib)为：式IV所示化合物在-20℃～50℃温度下，在无水溶剂中，与脱水剂反应1-24h得到通式I所示化合物；

其中，所述无水溶剂为以下的一种或几种混合，四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、1，4-二氧六环和吡啶；

所述脱水剂为三氟醋酸酐和N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯；或者

方法ii：

iia)由式V所示化合物与式III所示化合物缩合得到式VI所示化合物，其中式V所示化合物中的PG为氨基的保护基团；

优选地，所述步骤iia)为：式V所示化合物在-20℃～50℃温度下，在溶剂中，通过缩合剂和碱的作用与式III所示化合物反应0.1-12h，从而得到式VI所示化合物，

其中，所述溶剂为以下的一种或几种混合，四氢呋喃、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙酸乙酯和1，4-二氧六环，

所述缩合剂为以下的一种或几种混合，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-羟基吡啶-N-氧化物、1-丙基磷酸酐、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、N,N'-羰基二咪唑和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；

所述碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和N-甲基吗啉；

所述氨基的保护基团PG为叔丁氧羰基、苄基和对甲氧基苄基；

iib)式VI所示化合物脱保护得到式VII所示化合物；

优选地，所述步骤iib)为：在-20℃～50℃温度下，将式VI所示化合物与三氟醋酸或氯化氢的有机溶液或Pd/C/H

iic)式VII所示化合物通过氨基酰化、磺酰化或缩合反应得到式IV所示化合物；

优选地，所述步骤iic)为：

在-20℃～50℃温度下，将式VII所示化合物与酰氯或酸酐在加入碱的条件下进行氨基酰化反应得到式IV所示化合物；或者，

在-20℃～50℃温度下，将式VII所示化合物与磺酰氯或磺酸酐在碱的条件下进行磺酰化反应得到式IV所示化合物；或者，

在-20℃～50℃温度下，将式VII所示化合物与羧基化合物在缩合剂与碱的条件下进行缩合反应得到式IV所示化合物；

任选地，所述碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和N-甲基吗啉；

任选地，所述缩合剂为以下的一种或几种混合，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-羟基吡啶-N-氧化物、1-丙基磷酸酐、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、N,N'-羰基二咪唑和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，

iid)式IV所示化合物通过脱水得到通式I所示化合物；

优选地，所述步骤iid)为：式IV所示化合物在-20℃～50℃温度下，在无水溶剂中，与脱水剂反应1-24h得到通式I所示化合物；

其中，所述无水溶剂为以下的一种或几种混合，四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、1，4-二氧六环和吡啶；

任选地，所述脱水剂为三氟醋酸酐和N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯，

其中，各取代基定义如上所述。

本发明另一方面还提供一种药物组合物，其包含选自通式I的氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种。所述药物组合物还可以包括一种或者多种药学上可接受的辅料、稀释剂、载体、赋形剂或佐剂。

本发明另一方面还提供一种药物组合物，其包含选自通式I的氰基化合物，或其外消旋体、对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料；任选地，所述药物组合物还进一步包含利托那韦或其药学上可接受的盐。

本发明另一方面还提供一种药物组合，其包含选自通式I的氰基化合物，其外消旋体、对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐，以及利托那韦或其药学上可接受的盐。

本发明另一方面还提供一种药物组合物，其包含选自通式I的氰基化合物或其药学上可接受的盐，利托那韦或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

经实验证明，本发明化合物具有冠状病毒3CL蛋白酶和小RNA病毒的3CL蛋白酶抑制活性。

因此，本发明再一方面提供一种冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂和/或一种小RNA病毒的3CL蛋白酶抑制剂，其包含选自通式I的氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种，或上述药物组合物。

本发明还提供上述氰基化合物，其外消旋体、对映异构体、非对映异构体、其药学上可接受的盐，或它们的混合物，或上述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物选自用于抑制冠状病毒3CL蛋白酶活性的药物，用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，用于抑制小RNA病毒的3CL蛋白酶活性的药物，和用于预防和/或治疗小RNA病毒感染的药物。

本发明还提供一种抑制3CL蛋白酶的方法，所述方法包括向需要处理的对象施用根据选自本发明的通式I的氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种，或者根据本发明的药物组合物。

本发明还提供一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向需要治疗的对象施用根据选自本发明的通式I的氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种，或者根据本发明的药物组合物，所述疾病或病症为3CL蛋白酶介导的疾病或病症，特别是与冠状病毒感染和/或小RNA病毒感染相关的疾病或病症。

本发明还提供上述通式I所示氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种，或其药物组合物在制备预防或治疗由冠状病毒和/或小RNA病毒感染引起的相关疾病的药物中的用途。

本发明还提供预防或治疗由冠状病毒和/或小RNA病毒感染引起的相关疾病的方法，该方法包括给以患者治疗上有效剂量的包含本发明通式I所示氰基化合物，其外消旋体、对映异构体和非对映异构体，和它们的药学上可接受的盐中的一种或多种的药物制剂。

在一些实施方式中，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、H229E-CoV、HKU1-CoV、NL63-CoV、OC43-CoV或SARS-CoV-2。

在一些实施方式中，所述冠状病毒感染引起的相关疾病选自呼吸道感染、肺炎或其并发症。

术语定义和说明

“C

“亚烷基”可理解为表示具有直链或支链饱和二价烃基。“C

“C

“C

“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子或6-12个碳原子。“C

“杂芳基”是具有芳香性的环基，其含有5-20个环原子，其中有一个或多个环原子为选自N、O或S的杂原子，其余环原子为碳。“5～20元杂芳基”可理解为具有5～20个环原子，特别是5或6或9或10或13或14个环原子，且其包含1-7个独立选自N、O和S的杂原子的杂芳基。“5～10元杂芳基”可理解为具有5～10个环原子，特别是5或6或9或10个环原子，且其包含1-5个独立选自N、O和S的杂原子的杂芳基。“5～6元杂芳基”可理解为具有5或6个环原子且其包含1-3个独立选自N、O和S的杂原子的杂芳基。本发明所述杂芳基可选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基或噻二唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基或异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基等以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基或异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基或吩噁嗪基等。

“卤素”选自氟、氯、溴、碘。

“卤代”包括单卤代、多卤代或全卤代，即一个、多个或全部氢原子被卤素取代。

“取代”是指基团上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基取代。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

“治疗有效量”意指(i)治疗特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本发明化合物的用量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。

“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的酸或碱的盐，包括化合物与无机酸或有机酸形成的盐，以及化合物与无机碱或有机碱形成的盐。

术语“药物组合”是指包含两种或两种以上的活性成分或其药学上可接受的盐的组合。在本发明的一些实施方式中，所述药物组合中的活性成分或其药学上可接受的盐可以同时施用，在本发明的一些实施方式中，所述药物组合中的活性成分或其药学上可接受的盐也可以分别或序贯施用。

“药物组合物”是指一种或多种本发明的化合物或其盐与药学上可接受的辅料组成的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本发明的化合物。

“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。

附图说明

图1为化合物2对SARS-CoV-2的WIV04株体外活性的抑制率-浓度的图。

图2为化合物2对SARS-CoV-2的B.1.351株体外活性的抑制率-浓度的图。

图3为实施例26中分别感染2天后(图A)及4天后(图B)化合物2对小鼠肺部病毒滴度的抑制效果图。

图4为实施例26中的小鼠体重变化图。

图5为实施例26中感染4天后化合物2对小鼠脑部病毒滴度的抑制效果图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本公开。在以下的实施例中，原料可商业购买，或者能够通过文献中记载的方法/本领域已知的有机合成方法制备。

实施例1

化合物1-1制备：

步骤1：将起始原料SMA(2.74g，11.85mmol)、35ml二氯甲烷和35ml DMF加入反应瓶中，降温至0℃，依次加入起始原料SMB(3.56g，11.86mmol)、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP，6.29g，14.22mmol)和N-甲基吗啉(NMM，3.91ml，35.56mmol)，升温至室温反应10h，反应结束后，加入适量二氯甲烷，有机相依次用1N盐酸水溶液、饱和食盐水洗涤，洗涤结束后有机相用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩至干，柱层析得3.71g INT-1；ESI-MS:433.2m/z[M+H]

步骤2：将INT-1(3.71g，8.58mmol)、37ml的THF和37ml的纯化水和一水合氢氧化锂(0.72g，17.16mmol)加入反应瓶中，室温反应2h，反应结束后，用浓盐酸调至pH＝4，过滤，得3.4g化合物1-1；ESI-MS:419.2m/z[M+H]

化合物1-2制备：

将氨气-甲醇溶液(700ml,7mol/L)、起始原料SMD(100g，0.349mol)加入反应瓶中，搅拌溶清，保温25±5℃，反应36h，反应结束后，将反应液浓缩至剩余反应液约为250ml，加入异丙醇300ml继续减压浓缩至剩余反应液约250ml(重复三次)，氮气置换，降温至10±5℃，将500ml氯化氢-异丙醇溶液(4mol/L)加入反应釜中，加入结束后，升温至25±5℃，保温25±5℃反应9h。反应结束后，将反应液减压浓缩至剩余反应液体积约250ml，加入300ml异丙醇继续减压浓缩至剩余反应液体积约250ml(重复两次)，加入100ml异丙醇，搅拌30±5min，过滤，滤饼用50ml异丙醇淋洗，得湿品；45±5℃真空干燥，得66.7g化合物1-2，收率：92％；

化合物1的制备：

化合物1-1(419mg,1mmol)置于双口瓶中，氮气保护下加入5mL二氯甲烷，随后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(400mg,1.1mmol)室温下搅拌1h。化合物1-2(1mmol)溶于1mL二氯甲烷中加入到以上体系中，随后在冰水浴下加入N,N-二异丙基乙胺(0.5mL，1mmol)，撤去冰水浴，体系置于室温搅拌过夜。后处理，加二氯甲烷50mL后用1M盐酸水溶液洗三次，碳酸氢钠饱和水溶液洗三次，饱和食盐水洗有机相，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到化合物1-3(白色固体，469mg,产率82％)。ESI-MS:m/z 572.3[M+H]

化合物1-3(114mg,0.2mmol)与伯吉斯试剂(1.5eq)加入到双口瓶中，充放氮气三次后加入分子筛干燥过的二氯甲烷，室温搅拌过夜，薄层层析检测显示原料基本反应完全。后处理，柱层析得到化合物1(白色固体，52mg,产率47％),ESI-MS:554.3m/z[M+H]

实施例2

化合物1-3(572mg,1mmol)溶于3mL4M氯化氢/1，4-二氧六环溶液中，或者溶于2mL二氯甲烷后逐滴加入2mL三氟醋酸，环境温度下搅拌，薄层层析检测显示原料基本反应完全后充分旋干溶剂。得到的粗品溶于2mL二氯甲烷，氮气保护，加入三乙胺(3mmol)后将体系置于冰水浴中，逐滴加入三氟醋酸酐(1.2mmol)，薄层层析检测显示原料基本反应完全后，加二氯甲烷50mL后用1M盐酸水溶液洗三次，碳酸氢钠饱和水溶液洗三次，饱和食盐水洗有机相，无水硫酸钠干燥，过柱得到化合物2-1(白色固体，265mg,产率46％)。ESI-MS:m/z 568.3[M+H]

化合物2-1(113mg,0.2mmol)与伯吉斯试剂(1.5eq)加入到双口瓶中，充放氮气三次后加入分子筛干燥过的二氯甲烷，室温搅拌过夜，薄层层析检测显示原料基本反应完全。后处理，柱层析得到化合物2(白色固体，41mg,产率47％),

实施例3

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以醋酸酐代替三氟醋酸酐，得到化合物3(白色固体，45mg,产率45％),ESI-MS:496.3m/z[M+H]

实施例4

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以环丙烷甲酸酐代替三氟醋酸酐，得到化合物4(白色固体，32mg,产率31％),ESI-MS:522.3m/z[M+H]

实施例5

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以5-1代替1-1，得到化合物5(白色固体，22mg,产率20％),

实施例6

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以6-1代替1-1，得到化合物6(白色固体，38mg,产率37％),ESI-MS:512.2m/z[M+H]

实施例7

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以7-1代替1-1，得到化合物7(白色固体，49mg,产率44％),ESI-MS:553.3m/z[M+H]

实施例8

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以苯甲酸酐代替三氟醋酸酐，得到化合物8(白色固体，44mg,产率39％),ESI-MS:558.3m/z[M+H]

实施例9

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以3,5-双(三氟甲基)苯甲酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物9(白色固体，39mg,产率28％),ESI-MS:694.2m/z[M+H]

实施例10

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以3,5-二甲基苯甲酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物10(白色固体，31mg,产率26％),ESI-MS:586.2m/z[M+H]

实施例11

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以3,3,3-三氟丙酸酐代替三氟醋酸酐，得到化合物11(白色固体，28mg,产率25％),ESI-MS:564.2m/z[M+H]

实施例12

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以3-吡啶甲酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物12(白色固体，39mg,产率35％),ESI-MS:559.2m/z[M+H]

实施例13

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以五氟丙酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物13(白色固体，41mg,产率34％),ESI-MS:600.2m/z[M+H]

实施例14

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以14-1代替1-1，得到化合物14(白色固体，32mg,产率29％),ESI-MS:550.2m/z[M+H]

实施例15

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以甲基磺酸酐代替三氟醋酸酐，得到化合物15(白色固体，38mg,产率36％),

实施例16

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以环丙磺酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物16(白色固体，29mg,产率26％),

实施例17

按照实施例2中相同的方法，不同之处在于：以苯磺酰氯代替三氟醋酸酐，得到化合物17(白色固体，35mg,产率29％),ESI-MS:594.2m/z[M+H]

实施例18

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以18-1代替1-1，得到化合物18(白色固体，44mg,产率42％),ESI-MS:518.2m/z[M+H]

实施例19

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以19-1代替1-1，得到化合物19(白色固体，41mg,产率36％),ESI-MS:568.2m/z[M+H]

实施例20

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以20-1代替1-1，得到化合物20(白色固体，45mg,产率35％),ESI-MS:648.2m/z[M+H]

实施例21

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以21-1代替1-1，得到化合物21(白色固体，34mg,产率31％),ESI-MS:640.2m/z[M+H]

实施例22

按照实施例1中相同的方法，不同之处在于：以22-1代替1-1，22--1代替1-2，得到化合物22(白色固体，22mg,产率18％),ESI-MS:614.2m/z[M+H]

实施例23

化合物23-1(497mg,1mmol)置于双口瓶中，氮气保护下加入5mL二氯甲烷，随后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(400mg,1.1mmol)室温下搅拌1h。化合物1-2(或其相应的盐，1mmol)溶于1mL二氯甲烷中加入到以上体系中，随后在冰水浴下加入N，N-二异丙基乙胺(0.5mL，1mmol)，撤去冰水浴，体系置于室温搅拌过夜。后处理，加二氯甲烷50mL后用1M盐酸水溶液洗三次，碳酸氢钠饱和水溶液洗三次，饱和食盐水洗有机相，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到化合物23-2(白色固体，421mg,产率65％)。ESI-MS:m/z 650.3[M+H]

化合物23-2(325mg,0.5mmol)溶于1.5mL 4M氯化氢/1，4-二氧六环溶液中，或者溶于1mL二氯甲烷后逐滴加入1mL三氟醋酸，环境温度下搅拌，薄层层析检测显示原料基本反应完全后充分旋干溶剂。得到的粗品溶于2mL二氯甲烷，氮气保护，加入三乙胺(1.5mmol)后将体系置于冰水浴中，逐滴加入三氟醋酸酐(0.6mmol)，薄层层析检测显示原料基本反应完全后，加二氯甲烷25mL后用1M盐酸水溶液洗三次，碳酸氢钠饱和水溶液洗三次，饱和食盐水洗有机相，无水硫酸钠干燥，过柱得到化合物23-3(白色固体，167mg,产率52％)。ESI-MS:m/z 646.3[M+H]

化合物23-3(130mg,0.2mmol)与伯吉斯试剂(1.5eq)加入到双口瓶中，充放氮气三次后加入分子筛干燥过的二氯甲烷，室温搅拌过夜，薄层层析检测显示原料基本反应完全。后处理，柱层析得到化合物23(白色固体，37mg,产率29％),ESI-MS:628.2m/z[M+H]

实施例24：化合物抑制SARS-CoV-2 3CLpro活性测试

利用荧光共振能量转移方法评价测定化合物对SARS-CoV-2 3CL

实验结果如表1所示。结果表明，本发明化合物对SARS-CoV-2 3CL

表1：化合物1-23对SARS-CoV-2 3CL

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实施例24-2：化合物2对于SARS-CoV-2奥密克戎株突变型3CL蛋白酶抑制活性测试

实验原理：应用酶与底物反应产生荧光共振能量转移(FRET)的方法，研究了本发明化合物对奥密克戎株突变型3CL蛋白酶(P132H)活性的抑制效果。

实验材料如下表所示：

实验仪器及设备：

实验步骤：

配制反应缓冲液，含有20mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.01％BSA、1mM DTT和100mMNaCl。用Echo移液系统将待测化合物在二甲基亚砜(DMSO)中稀释到不同浓度，转移至384孔板中。用反应缓冲液稀释突变型3CL蛋白酶，并且以10μL/孔的量加入384孔板中，1000rpm离心1min，随后室温孵育30分钟。然后加入10μL/孔的底物，1000rpm离心30s启动酶反应。反应体系中，酶的终浓度为50nM，底物终浓度为20μM，化合物的浓度范围为10000nM至0.51nM。随即在Flexstation 3酶标仪上选取Kinetic Reduction Vmax模式，每隔75秒连续读取490nm波长的荧光值，共35次，获得反应速率值(V)，计算抑制率，并使用XLfit软件进行四参数拟合获取半数抑制浓度(IC

抑制率＝(V

其中，V

实验结果：对于SARS-CoV-2奥密克戎株中具有P132H突变的3CL蛋白酶，化合物2依旧保持了显著的抑制活性(三次独立测试IC

表2：化合物2对SARS-CoV-2奥密克戎株3CL蛋白酶活性的抑制效果

*指三次独立重复实验。

实施例24-3：化合物2对于不同来源的冠状病毒3CL蛋白酶抑制活性测试

实验目的：研究化合物2对于来源于其它六种能够感染人类的冠状病毒的3CL蛋白酶活性的抑制效果，这六种病毒分别是：SARS-CoV、MERS-CoV、OC43-CoV、H229E-CoV、NL63-CoV和HKU1-CoV。

实验材料：

3CL蛋白酶：根据冠状病毒基因组序列自制重组全长冠状病毒3CL蛋白酶，所用SARS-CoV、MERS-CoV、H229E-CoV、HKU1-CoV、NL63-CoV和OC43-CoV基因组GenBank号分别为AAP13442.1、MT387202.1、AF304460.1、AY597011.2、AY567487.2和AY903459.1，六种冠状病毒3CL蛋白酶蛋白表达所需DNA序列购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3CL蛋白酶底物购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

糜蛋白酶底物购自吉尔生化有限公司。

其他试剂如下表所示：

实验步骤：

配制反应缓冲液(含有50mM Tris和1mM EDTA)。待测化合物用DMSO溶解成100mM母液，进一步用反应缓冲液进行2倍梯度稀释，共11个浓度。在96孔板中加入3CL蛋白酶和不同浓度的化合物，室温孵育10分钟，加入底物并迅速放入酶标仪中读数。整个酶促反应体系的体积为120μL，SARS-CoV、MERS-CoV、H229E-CoV、HKU1-CoV、NL63-CoV和OC43-CoV蛋白酶的终浓度分别为30nM、80nM、30nM、20nM、30nM和10nM，底物终浓度为10μM。读数时激发光和发射光波长分别为340nm和490nm。测试时间为10分钟，每隔1分钟读一次荧光值，最终结果取前5分钟的读值拟合得到反应速率，计算抑制率，计算公式为：抑制率＝1-(测试组反应速率/对照组反应速率)。

实验结果：结果如表3所示，对来源于其他六种冠状病毒的3CL蛋白酶，化合物2展现出较好的抑制效果，提示化合物2可能具有广谱的抗冠状病毒活性。

表3：化合物2对来源于其他冠状病毒3CL蛋白酶的抑制作用

实施例25-1:化合物2对SARS-CoV-2WIV04、B.1.351株细胞水平抑制作用

试验使用Vero E6细胞，在48孔板中加入Vero E6细胞(50000个细胞/孔)，加入100μL/孔含梯度浓度化合物的培养基，一小时后加入SARS-CoV-2，感染复数(MOI)为0.01。共孵育1小时后，吸走上清，清洗并重新加入200μL/孔含梯度浓度化合物的培养基，37℃培养24小时。24小时后，收集细胞上清，提取上清病毒RNA并利用实时荧光定量PCR的方法检测上清病毒拷贝数，根据病毒拷贝数算出化合物抑制率，利用prism 6.0计算化合物的EC

试验结果显示，化合物2抑制SARS-CoV-2WIV04株的半数有效浓度EC

实施例25-2:化合物2对SARS-CoV-2Vero E6原始株(WIV04)、德尔塔株(B.1.617.2)、奥密克戎株(B.1.1.529)细胞水平抑制作用

实验目的：本试验在Vero E6细胞中通过实时荧光定量PCR法检测培养上清中病毒拷贝数的方法研究了化合物2对SARS-CoV-2原始株(WIV04株)、德尔塔株(B.1.617.2)和奥密克戎株(B.1.1.529)在细胞中复制的抑制作用。由于Vero E6细胞高表达外排转运蛋白P-gp，所以添加0.5μM P-gp抑制剂CP-100356与化合物共孵育。

实验材料：

Vero E6购自ATCC(货号CRL-1586)，SARS-CoV-2原始株(SARS-CoV-2-WIV04株)、Delta株(B.1.617.2)、Omicron株((B.1.1.529)病毒来源于中国科学院武汉病毒研究所微生物菌(毒)种保藏中心。

其他试剂如下表所示：

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实验仪器：

生物安全柜(AC2-3S1，ESCO，新加坡)

二氧化碳培养箱(Thermo Scientific HERAcell 150i，Thermo Scientific，美国)

纯水仪(渗源SYS超纯水机，成都)

StepOne Plus Real-time PCR system(4376600，ABI，美国)

TC20

T100

离心机(Micro21/21R赛默飞，Thermo Scientific，美国)

实验步骤：

使用胰酶消化Vero E6细胞并置于培养基(90％DMEM，10％胎牛血清)中，种入48孔板，每孔50000个细胞，培养过夜。将待测化合物溶解于DMSO配制成40mM母液，进一步用含0.5μM Pgp抑制剂的培养基进行梯度稀释，获得试验所需浓度，实验中待测化合物的最终浓度范围为1μM至0.004μM。移除细胞上清，每孔加入稀释好的化合物(含Pgp抑制剂0.5μM)，孵育1小时，在生物安全3级(BSL-3)实验室里加入SARS-CoV-2不同株系，感染复数(MOI)为0.01或0.001，孵育1小时后，移除上清，PBS洗，加入稀释好的化合物(含Pgp抑制剂0.5μM)200μL/孔，感染后24或者72小时收集上清。提取上清病毒RNA并利用实时荧光定量PCR的方法检测上清病毒拷贝数，根据病毒拷贝数算出化合物抑制率，利用GraphPad Prism 8计算化合物的IC

细胞毒性试验中，将Vero E6细胞消化并置于培养基(90％DMEM，10％胎牛血清)中，种入96孔板，每孔20000个细胞，培养过夜。将待测化合物溶解于DMSO配制成40mM母液，进一步用培养基或含0.5μM Pgp抑制剂的培养基进行梯度稀释，获得试验所需浓度，实验中待测化合物的最终浓度范围为500μM至1.95μM。移除96孔板中的细胞上清，加入100μL/孔待测化合物(单药或含Pgp抑制剂0.5μM)的培养基，孵育24小时后，用CCK8检测试剂盒检测细胞活力，计算抑制率和半数细胞毒性浓度(CC

试验结果：如表4所示，与P-gp抑制剂CP-100356联合后，化合物2可剂量依赖的抑制德尔塔株在Vero E6细胞中的复制，IC

表4：化合物2联合P-gp抑制剂在Vero E6细胞中对SARS-CoV-2复制的抑制作用

实施例26：化合物2在hACE2-K18转基因小鼠上对SARS-CoV-2德尔塔株的体内抗病毒作用

实验目的：本研究评价了化合物2在稳定表达人血管紧张素转换酶2(ACE2)的K18转基因小鼠(K18-hACE2)中对SARS-CoV-2德尔塔株的抗病毒活性。

实验材料：

7-8周龄的K18-hACE2转基因小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。SARS-CoV-2Delta株病毒来源于中国科学院武汉病毒研究所微生物菌(毒)种保藏中心。

利托那韦购自上海迪赛诺化学制药有限公司。

Vero E6细胞购自ATCC(货号CRL-1586)。

其他试剂如下表所示：

实验仪器：

生物安全柜(AC2-3S1，ESCO，新加坡)

二氧化碳培养箱(Thermo Scientific HERAcell 150i，Thermo Scientific，美国)

纯水仪(渗源SYS超纯水机，成都)

StepOne Plus Real-time PCR system(4376600，ABI，美国)

TC20

T100

离心机(Micro21/21R赛默飞，Thermo Scientific，美国)

组织研磨仪(JXFSTPRP-CL，上海净信，中国)

实验步骤：K18-hACE2转基因小鼠通过滴鼻方式感染SARS-CoV-2德尔塔株，该天为第0天。感染2小时后采用灌胃方式分别给予溶媒、50mg/kg或200mg/kg化合物2(联合50mg/kg的细胞色素P450抑制剂利托那韦)，BID给药2天(其中第0天给药1次，第1天给药2次，第2天给药1次)或4天(其中第0天给药一次，第1、2、3天分别给药2次)。记录小鼠体重变化，终点时收集肺组织和脑组织。其中，左肺甲醛固定，后经包埋、切片和H&E染色用于组织病理学检查。右肺和脑组织各分为两份，一份研磨后取匀浆液提取RNA并进行反转录，通过实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数。另一份研磨后取匀浆液通过蚀斑实验检测病毒滴度。蚀斑实验方法如下：Vero E6细胞种于24孔板中，每孔12000个细胞，培养过夜。将组织匀浆液原液在DMEM培养基中进行10倍梯度稀释备用。去除细胞上清，加入稀释好的组织匀浆液并孵育1小时，随后去除上清，加入含1％甲基纤维素纳和2％FBS的培养基，培养4天。随后去除培养基，使用多聚甲醛固定后，用1％(w/v)结晶紫染色，统计每个孔中的空斑数量。

试验结果：如表5所示，在感染2天后，与模型组(病毒平均拷贝数为9.19±0.30log10copies/g)相比，在联合利托那韦的情况下，化合物2 50mg/kg和200mg/kg均显著减少了肺部的病毒载量，平均拷贝数分别为7.66±0.27log10 copies/g和6.79±0.30log10copies/g，其中200mg/kg剂量下病毒拷贝数下降程度达到2.4log10 copies/g。在感染4天后，观察到化合物2对病毒拷贝数的持续抑制作用。在病毒滴度方面，如图3所示，观察到化合物2显著的抑制作用，在感染2天后，200mg/kg剂量下完全抑制了病毒复制，未测到滴度，50mg/kg下与模型组相比，病毒滴度下降幅度超过3log10 PFU/g，在感染4天后，化合物2展现了对病毒滴度的持续抑制效果。体重方面如图4所示，在感染4天后，模型组小鼠体重减轻了约10％，而化合物2给药组的体重未明显降低，表明持续给药下化合物2未出现明显毒性。我们进一步检测了小鼠脑内的病毒载量，在感染2天后，各组未出现明显感染。在感染4天后，与模型组相比，化合物2在50mg/kg和200mg/kg剂量下均能显著降低小鼠的脑部的病毒拷贝数，尤其在200mg/kg剂量下脑部的病毒拷贝数与未感染的正常组相当。我们进一步检测了感染4天后脑部的病毒滴度，结果如图5所示，与模型组相比，化合物2在两个剂量下均未测到病毒滴度，显示了化合物2强大的抑制作用。此外，肺部的组织病理学分析表明，与模型组相比，化合物2 200mg/kg剂量下显著改善了肺部损伤，包括降低肺泡萎缩或扩张的程度以及肺泡膜增厚的程度。

表5感染2天和4天后小鼠肺部和脑部的病毒载量(平均值±SD)

实施例27：化合物2对激酶的选择性

实验目的：在KinaseProfile实验平台上检测了化合物2对413种激酶的抑制活性，研究化合物2对激酶的选择性。

实验材料：

Full Human Panel[10uM ATP]KinaseProfiler为Eurofins公司提供的测试产品，货号：50-005KP10，此产品包含413个激酶。

实验步骤：

采用Eurofins标准KinaseProfiler分析方法，并遵循相关标准操作程序，对所选的每一种激酶进行化合物测试。蛋白质激酶采用放射法检测，而脂质激酶采用HTRF法检测。实验中ATP浓度为10μM。每个激酶的详细信息可在Eurofins网站上获得，网址如下：https://www.eurofinsdiscoveryservices.com/catalogmanagement/viewItem/Full-Human-Panel-10-uM-ATP-KinaseProfiler/50-005KP10。

实验结果：对于413种激酶，化合物2在10μM浓度下抑制率均小于30％，无明显抑制作用，提示化合物2具有优秀的选择性。

实施例28：化合物2对安全性靶点的选择性

实验目的：在Safetyscan实验平台上检测了化合物2对47个安全性相关靶点的影响。

实验材料：

Safety47 Panel Dose Response SAFETYscan为Eurofins公司提供的测试产品，货号：87-1003DR。此产品包含47个安全性靶点相关的78个测试。

实验步骤：

对47个安全型靶点相关的78个测试，采用的实验方法包括：cAMP实验、钙流实验、激素核受体实验、激酶结合实验、酶活性实验、神经递质转运体实验、离子通道实验以及转运体实验。每个实验的具体方法可在eurofins网站获得，网址如下：https://www.eurofinsdiscoveryservices.com/catalogmanagement/viewItem/Safety47-Panel-Dos e-Response-SAFETYscan-DiscoverX/87-1003DR。

实验结果：对于47个安全性相关靶点，化合物2在100μM浓度下均无明显抑制或激活作用(EC

实施例29：化合物2的人血浆蛋白结合试验

实验材料

人血浆购买自BioIVT公司，EDTA K2抗凝，-80℃储存。96孔平衡透析板购买自HTDialysis LLC公司。平衡透析膜购买自Gales Ferry公司。

实验步骤

用超纯水配制浓度为14.2g/L磷酸氢二钠和8.77g/L氯化钠的碱性溶液，该碱性溶液可以在4℃条件下保存7天。用超纯水配制浓度为12.0g/L磷酸二氢钠和8.77g/L氯化钠的酸性溶液，该酸性溶液可以在4℃条件下保存7天。用酸性溶液滴定碱性溶液至pH值为7.4，该缓冲液可以在4℃保存7天。实验当天测试缓冲液pH值，如果超出7.4±0.1范围，则调节其pH值。

将透析膜浸泡在超纯水中60分钟以便将膜分离成两片，然后用20％乙醇浸泡20分钟，最后用透析所用缓冲液浸泡20分钟。

将冷冻的血浆迅速在室温下解冻。

将血浆在4℃、3,220g离心力下离心10分钟去除凝块，并将上清收集到新的离心管中。测定和记录血浆的pH值。

配制10mM待测物的DMSO储备液。用98μL DMSO稀释2μL储备液(10mM)得到工作液(200μM)。取3μL工作液，加入597μL人血浆，终浓度为1μM(0.5％DMSO)。充分涡匀。

在透析膜的一侧加入120μL加药血浆样品，另一侧加入等体积的透析液(磷酸盐缓冲液)。实验为双平行。封上透析板，放入孵育装置，在37℃，5％CO

在磷酸盐缓冲液样品中加入50μL空白血浆，在血浆样品中加入等体积的空白磷酸盐缓冲液。加300μL室温淬灭剂(含内标乙腈(IS，500nM拉贝洛尔，100nM阿普唑仑和2μM酮洛芬))沉淀蛋白。涡旋5分钟。在4℃下，3220g离心30分钟。转移100μL上清液到新板子。根据待测物的液质响应信号和峰形，用100μL或200μL水对上清液进行稀释。混匀，利用液质进行样品分析。

通过Microsoft Excel进行所有的计算。确定待测物在缓冲液侧和血浆侧的峰面积。计算待测物和对照药的血浆蛋白结合率公式如下：游离率＝(样品峰面积与内标峰面积比值缓冲液侧/样品峰面积与内标峰面积比值血浆侧)*100％，结合率＝1-游离率，回收率＝(样品峰面积与内标峰面积比值缓冲液侧+样品峰面积与内标峰面积比值血浆侧)/(样品峰面积与内标峰面积比值初始血浆样品)*100％。样品峰面积与内标峰面积比值缓冲液侧代表化合物的游离浓度，样品峰面积与内标峰面积比值血浆侧代表化合物的游离浓度和结合浓度之和，样品峰面积与内标峰面积比值初始血浆样品代表样品开始孵育时化合物的总浓度。

试验结果：

见表6。1μM的化合物2在37℃条件下孵育6小时，平均游离率为46.63％，结合率为53.37％，回收率为88.02％。

表6化合物2的人血浆蛋白结合试验结果

实施例30：化合物2单次灌胃的组织分布试验

实验材料：

Balb/c小鼠(购自上海旻敞生物科技有限公司)共60只，雌雄各半，体重为18-25g。

实验步骤：

Balb/c小鼠单次灌胃给予化合物2，给药剂量为100mg/kg，给药体积为10mL/kg。

给药前和给药后5min、0.25、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0和10h(每个时间点6只小鼠、雌雄各半)；在以上设定时间点经眼球后静脉丛取血0.2ml，置EDTA-K2试管中，11000rpm离心5min，分离血浆，于-70℃冰箱中冷冻；在0.25、1.0、3.0和7.0h时间点全血采集后立即解剖采集肺组织，组织用冷生理盐水冲净表面残留血液及内容物，吸干后贴好标签，-70℃保存待测。LC/MS-MS法测定血浆和肺组织中化合物2的含量，计算肺血比。

试验结果：

Balb/c小鼠单次灌胃给予化合物2后，肺组织暴露量和血浆暴露量的比值为0.62，化合物2在肺组织暴露量高。

实施例31：化合物2灌胃给药对食蟹猴心血管系统影响的安全药理试验

在食蟹猴2周重复给药毒性研究中，伴随考察了化合物2对心血管系统的影响。

实验材料：

食蟹猴32只，雌雄各半，给药时年龄2.5-5岁。

动物来源：云南英茂生物科技有限公司；广西雄森灵长类实验动物养殖开发有限公司；中科灵瑞(湛江)生物技术有限公司。

使用智能无创血压计BP-98E测量所有清醒动物的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)，采用Provantis/v10.2.3.1电子数据采集系统(PV-02)。

实验步骤：32只食蟹猴(第1组和第4组5只动物/性别/组，第2组和第3组3只动物/性别/组，共4组)随机分组，通过鼻饲给药给予化合物2(40,160和600mg/kg/天)或对照制剂(98.9％溶媒制剂+1.1％MTBE，0mg/kg/天)，每天给药两次，共给药14天，给药结束后恢复14天。所有动物均被纳入本研究，以评估给药对ECG参数(包括心率、PR间期、QRS持续时间、QT间期和QTcF)及对给药前阶段、给药期和恢复期的血压的影响。

试验结果：在本试验条件下，食蟹猴鼻饲灌胃给予化合物2(40、160和600mg/kg/day)14天，每天2次，未见供试品相关的心血管系统改变；未见供试品相关的心律失常；整个试验过程中未见供试品相关的ECG参数或血压的改变。