苯佐卡因在采后苹果黑斑病防治中的应用

技术领域

本发明属于农药技术领域，尤其涉及苯佐卡因在采后苹果黑斑病防治中的应用。

背景技术

苹果(Malus domestica)是我国北方地方广泛种植的水果。苹果黑斑病是由互隔交链孢，也叫细交链孢，链格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)侵染引起的真菌性病害，苹果黑斑病在采前和采后商品化处理中均可侵染果实，贮藏后期在果实表面产生黑色的病斑，导致果实腐烂，病变部位表面密布黑色或黑绿色霉状物，霉层上附有白色絮状物，对贮藏、运输和销售造成影响，引起巨大经济损失。目前多用人工合成杀菌剂对病害进行控制，尽管合成杀菌剂能有效的控制采后病害，但其会对人体健康与环境产生危害，并使病原菌产生耐药性。因此，研究并利用现有的化学杀菌剂的替代物来防治果蔬的病害已势在必行。苯佐卡因(Benzocaine)又名对氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯甲酸乙酯，化学式为C

发明内容

本发明的目的是提供苯佐卡因在采后苹果黑斑病防治中的应用，苯佐卡因具有较强抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)的效果，能有效预防苹果黑斑病的发生，对苹果黑斑病有一定的治疗效果，以保护作用为主。

第一方面，本发明保护苯佐卡因在如下任一项中的应用：

A1)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)；

A2)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝生长；

A3)促使互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝表面破裂。

第二方面，本发明保护苯佐卡因在预防和/或治疗植物真菌病害中的应用，所述真菌为互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)。

第三方面，本发明保护苯佐卡因在预防和/或治疗采后苹果黑斑病中的应用。

在本发明的一些实施方式中，施用方式为以苯佐卡因溶液的形式喷施，苯佐卡因的浓度为42.99mg/L。为了提高苯佐卡因在水中的溶解性，优选地，所述苯佐卡因溶液由苯佐卡因、二甲基甲酰胺(DMF)、乳化剂OP-10和水组成。在本发明的一些实施例中，所述二甲基酰胺在所述苯佐卡因溶液中的质量浓度为5％；所述乳化剂在所述苯佐卡因溶液中的质量浓度为10％。

第四方面，本发明保护包含苯佐卡因的组合物在如下任一项中的应用：

A1)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)

A2)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝生长；

A3)促使互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝表面破裂。

第五方面，本发明保护包含苯佐卡因的组合物在预防和/或治疗植物真菌病害中的应用，所述真菌为互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)。

第六方面，本发明保护包含苯佐卡因的组合物在预防和/或治疗采后苹果黑斑病中的应用。

第七方面，本发明保护包含苯佐卡因的北五味子果实提取物在如下任一项中的应用：

A1)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)；

A2)抑制互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝生长；

A3)促使互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)菌丝表面破裂。

第八方面，本发明保护包含苯佐卡因的北五味子果实提取物在预防和/或治疗植物真菌病害中的应用，所述真菌为互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)。

第九方面，本发明保护包含苯佐卡因的北五味子果实提取物在预防和/或治疗采后苹果黑斑病中的应用。

上述的应用中，所述北五味子果实提取物为木兰科北五味子属植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的果实提取物，可直接从商业途径获得，也可按照文献中公开的制备方法获得。可以理解的是，北五味子果实提取物其可为任意市售产品，或通过任意提取分离方法获得，只要该提取物中包含苯佐卡因，且苯佐卡因的含量可保证北五味子果实提取物对互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)具有理想的的抑菌效果、或对包括苹果黑斑病的植物真菌病害具有理想的防治效果即可。例如，所述北五味子果实提取物为北五味子果实的乙醇提取物。在本发明的一些实施方式中，所述北五味子果实提取物的制备方法，包括：1)将北五味子果实粉末在料液比1∶20条件下，用70％乙醇浸提3次，60min/次，合并滤液，经抽滤，分别得到北五味子果实粗提液；2)用料液比1：20石油醚浸提2次，4h/次，脱脂，萃取分离，保留乙醇层，在60℃水浴条件下旋蒸至无乙醇味，得到北五味子果实提取物。

上述的应用中，所述互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)为可引起黑斑病的致病菌，包括但不限于苹果黑斑病病原菌，如由苹果病果中分离出的链格孢病菌YLPGl7092603-1菌株或YLPGl7092603-2菌株。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现，北五味子果实提取物对A.alternata具有抑菌效果，在北五味子果实提取物浓度为8mg/mL时，对A.alternata的抑制率为91.9％；使用液质联用技术进行了化合物检测，北五味子果实提取物当中，含有大量的有机酸类化合物和苯丙素类化合物，其中，苯丙素类化合物苯佐卡因具有较强抑制A.alternata的效果，EC

附图说明

图1为本发明实施例1中北五味子果实提取物中化合物种类及相对含量。

图2为本发明实施例2中苯佐卡因对A.alternata的菌丝生长抑制效果图，(a)对照(苯佐卡因浓度0mg/L)；(b)苯佐卡因浓度25mg/L；(c)苯佐卡因浓度50mg/L；(d)苯佐卡因浓度100mg/L；(e)苯佐卡因浓度200mg/L；(f)苯佐卡因浓度400mg/L。

图3为本发明实施例2中不同处理A.alternata菌丝的形态扫描电镜图，A-对照；B-42.99mg/L苯佐卡因处理。

图4为本发明实施例3中苯佐卡因对采后苹果黑斑病的防治效果图，a-对照组，b-治疗作用处理组，c-保护作用处理组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的北五味子果实提取物：北五味子，北五味子种植园(124.8°E；40.8°N)(http://www.hywwz.cn；宽甸县，中国辽宁省)采集的北五味子一年生果实。

将洗净后的北五味子果实置于电热恒温鼓风干燥箱60℃烘干至恒重。使用多功能粉碎机粉碎成粉末。采取乙醇提取法提取北五味子果实中活性物质，称取北五味子果实粉末100g置于锥形瓶中，在料液比1∶20条件下，用70％乙醇浸提3次，60min/次，合并滤液。经抽滤，分别得到北五味子果实粗提液。用料液比1：20石油醚浸提2次，4h/次，脱脂。萃取分离，保留乙醇层，在60℃水浴条件下旋蒸至无乙醇味，得到北五味子果实提取物并称重。

下述实施例中的苯佐卡因(分析纯，纯度99％)由上海麦克林生化科技有限公司生产，产品货号为Lot#:C12579078。

下述实施例中的互隔交链孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)YLPGl7092603-1记载于文献“武海燕，李长水，马庆周，尹新明，耿月华，张猛.链格孢(Alternaria alternata)在枣、梨和苹果果实上的致病性分化研究[J].；天津农业科学Tianjin Agricultural Sciences,2023，29(5)：47-50”中，公众可从河南农业大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的苹果果实均为红富士苹果，购于北农超市，于4℃贮藏待用。

实施例1、评价北五味子果实提取物对A.alternata的抑菌效果和成分分析

(1)抑菌实验

实验方法：

将A.alternata活化，接种于PDA培养基，28℃恒温培养72h。将北五味子果实提取物用无菌水稀释至浓度为0、0.5、1、2、4和8mg/mL的带药PDA培养基，其中0作为对照组。倒入培养皿等待冷却凝固之后，接上菌饼直径为6mm活化后的植物病原真菌，28℃的恒温培养72h，使用十字交叉法测量其菌落的直径，通过菌丝生长抑制率公式进行计算。

实验结果：五味子果实提取物浓度:0、0.5、1、2、4和8mg/mL的抑制率分别为0、11.5、31.1、51.4、70.3、91.9％。

结果显示，北五味子果实提取物对A.alternata具有抑菌效果，在北五味子果实提取物浓度为8mg/mL时，对A.alternata的抑制率为91.9％。

(2)化合物提取

精确称量200μg北五味子果实提取物于2mL离心管中，加入600μL甲醇(1：3w/v)含2-氯-L-苯丙氨酸(4ppm)，涡旋振荡30s；加入100mg玻璃珠，放入组织研磨器中，60Hz研磨90s；室温超声15min；12000rpm 4℃离心10min，取上清液过0.22μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。

(3)上机检测

色谱条件为：超高效液相系统，(2.1×150mm,1.8μm)色谱柱，0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样量2μL。正离子模式，流动相为0.1％甲酸乙腈(C)和0.1％甲酸水(D)，梯度洗脱程序为：0～1min，2％ C；1～9min，2％～50％ C；9～12min，50％～98％ C；12～13.5min，98％ C；13.5～14min，98％～2％ C；14～20min，2％ C。负离子模式，流动相为乙腈(A)和5mM甲酸铵水(B)，梯度洗脱程序为：0～1min，2％A；1～9min，2％～50％A；9～12min，50％～98％A；12～13.5min，98％A；13.5～14min，98％～2％ A；14～17min，2％ A。

质谱条件为：质谱检测器，电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为-2.50kV，鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率60000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z100～1000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30％，二级分辨率为15000，采集信号前4离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

(4)化合物鉴定

化合物的鉴定首先根据精确分子量进行确认(分子量误差为<＝30ppm)，后续根据MS/MS碎片模式对Human Metabolome Database(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)，Massbank(http://www.massbank.jp/)，LipidMaps(http://www.lipidmaps.org)，mzClond(https://www.mzcloud.org)，以及帕诺米克自建标准品数据库确认注释获得化合物。

北五味子果实提取物中通过液质联用方法共检测出157种化合物，按种类分，大致分为11类化合物，其中(图1)有机酸类化合物含量最高，有56种，相对含量占到检测总量的43.09％；其次是苯丙素类化合物，有6种，占到检测总量的21.77％；含量第三为糖类化合物，有12种，占到检测总量的9.55％；酚类化合物含量排名第四，占到检测总量的8.49％。除以上种类化合物，北五味子果实提取物中还含有多元醇类(3.81％)、黄酮类(1.10％)、生物碱类(1.16％)、甘油酯类(1.96％)、胺类(0.66％)、萜类(1.23％)和无机盐化合物(4.41％)等。

按化合物相对含量分，占比1％以上的化合物共有22种(如表1)，其中占比10％以上有两种，分别是壬酸(Pelargonic acid)和苯佐卡因(Benzocaine)，分别占到检测总量的18.93％和14.19％。

表1、北五味子提取物占比1％以上的化合物汇总表

实施例2、评价苯佐卡因对A.alternata的抑菌效果

(1)抑菌效果

实验方法：用生长速率法进行抑菌测定。苯佐卡因不易溶于水，因此用5wt％二甲基甲酰胺(DMF)和10wt％OP-10乳化剂为助剂，加入蒸馏水制备所需的浓度，再制备成一定浓度梯度的带药PDA培养基。倒入培养皿等待冷却凝固之后，接上菌饼直径为6mm的活化后的植物病原真菌，28℃的恒温培养72h，使用十字交叉法测量菌落直径，根据菌丝生长抑制率计算抑菌效果。

实验结果：抑制率结果如表2：毒力回归方程为1.2652x+6.7291(R

表2、苯佐卡因对A.alternata菌丝生长抑制活性

(2)苯佐卡因对A.alternata菌丝形态影响的电镜观察

A.alternata固体培养3d后，在A.alternata菌落边缘取直径为0.6cm的菌片并置于90mm培养皿中PDA固体培养基中央。根据半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect，EC

扫描电子显微镜结果显示，通过EC

实施例3、苯佐卡因对采后苹果黑斑病的防治效果分析

(1)预防作用

实验方法：选择大小均匀的苹果，在超净工作台中使用浸有75％乙醇的棉花擦拭苹果表面三次，以50μL苯佐卡因(42.99mg/L)均匀地喷在富士苹果表面，形成以接种位置为直径的3cm圆圈，对照喷施等量无菌水；静置12h，将A.alternata活化，接种于PDA培养基，28℃恒温培养72h备用。取直径0.6cm的A.alternata菌片贴在喷药中心进行接种；将苹果用保鲜膜包裹于28℃培养，第7天测量病斑直径并计算防效。

实验结果：接种A.alternata 7天后，无苯佐卡因处理的苹果黑斑病情扩散(图4a)，病斑直径达到3.55cm；在接种A.alternata之前喷施50μL(42.99mg/L)苯佐卡因(图4c)苹果黑斑病得到有效预防，平均病斑直径为0.6cm，说明苯佐卡因具有预防苹果黑斑病害的保护作用，效果为83.1％。

(2)治疗作用

实验方法：在富士苹果表面接种0.6cm的A.alternata，用保鲜膜包裹，28℃静置12h；喷施50μL苯佐卡因(42.99mg/L)于接种部位，形成以接种位置为直径的3cm圆圈，对照喷施等量无菌水。再使用保鲜膜包裹，第7天测量病斑直径并计算治疗效果。

A.alternata侵入之后在苹果发病之前喷施苯佐卡因(图4b)平均病斑直径为2.8cm，表明苯佐卡因具有治疗苹果黑斑病害的治疗作用，效果为21.13％。

因此，苯佐卡因能有效防止苹果黑斑病的产生，且对苹果黑斑病具有一定治疗效果，以保护作用为主。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围内，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。