一种青钱柳染色体制片的方法

技术领域

本发明涉及生物制片领域，具体为一种青钱柳染色体制片的方法。

背景技术

青钱柳(Cyclocarya paliurus)为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，是第四纪冰川幸存下来的孑遗植物，也是我国特有的单种属植物，主要分布于长江以南地区。据《中国中药资源志要》记载，青钱柳的皮、叶、根均可入药，具有止痛、止渴、清热解毒等功效，可用于顽癣等疾病的治疗。叶片为青钱柳的主要活性部位，含有丰富的三萜、黄酮及多糖等活性成分，同时具有降血糖、调血脂、降血压、降尿酸和保护肝脏等多种作用。青钱柳木材硬度适中，切面光滑，胶粘性能良好，适合做家具、胶合板、室内装饰和建筑材料等。因此，青钱柳是一种集药用、材用、保健等多种功能于一体的药食同源性植物。青钱柳在自然状态下有二倍体和四倍体两种倍性，其中四倍体占大多数。

染色体是遗传物质的主要载体，其结构与形态是植物的基本特征。核型分析通过研究染色体的数目和形态特征，为植物的遗传变异及亲缘关系提供细胞学依据。近年来，人们对青钱柳的研究主要集中于青钱柳的药理作用、生物活性物质的积累机制、种质资源的收集评价等。目前青钱柳细胞染色体研究尚处于起步阶段，仅见染色体数目的报道，其中二倍体为32、四倍体为64。

发明内容

本申请以二倍体青钱柳种子萌发根尖为材料，采用压片法，比较根长、预处理条件、解离方法和染色时间4个因素对染色体制片效果的影响，以获得良好的青钱柳根尖染色体制片体系，并在此基础上对二倍体和四倍体青钱柳进行染色体计数及核型分析，以期为青钱柳种质资源鉴定及细胞学和分子生物学研究奠定基础。

本发明提出一种青钱柳染色体制片的方法，包括以下步骤：

(1)取材：于上午9：00～11：00选取根部嫩白且完整的根尖，取二倍体青钱柳胚根；

(2)预处理：在4℃避光条件下，加入对二氯苯饱和水溶液或者加入0.2％秋水仙素、2mmol/L 8-羟基喹啉或两者等比例混合溶液，进行预处理0.5～8h；

(3)解离：将根尖表面的乙醇洗净，在常温下，用体积比为1:1的浓盐酸：乙醇混合溶液解离5～20min；

(4)制片：将青钱柳根尖洗净，用刀片切取根尖前端淡黄色分生组织，置于卡宝品红溶液中，用针碾碎后染色10～60min，压片法制片。

进一步地，所述的胚根的长度为0.5～1.0cm。

进一步地，所述的预处理为加入对二氯苯饱和水溶液处理6h，或者0.2％秋水仙素、2mmol/L 8-羟基喹啉等比例混合溶液处理4h。

进一步地，所述的解离时间为10min。

进一步地，所述的染色时间为30min。

本发明的有益效果：

在青钱柳染色体制片过程中，不同的根长、预处理试剂及处理时间、解离方法及时间、染色时间都会影响最终的制片效果。通常染色体核型分析对于制片的要求较高，尤其是青钱柳的染色体较小，因此筛选优良的染色体制片技术是关键。一般能进行细胞分裂的组织或细胞都可作为染色体制片的材料，包括根尖、茎尖、幼叶、花粉母细胞、愈伤组织等。根尖是最常用的取材部位，不同根尖取材长度获得的中期分裂相数目不同。北柴胡(Bupleurum chinese)胚根长至0.5～1.0cm时，根尖处于有丝分裂期且染色体清晰可见的细胞最多。不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)根长度为1.0～2.0cm，分裂相数目相对较多，占细胞总数的64.75％。本研究得出青钱柳根长为0.5～1.0cm时，中期细胞所占比例最高。

预处理是染色体制片中关键的一步，预处理试剂能够抑制纺锤丝的形成，阻止分裂细胞中的染色体进入分裂后期，从而得到许多处于分裂中期的分裂相。预处理试剂有秋水仙素、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、冰水混合物等，不同植物适用的最佳预处理方式不同。美洲黑杨×大青杨(Populus deltoides×P.ussuriensis)根尖采用对二氯苯饱和水溶液0℃下处理2h，能够获得较多的中期细胞，且染色体形态最好。春石斛(nobile-typeDendrobium)根尖用饱和对二氯苯与2mmol/L8-羟基喹啉混合液预处理4h后，易得到较多染色体形态清晰的分裂相细胞。裕民无刺红花(Carthamus tinctorius)根尖用2mmol/L 8-羟基喹啉与0.1％秋水仙素按1：1的混合溶液预处理8h，中期细胞数所占比率和适宜核型分析的中期细胞比率均最高。本研究得出，在9：00～11：00取青钱柳根长为0.5～1.0cm时的根尖为材料，4℃避光条件下用0.2％秋水仙素与2mmol/L 8-羟基喹啉等比例混合溶液处理1～2h或对二氯苯饱和水溶液处理6h都能得到较好的制片效果。使用0.2％秋水仙素与2mmol/L8-羟基喹啉等比例混合溶液可能兼具两种预处理液的优点，秋水仙素能够显著提高分裂细胞的中期分裂相比例，8-羟基喹啉能使染色体轮廓更为清晰，利于染色体缢痕的显现，因此两者的混合液效果优于单独使用效果。

解离能够使植物细胞壁软化或分解，利于染色体分散和制片。解离时间及温度要适当，时间过短或温度过低，细胞壁软化不到位，染色体分散效果差，时间过长或温度过高，细胞壁破裂，染色体可能会受损或丢失，且着色困难。不同试验材料最佳的解离方法不同。滇杨(Populus yunnanensis)根尖染色体制片的最优解离条件是以浓盐酸：无水乙醇＝1：1为解离液，在常温下解离4min。桉树(Eucalyptus robusta)根尖用纤维素酶和果胶酶混合溶液于37℃恒温解离35min效果最佳。本研究得出青钱柳在常温下浓盐酸乙醇混合溶液解离10min效果最佳。

染色的目的是使染色体及细胞核着色，易于观察到清晰的染色体形态，便于计数及核型分析。紫果西番莲用卡宝品红溶液染色10min效果最佳。本研究卡宝品红溶液染色30min，与细胞质背景颜色对比明显，能得到清晰的染色体图像。

附图说明

图1为不同预处理方式对制片效果的影响；

图2为不同解离方法对制片效果的影响

图3为不同染色时间对制片效果的影响

图4为青钱柳不同倍性的中期分裂相(左)、核型图(中)及核型模式图(右)。

具体实施方式

以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明范围的限制。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为青钱柳二倍体和四倍体根尖。二倍体和四倍体母树均生长于湖北省宜昌市五峰土家族自治县，经倍性鉴定后，于2020年10月采集种子，阴干去翅后室外自然层积至2022年3月种子萌发。

1.2方法

1.2.1取材

待根生长分别达到0.5～1.0cm、1.0cm～2.0cm和大于2.0cm时，于上午9：00～11：00选取根部嫩白且完整的根尖，放入装有对二氯苯饱和水溶液的离心管中，在4℃避光条件下预处理6h后，用去离子水洗净，转入新鲜配制的卡诺固定液Ⅰ(V

1.2.2预处理

取长度达到0.5～1.0cm的二倍体青钱柳胚根，在4℃避光条件下，采用以下(表1)四种预处理液对根尖进行不同时间梯度预处理，固定、解离、染色同上。

表1预处理试剂及时间

1.2.3解离

在4℃条件下，采用0.2％秋水仙素与2mmol/L 8-羟基喹啉等比例混合溶液对根长为0.5～1.0cm的二倍体青钱柳根尖预处理1h，固定同上。将根尖表面的乙醇洗净，在常温下，用浓盐酸乙醇混合溶液分别解离5min、10min、20min；在60℃条件下，1mol/L HCl分别解离5min、10min、20min，染色同上。

1.2.4染色

浓盐酸乙醇混合溶液常温下解离10min后，将二倍体青钱柳根尖洗净，用刀片切取根尖前端淡黄色分生组织，置于卡宝品红溶液中，用针碾碎后分别染色10min、30min、60min。采用常规压片法制片，在40倍显微镜下(Olympus BX 51)选择制片效果较好的中期分裂相，用100倍油镜进行拍照记录。

1.2.5染色体计数及核型分析

采用优化后的染色体制片技术对两种倍性的青钱柳根尖进行染色体制片。不同倍性青钱柳各选取30个以上染色体分散良好的细胞分裂相进行染色体数目统计，选取5张染色体分散良好、形态清晰的中期细胞照片进行核型参数测量与计算。

1.2.6数据统计与分析

在研究根长对制片效果的影响时，每梯度根长观察10个根尖，每2个根尖制一张片，选择3张分裂相较多的制片，随机选取3个视野，统计各视野的细胞总数、中期细胞数和适于核型分析的中期细胞数，采用Excel软件进行分析，得出平均值。中期细胞所占比例(％)＝中期细胞数/总细胞数×100％，适合核型分析的中期细胞比例(％)＝适合核型分析的中期细胞数/中期细胞数×100％。

核型分析参照李懋学等(1985)的方法，核型分类参照Stebbins(1971)的分类标准。染色体相对长度按Kuo(1972)等方法划分；核型不对称系数按照Arano(1963)的方法计算。采用MATO(Meansurement and Analysis Tools)软件对染色体的长臂、短臂进行测量分析，根据得到的数据对同源染色体进行配对，利用Excel 2016制作核型模式图，染色体按从长到短的顺序编号。用Adobe Photoshop CS6对染色体图片进行剪切、排列。

2结果与分析

2.1根长对制片效果的影响

随着青钱柳根长度不断增加，中期细胞所占比例及适合核型分析的中期细胞比例均减小。当根长在0.5～1.0cm时，中期细胞所占比例及适合核型分析的中期细胞比例均最高，分别为2.71％、16.30％；当根长大于2cm，适合核型分析的中期细胞比例仅为4.01％。结果表明，最佳根长范围为0.5～1.0cm，此时制片效果最好，随着根长的增加，制片效果变差。

表2不同根长对制片效果的影响

2.2预处理试剂对制片效果的影响

由图1可看出，0.2％秋水仙素与2mmol/L 8-羟基喹啉等比例混合溶液处理0.5h时，染色体之间相互粘连；处理1h、2h染色体分散性好，形态轮廓清晰，长度适中，背景干净；处理4h，染色体不够分散且长度较短，成点状，不易于核型分析。2mmol/L 8-羟基喹啉溶液处理1h、2h、4h染色体弯曲细长、相互交缠；处理6h时，染色体弯曲，轮廓模糊。对二氯苯饱和水溶液处理2h、4h染色体长度偏长，相互重叠不够分散；处理6h时，染色体较分散，长度适中；处理8h，染色体过短。0.2％秋水仙素溶液处理10min、20min染色体形态弯曲偏长，相互粘连；处理30min、40min，染色体仍相互重叠，不够分散，且轮廓不清晰。综合分析不同预处理试剂及处理时间的制片效果，发现0.2％秋水仙素与2mmol/L 8-羟基喹啉等比例混合溶液处理1～2h和对二氯苯饱和水溶液处理6h，染色体分散性好，形态清晰，长度适宜，中期分裂相较多，适合作为核型分析预处理方案。

2.3解离方法对制片效果的影响

图2为不同解离方式对染色体制片的影响，本研究结果表明，60℃条件下，1mol/LHCL解离5min时，细胞壁解离较差，压片时染色体不易分散；解离10min时，细胞壁解离适中，但细胞质染色较深，不利于观察染色体；解离20min时，细胞壁解离过度，细胞不完整。常温下使用浓盐酸乙醇混合溶液解离5min时，未能去除细胞壁，导致染色体不够分散；浓盐酸乙醇混合溶液解离10min时，细胞壁解离良好，染色体分散适中，且细胞质染色较浅；浓盐酸乙醇混合溶液解离20min时，细胞破裂，压片时易造成染色体丢失。综合分析不同解离方法对制片效果的影响，得出常温下浓盐酸乙醇混合溶液解离10min效果最佳。

2.4染色时间对制片效果的影响

由图3可见，使用卡宝品红溶液染色10min，染色体着色较浅，不易清晰地观察到染色体形态，无法计数；染色30min，染色体着色良好，细胞质着色浅，对比明显，制片效果最佳；染色60min，染色体及细胞质着色均较深，背景混乱，难以观察到染色体形态。

2.5不同倍性青钱柳根尖染色体核型分析

本试验各统计青钱柳细胞36个，二倍体和四倍体中85％以上的细胞均具有恒定的染色体数目，分别为32、64。各选取5张染色体分散良好、形态清晰的中期分裂相图片，取5个细胞的平均值作为核型参数。如表5所示，二倍体的核型公式为2n＝2x＝32＝32m，组成类型仅有中部着丝粒染色体(m)一种类型，核不对称系数为57.61％，没有臂比值大于2的染色体，属于1B型。染色体相对长度范围为3.86～10.36，平均臂比为1.34，最长与最短染色体长度比为2.68。四倍体的核型公式为2n＝4x＝64＝60m+4sm，染色体组成有中部着丝粒染色体(m)和近中部着丝粒染色体(sm)两种类型，核不对称系数为58.83％，也属于1B型，染色体相对长度范围为3.44～9.66，平均臂比为1.42，最长与最短染色体长度比为2.81。

表3二倍体青钱柳核型参数

表4四倍体青钱柳核型参数

表5不同倍性青钱柳核型比较

3结论与讨论

本试验结果表明青钱柳二倍体染色体数目为32，四倍体染色体数目为64，这与前人的研究结果一致。二倍体核型公式为2n＝2x＝32＝32m，核型属于1B型，核型不对称系数为57.61％。四倍体核型公式为2n＝4x＝64＝60m+4sm，核型属于1B型，核型不对称系数为58.83％。一般认为，核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的，核型不对称系数越接近50％，说明核型越对称，进化类型越原始，反之，进化程度越高。由此推测，青钱柳二倍体、四倍体在进化中均处于较原始地位。Qu等(2023)的研究表明，在～11.2-10.5Mya青钱柳经历了一次特有的全基因组加倍事件，导致了其同源四倍化。同源加倍会导致基因冗余和多体遗传，因此有研究者推测物种在适应环境演变的过程中，同源多倍体可能更具有优势，而随着多倍体的扩散，二倍体在地理分布上可能变得越来越局限，以至最终绝灭。课题组前期研究发现，青钱柳天然分布于我国15个省市，其中四倍体分布很广，而二倍体仅见于四个省市，且分布范围较狭窄。对于青钱柳四倍体是如何起源和扩散的，以及其分布格局形成的原因，相关研究正在进行中。