一种归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统制备方法及其应用

一、技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，特别是一种归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统制备方法及其应用。

二、背景技术

乳腺癌已经超过肺癌，成为世界上最常见的恶性肿瘤。其中三阴性乳腺癌(TNBC)是最难治的乳腺癌亚型，复发风险高，预后差。随着肿瘤免疫治疗的成功，乳腺癌也进入了免疫治疗的时代。尽管这些亚型中PD-L1的突变频率和表达都很高，但大多数患者对免疫治疗仍无反应。

以往试图提高乳腺癌免疫治疗有效性的研究主要集中在重塑微环境的宿主因素上。除宿主因素外，肿瘤内共生微生物群已被证明是肿瘤微环境的重要组成部分，对肿瘤免疫治疗具有深远的影响。研究发现一些肿瘤内共生微生物群会破坏免疫监视，从而在诱导肿瘤免疫治疗耐药性。值得注意的是，在乳腺癌中也发现了丰富多样的肿瘤驻留微生物群。具核梭杆菌是一种常见的口腔革兰氏阴性厌氧菌，长期以来一直被认为与牙周病的发生有关。近来研究表明具核梭杆菌在乳腺癌中也广泛流行，并创造了一个免疫抑制的肿瘤微环境，造成免疫治疗的抵抗。因此，精准的消除乳腺癌中的具核梭杆菌可能是克服免疫治疗耐药的一种新的潜在策略。

抗生素仍然是目前临床上最有效的抗菌药物。抗生素甲硝唑对于具核梭杆菌等厌氧菌有强大的杀灭作用。然而，全身系统使用抗生素可能会对体内其他微生物群造成严重损害。研究表明，肠道微生物群在肿瘤免疫治疗中起着至关重要的作用，全身给药抗生素对接受免疫检查点阻断疗法的患者有负面影响。因此，在不破坏全身微生物群平衡的情况下，精确定点递送抗生素清除肿瘤内致病微生物是至关重要的。

目前，尚未见有通过归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统实现精准的消除乳腺肿瘤中的具核梭杆菌来提高肿瘤免疫治疗效果的报道。

三、发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统制备方法及其应用，可通过归巢肿瘤乏氧释药，达到药物在肿瘤部位的有效积累，在减少化疗药物毒副作用的同时，可在保持体内微生物群平衡下消除乳腺肿瘤驻留的具核梭杆菌来解除免疫抑制，提高肿瘤的免疫治疗效果。

本发明解决的技术方案是，提供一种归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统制备方法，包括以下步骤：

1)将铁蛋白(Ftn)溶液均匀分散于pH＝8的20mL Tris-HCl缓冲液中，60℃水浴加热1h，随后将阿霉素(DOX)溶液均匀加入反应体系中，Ftn与DOX质量比为2：1～6：1，继续搅拌3h，静置室温后，将反应溶液用100kDa的超滤管在2000rpm下离心10min，PBS洗涤3次，得到溶液A；

2)将2.5mg AZO与摩尔比3：1～1：1的NHS、EDC溶解于200μL DMSO溶液中，在黑暗中搅拌2h以活化AZO，然后将20-50mg MTZ与活化的AZO、步骤1)制备的溶液A混合，在黑暗条件下搅拌过夜，最后将混合物转移到100kDa的超滤管中，在2000rpm下离心10min，去除游离物质，随后冷冻干燥，得到粉末B；

3)取大鼠腹股动脉血液，以3000rpm离心获得红细胞，用0.25×PBS(1:40体积比)裂解红细胞4h，12000rpm离心，PBS洗涤3次，得到红细胞膜(RBCM)，备用；将培养的具核梭杆菌用PBS稀释至OD值0.5，在5000rpm下离心10min，用PBS洗涤3次，得到细菌沉淀，然后，每毫升0.5OD值的菌液沉淀加入100μL溶菌酶溶液(10mg/mL)，在37℃下孵育30min，最后，在7000rpm下离心10min，PBS洗涤去除细菌内容物，得具核梭杆菌膜(FM)；将得到的FM与RBCM按质量比1：3～3：1超声均匀混合，然后通过物理挤压法，得到杂化膜C(HM)；

4)将步骤3)得到的杂化膜C与步骤2)得到的粉末B按质量比1：6～1：2混合，超声波细胞破碎仪处理，并采用物理挤压法得到仿生递药系统D(MTZ/Ftn-DOX@HM)。

所述的步骤3)中，培养的具核梭杆菌为：将具核梭杆菌菌落转移到5mL的BHI液体培养基中，在37℃厌氧条件下培养过夜，获得处于指数生长期的细菌。

所述的BHI液体培养基为：脑心浸出粉17.5g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.6。

所述的步骤4)中，超声波细胞破碎仪处理条件为100W，超声2s，停止3s，共5min。

优选的，所述Ftn和DOX的比例，按质量比，计为5：1。

优选的，所述NHS和EDC，按摩尔比，计为1：1。

优选的，所述MTZ，按质量，计为30mg。

优选的，所述FM和RBCM，按质量比，计为1：1。

优选的，所述C和B，按质量比，计为1：2。

所述的归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统的水合粒径为100nm左右。

所述的归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统在增强归巢肿瘤免疫治疗药物中的应用。

所述的药物包括化疗药物、克服肿瘤基质屏障药物和免疫激活药物等。

所述的归巢肿瘤治疗类型包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和肝癌等高表达Gal-GalNAc的多种肿瘤类型。

本发明通过归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统实现精准的消除乳腺肿瘤中的具核梭杆菌来提高肿瘤免疫治疗效果，是归巢肿瘤药物仿生递药系统上的创新。

四、附图说明

图1为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统粒径和电位分布图。

图2为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的透射电镜图。

图3为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的乏氧响应性能透射电镜图。

图4为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的药物释药图。

图5为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的稳定性能图。

图6为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的免疫逃逸性能图。

图7为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的诱导肿瘤细胞凋亡效果图。

图8为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的肿瘤归巢性能图。

图9为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的体内抗肿瘤效果图。

图10为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的体内抗菌效果图。

图11为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的体内逆转免疫抑制图。

图12为本发明实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的维持菌群平衡性能图。

五、具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

本发明在具体实施时，包括以下步骤：

1)将400μL铁蛋白(Ftn)溶液(37.5mg/mL)均匀分散于pH＝8的20mL Tris-HCl缓冲液中，60℃水浴1h，随后将300μL的阿霉素(DOX)溶液(10mg/mL)均匀加入反应体系中，继续搅拌3h，静置室温后，反应溶液用100kDa的超滤管在2000rpm下离心10min，PBS洗涤3次，得到溶液A；

2)将2.5mg的AZO与摩尔比1：1的NHS、EDC溶解于200μL DMSO溶液中，在黑暗中搅拌2h以活化AZO，然后将30mg MTZ与溶液A和活化的AZO混合，在黑暗中搅拌过夜，最后将混合物转移到100kDa的超滤管中，在2000rpm下离心10min，去除游离物质，随后冷冻干燥，得到粉末B；

3)取大鼠腹腔动脉的血液，以3000rpm离心获得红细胞，用0.25×PBS(1:40体积比)裂解红细胞4h，12000rpm离心，PBS洗涤3次，获得红细胞膜(RBCM)，备用；将培养的具核梭杆菌用PBS稀释至OD值0.5，在5000rpm下离心10min，用PBS洗涤3次，得到细菌沉淀，然后，每毫升0.5OD值的菌液沉淀加入100μL溶菌酶溶液(10mg/mL)，在37℃下孵育30min，最后，在7000rpm下离心10min，PBS洗涤去除细菌内容物，得具核梭杆菌膜(FM)；将得到的FM与RBCM按质量比1：1超声均匀混合，然后通过物理挤压法，得到杂化膜C(HM)；

4)将步骤3)得到的杂化膜C与步骤2)得到的粉末B按质量比1：2混合，超声波细胞破碎仪处理，并采用物理挤压法得到仿生递药系统D(MTZ/Ftn-DOX@HM)。

本发明提供了一种归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统，具体来说，这种纳米仿生递药系统继承了红细胞膜和具核梭杆菌膜两种亲本成分的功能，不仅具有高效的肿瘤归巢能力，而且具有强大的隐身性和长循环能力，可以实现抗生素的定点递送。考虑到免疫原性化疗已显示出与免疫检查点阻断疗法协同的巨大潜力，通过偶氮苯(AZO)交联将铁蛋白纳米包裹的阿霉素(Ftn-DOX)与抗生素甲硝唑(MTZ)整合到纳米载体中。在低氧肿瘤环境下，该纳米载体可有效释放MTZ，消除瘤内具核梭杆菌，从而逆转免疫抑制微环境。同时，释放的Ftn-DOX靶向肿瘤细胞，触发强大的免疫原性死亡，从而协同促进免疫治疗，与目前提高乳腺癌免疫治疗方法相比，本发明设计简单，材料安全，既能归巢肿瘤有效递送抗生素解除免疫抑制，同时又能减少化疗药毒副作用，高效诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，对提高乳腺癌免疫治疗具有重要意义，相关试验资料如下：

一、归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统检测与分析

1、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统进行流体动力学和电位水平分析，结果如图1所示。

从图1中分析可知，动态光散射结果表明，HM涂层后MTZ/Ftn-DOX的直径从103.2nm增加到120.9nm，表明MTZ/Ftn-DOX@HM的成功制备。电位分析结果，MTZ/Ftn-DOX@HM的电位与HM基本一致，说明HM涂层是完整且饱和的，以上说明归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统的成功制备。

2、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行透射电子显微镜分析，比例尺为100nm，结果如图2所示。从图2中观察分析可知，归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统MTZ/Ftn-DOX@HM尺寸为100nm左右，具有均匀球形结构。

3、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统乏氧响应性能进行透射电子显微镜分析。

具体操作为：将MTZ/Ftn-DOX@HM与PBS或含Na

结果显示，MTZ/Ftn-DOX@HM在常氧条件下保持了良好的球形结构，但在缺氧条件下球形结构被破坏或崩解，这一特性为药物的乏氧释放提供了依据(图3，比例尺为100nm)。

4、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行特异性释药考察

具体操作为：为了检测MTZ的释放，将MTZ/Ftn-DOX@HM溶液在PBS或含Na

从图中分析可知，在缺氧条件下，MTZ/Ftn-DOX@HM在36h内释放了约80％的MTZ，而在常氧条件下，MTZ/Ftn-DOX@HM中MTZ释放量低于20％，这再次证明了MTZ/Ftn-DOX@HM的乏氧响应性。此外，缺氧/低pH环境下DOX的释放结果表明，在pH 5.0和pH 7.4条件下，36h DOX的释放率分别为72.14％和16.62％(图4)。

5、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行稳定性考察

具体操作为：将MTZ/Ftn-DOX@HM溶液分散在PBS、RPMI-1640和10％ FBS中，观察一周内流体动力直径和zeta电位变化情况。

结果显示，MTZ/Ftn-DOX@HM在PBS、RPMI-1640和10％ FBS中的流体动力直径和zeta电位在一周内没有明显变化(图5)，说明MTZ/Ftn-DOX@HM具有优异的稳定性。

6、将实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行免疫逃逸能力考察

具体操作为：将3×10

结果显示，由于RBCM介导的长循环性能，与MTZ/Ftn-DOX@FM相比，MTZ/Ftn-DOX@HM具有和MTZ/Ftn-DOX@RBCM一样优异的抗巨噬细胞吞噬能力，为药物在肿瘤部位的有效积累奠定了基础。

7、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行诱导肿瘤细胞凋亡考察

具体操作为：将3×10

结果显示，与对照组(1.07％)相比，Ftn-DOX(41.79％)和MTZ/Ftn-DOX@HM(38.51％)中凋亡细胞占比明显增加，说明MTZ/Ftn-DOX@HM具有和Ftn-DOX一样诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

8、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行归巢肿瘤能力的考察

具体操作为：将游离IR783、MTZ/Ftn-DOX@RBCM-IR783和MTZ/Ftn-DOX@HM-IR783(IR783,500μg/kg)分别静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内。随后，在给药后12、24和48h进行荧光成像(激发，720nm、发射，790nm)。48h后，解剖小鼠主要脏器和肿瘤组织，进行荧光成像，结果如图7所示。

结果显示，在给药后12h后,MTZ/Ftn-DOX@HM-IR783组的肿瘤荧光强度明显强于MTZ/Ftn-DOX@RBCM-IR783组和游离IR783组，说明MTZ/Ftn-DOX@HM可以通过归巢靶向作用将药物有效地递送到肿瘤中。注射后48h，IR783组几乎没有荧光，MTZ/Ftn-DOX@RBCM-IR783组只有微弱荧光，但MTZ/Ftn-DOX@HM-IR783组在肿瘤中仍有较强的荧光。此外，注射后48h解剖小鼠，MTZ/Ftn-DOX@HM-IR783组离体肿瘤组织的荧光强度最高。以上结果均显示MTZ/Ftn-DOX@HM能够显著的富集在肿瘤部位，为药物的定点递送奠定了基础。

9、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行抗肿瘤作用考察

具体操作为：将1×10

结果显示，与临床相同给药方案的Ftn-DOX&αPD-L1组抗肿瘤效果并不显著。相比之下，MTZ/Ftn-DOX@HM&αPD-L1对肿瘤生长有明显的抑制作用，抑瘤率高达90％以上(图9)，表明了仿生纳米系统优异的肿瘤抑制效率。

10、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行体内抗菌作用考察

具体操作为：将归巢肿瘤并特异性释药仿生递药系统抗肿瘤作用考察实验收集的肿瘤组织，进行原位荧光杂交检测来观察仿生递药系统的体内抗菌作用，结果如图10所示。

结果如图10所示，与不含MTZ的其他组相比，MTZ/Ftn-DOX@HM、MTZ/Ftn-DOX@HM&αPD-L1组几乎没有观察到具核梭杆菌的信号，说明MTZ/Ftn-DOX@HM可以有效消除瘤内具核梭杆菌。

11、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行体内逆转免疫抑制作用考察

具体操作为：将归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统抗肿瘤作用考察实验收集的肿瘤组织用肿瘤裂解试剂盒进行解离制成单细胞悬液。众所周知，抗肿瘤免疫应答的强弱是通过CD8+T细胞的数量来反映的，所以随后分别加入CD45

结果如图11所示，MTZ/Ftn-DOX@HM和MTZ/Ftn-DOX@HM&αPD-L1组CD8

12、实施例1制得的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统进行维持菌群平衡作用考察

全身使用抗生素可能会对体内其他微生物群造成严重损害。越来越多的证据表明，肠道微生物群在肿瘤免疫治疗中起着至关重要的作用，全身给药抗生素对接受免疫检查点阻断治疗的患者有负面影响。因此，我们构建了4T1荷瘤小鼠模型，进一步评估MTZ/Ftn-DOX@HM对体内系统微生物平衡的影响(游离MTZ为阳性对照)。在治疗结束时对不同组小鼠粪便标本进行16S rDNA测序。

结果如图12所示，肠道菌群的α多样性分析结果显示，与对照组相比，MTZ组的Chao1、Simpson、Observed-species和Dominance指数发生了显著变化，而MTZ/Ftn-DOX@HM组与对照组之间无显著差异，说明系统给药MTZ/Ftn-DOX@HM不会影响肠道菌群的多样性和丰富度，具有潜在维持体内菌群平衡的作用。

在对上述实施例1实验的同时，对其它实施例也做了同样的实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统，合成材料来源丰富，方便获取，成本低；合成简单，时间周期短，便于临床转化。

2)本发明提供的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统，继承了两种亲本成分的功能，具有优异的免疫逃逸能力和肿瘤归巢能力，实现药物高效的肿瘤积累，也具有良好的稳定性，为体内传递提供了支持。

3)本发明提供的归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统，一方面可以高效的负载抗生素和化疗药等药物，另一方面具有乏氧响应特性，在乏氧肿瘤微环境中释放甲硝唑和铁蛋白药物，保证药物有效性并减少毒副作用。

4)本发明利用归巢肿瘤乏氧释药仿生递药系统，安全有效的消除乳腺肿瘤驻留的具核梭杆菌逆转了免疫抑制，既提高了免疫治疗效果，又避免了全身菌群紊乱引起的不良后果，为乳腺癌免疫治疗提供了新的策略。

二、结论

本发明归巢肿瘤乏氧释药的仿生递药系统为增强乳腺癌免疫治疗提供了一个新的策略，用于定点抗生素递送，并证明了这种仿生纳米载体可以精确地定位于乳腺癌，增加药物在肿瘤部位积累，有效地消除了肿瘤内的具核梭杆菌，而不破坏全身微生物群的多样性和丰富度，最终重塑了免疫抑制微环境，提高了PD-L1阻滞剂的治疗效果，是归巢肿瘤药物仿生递药系统上的创新，具有实际的临床意义和推广价值。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。