一种用于防治溃疡性结肠炎的石斛多糖及ROS响应释放的石斛多糖纳米载体

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及石斛多糖用于防治溃疡性结肠炎。

背景技术

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。沙门氏菌感染症为人畜共患感染性疾病，主要由食用遭受污染的食物导致，据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌感染比较凶险，不但表现为急性胃肠炎，而且还有发热等全身性感染的症状，早期可能出现菌血症，必须要积极应对，目前最重要且有效的治疗方式为使用对病原菌敏感的抗生素。最近研究发现，由于抗生素的滥用，已经开始出现耐药甚至耐多药沙门氏菌。因此，寻找新的抗沙门氏菌感染药物仍是研究重点。最近，从中药植物及其有效成分中寻找抗沙门氏菌感染药物已越来越受到重视。

申请号为CN202210802817.5(授权公告号为CN115120622B)的中国专利申请公开了树舌灵芝乙醇提取物在缓解沙门氏菌感染的应用，属于生物医药领域。本发明首次证实树舌灵芝乙醇提取物通过降低沙门氏菌毒力、运动性以及生物膜形成，达到体内缓解沙门氏菌感染的作用。具体地，树舌灵芝乙醇提取物可以缓解小鼠沙门氏菌感染，具有降低沙门氏菌肝脏迁移量、降低炎症因子表达、维持肠道屏障稳态，从而达到缓解沙门氏菌感染的作用。

申请号为CN202210941394.5(申请公布号为CN115154480A)的中国发明专利申请公开了赤灵芝多糖与环丙沙星联合应用在治疗和/或缓解沙门氏菌感染产品中的应用，属于生物医药领域。动物沙门氏菌感染实验发现赤灵芝多糖在不影响环丙沙星治疗沙门氏菌感染的前提下，能够提高与肠道屏障有关的紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达量，缓解了环丙沙星治疗沙门氏菌感染引起的肠道屏障损伤，起到保护肠道屏障维持肠道菌群正常。由此可见，赤灵芝多糖具有缓解因抗生素使用导致的肠道屏障损伤的巨大潜力。

申请号为CN202210463785.0(申请公布号为CN114681441A)的中国发明专利申请公开了涉及羟甲基香豆素在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)抑制剂及抗沙门氏菌感染药物中的应用。通过体外细胞(人宫颈癌细胞系，HeLa)感染保护实验及鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗试验证实羟甲基香豆素通过抑制T3SS的功能来发挥沙门氏菌感染。与传统抗生素相比，羟甲基香豆素可通过抑制T3SS的功能来发挥抗感染的作用，故不易诱导细菌耐药性的产生。

申请号为CN202110310604.6(申请公布号为CN115105493A)的中国专利申请公开了染料木黄酮在制备抗沙门氏菌感染引起的结肠炎药物中的应用。染料木黄酮添加在饲料中，可有效抑制小鼠沙门氏菌感染引起的结肠炎。与感染组相比，饲料添加染料木黄酮能有效缓解结肠黏膜损伤和结肠炎。本发明可有效缓解畜牧业中使用抗生素药物产生的耐药性及耐药基因传播。在此基础上加快抗结肠炎药物的研发，对畜牧绿色健康养殖和人类健康具有重要益处。

齿瓣石斛Dendrobium devonianum Paxton为兰科植物石斛属植物，又名紫皮石斛、紫皮兰、香棍草、大黄草，具有益胃生津、滋阴清热的功效，是中国重要的药用植物资源，也是中国云南等地的经济作物之一。多糖是齿瓣石斛的主要生物活性成分，但齿瓣石斛多糖属于大分子多糖，直接给药存在着多糖在体内代谢较快，作用时间短，作用范围不集中，用药量大以及生物利用度低等局限，因此，如何对齿瓣石斛多糖进行开发和利用是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于防治溃疡性结肠炎的石斛多糖，以及ROS响应释放的石斛多糖纳米载体。本发明不仅将石斛多糖用于防治溃疡性结肠炎，同时还提供了ROS响应释放的石斛多糖纳米载体，以提高药物的靶向性和疗效。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)将齿瓣石斛饮片湿法粉碎，得粉碎后的齿瓣石斛；

2)将粉碎后的齿瓣石斛加水提取，过滤，得提取液；

3)将提取液浓缩，得浓缩液I；

4)在浓缩液I中添加乙醇醇沉，得沉淀；

5)将沉淀溶解脱蛋白后浓缩，得浓缩液II，

6)将浓缩液II干燥，得石斛多糖；

优选的，步骤1)中，所述的粉碎为加水研磨湿法粉碎，过60目筛网，得到粉状齿瓣石斛。

优选的，步骤2)中，所述的提取为加原料饮片质量40～60倍的水，采用激流破壁提取方法，提取温度为35～40℃，提取时间为30～60分钟。

优选的，步骤3)中，所述的浓缩采用低温浓缩技术，浓缩温度为25～50℃。

优选的，步骤4)中，所述的醇沉，在浓缩液中加乙醇至含醇量为70～90％。

优选的，步骤5)中，所述的蛋白后方法为用氯仿-正丁醇的混合液萃取，取最上层液体，氯仿-正丁醇混合液中氯仿:正丁醇的体积比为4:1。

优选的，步骤6)中，所述的干燥为冷冻干燥。

本发明还提供了石斛多糖纳米载体的制备方法，具体为：将石斛多糖连接ROS响应基团，制备石斛多糖纳米载体。

优选的，所述的ROS响应基团为聚硫化丙烯、硼酸酯、硫醚酯、硫醇缩酮、碲化物、蛋白质屏蔽基团、硒、二茂铁、花青素等。

本发明还提供了石斛多糖纳米载体在制备抗沙门氏菌感染引起的溃疡性结肠炎药物或功能性食品中的应用。

有益效果

本发明所述的石斛多糖具有丰富的生物活性、结肠微生物群的降解性和粘膜粘附性得重要优势，能够在缓解溃疡性结肠炎的方面具有更加优异的作用。

本发明所述的石斛多糖为杂多糖，含有多种多糖，能够作用于多靶点。

本发明所述的石斛多糖的纳米载体可以将药物尽可能多地输送到肠道的病变部位，对于缓解溃疡性结肠炎和减少全身药物吸收具有重要意义。

石斛多糖纳米载体可以在ROS水平较高的结肠炎症部位将包封在内的药物释放出来，起到抗溃疡性结肠炎的作用，提高药物的靶向性和疗效，同时，与石斛多糖抗溃疡性结肠炎的作用相结合，起到更好的协同作用。

本发明将“ROS响应释放”、“石斛多糖纳米载体”、“抗溃疡性结肠炎”三者有机结合，形成一个完整的整体，高效的防治沙门氏菌感染引起的溃疡性结肠炎。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小鼠脾脏和肝脏的照片和脾脏和肝脏指数图。

图2为结肠长度的照片和测量结果图。

图3为炎症因子的检测结果，从左到右依次表示的炎症因子为IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α。

具体实施方式

本发明提供了一种石斛多糖的制备方法，对齿瓣石斛破碎后进行提取、浓缩和干燥后得到石斛多糖，还提供了将石斛多糖连接ROS响应基团，制备石斛多糖纳米载体的方法。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的石斛多糖的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

制备石斛多糖，制备方法如下：

1)将齿瓣石斛饮片加水研磨湿法粉碎，过60目筛网，得到粉状齿瓣石斛；

2)将粉碎后的齿瓣石斛加原料饮片质量40～60倍的水，采用激流破壁的方法进行提取，提取温度为35～40℃，提取时间为30～60分钟，过滤，得提取液；

3)将提取液用低温浓缩技术，在25～50℃的温度条件下进行浓缩，得浓缩液I；

4)在浓缩液I中添加乙醇至含醇量为70～90％进行醇沉，得沉淀；

5)将沉淀溶解脱蛋白后浓缩，用氯仿-正丁醇的混合液萃取，取最上层液体，即得浓缩液II；其中氯仿-正丁醇混合液中氯仿:正丁醇的体积比为4:1；

6)将浓缩液II冷冻干燥，得石斛多糖；

实施例2

石斛多糖纳米载体的制备方法

将实施例1中得到的石斛多糖连接ROS响应基团，制备石斛多糖纳米载体，ROS响应基团为聚硫化丙烯、硼酸酯、硫醚酯、硫醇缩酮、碲化物、蛋白质屏蔽基团、硒、二茂铁、花青素等。

实施例3

石斛多糖抑制沙门氏菌感染和抗溃疡性结肠炎的动物实验

雄性C57BL/6J小鼠(22±2g)从浙江省实验动物中心获得(许可证编号：SCXK(浙江)2019-0002)。动物适应环境一周后，随机分为对照组、模型组、齿瓣石斛多糖高剂量组(H-CP组)和齿瓣石斛多糖低剂量组(L-CP组)，每组15只。H-CP和L-CP组每天分别灌胃200μl石斛多糖溶液(200mg/kg)和200μl石斛多糖溶液(50mg/kg)。Control组(控制组)和Model组(模型组)均每天灌胃200μl无菌水。21天后，除Control组每天灌胃200μl无菌水外，其它组均每天灌胃200μl鼠伤寒沙门氏菌混悬液(2×10

脏器系数检测结果如图1所示，鼠伤寒沙门氏菌侵蚀后，小鼠脾脏和肝脏出现肿大的症状，脾脏和肝脏指数显著提高，高剂量石斛多糖处理后可以逆转这种症状，表明齿瓣石斛多糖可有效抑制沙门氏菌的感染。

结肠长度测量结果如图2所示，鼠伤寒沙门氏菌侵蚀后，小鼠结肠缩短，石斛多糖处理后缓解了这种症状。

相关炎症因子的检测结果如图3所示，鼠伤寒沙门氏菌侵蚀后，炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著上调，IL-10表达显著下调。表明齿瓣石斛多糖可缓解沙门氏菌感染引起的溃疡性结肠炎。

由以上实施例可知本发明提供的石斛多糖能够有效抑制沙门氏菌的感染，缓解沙门氏菌感染后结肠缩短的症状，同时能够显著调节炎症因子，缓解溃疡性结肠炎。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。