含有影响粘蛋白的蛋白酶的制剂

技术领域

本发明涉及含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶的微球。在一种形式中，本发明涉及含有影响粘蛋白的蛋白酶(比如菠萝蛋白酶(Bromelain))的微球，其用于治疗产生粘蛋白的癌症和涉及粘蛋白的其他疾病。

背景技术

粘蛋白是一类由上皮组织产生的高分子量、高度糖基化的蛋白质，所述上皮组织包括胃肠道、肺、肾、卵巢、乳房和胰腺中的上皮组织。在正常生理条件下，粘蛋白对上皮组织起保护作用。然而，粘蛋白还可涉及多种疾病。例如，特定类型的粘蛋白(例如MUC1，MUC2，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC16以及其他粘蛋白)的过度表达与一些类型的癌症相关。上皮细胞表面上的粘蛋白的合成通常受到严格调节，但是粘蛋白的产生在肿瘤中提高，部分原因是人粘蛋白的提高的表达。在上皮起源的癌症中粘蛋白表达和组成被改变，并且已知的是对于受这样的癌症影响的患者而言，粘液的产生是阴性预后因素。

不正常的粘蛋白积累还可有害地影响患者的健康，引起非癌性疾病，比如囊肿性纤维化和慢性阻塞性肺病。

因此需要治疗涉及粘蛋白的疾病并且为患有这种疾病的患者提供更好的结果。可例如用粘液溶解试剂治疗粘蛋白相关的疾病，所述试剂为影响(例如通过分解或破坏)粘蛋白蛋白质的试剂，使它们粘度降低，并且因此更容易被人体清除或细胞毒性药物更容易渗透(例如在粘蛋白围绕肿瘤的情况中)。

一类粘液溶解试剂为影响粘蛋白的蛋白酶，其为引起粘蛋白蛋白质的蛋白水解的蛋白水解酶。然而，向患者中有效输送影响粘蛋白的蛋白酶可为困难的，因为蛋白酶的典型地复杂性质和伴随副作用的风险。影响粘蛋白的蛋白酶在生理条件下也可具有稳定性问题。

例如，菠萝蛋白酶为影响粘蛋白的蛋白酶。菠萝蛋白酶是菠萝植物(凤梨，AnanasComosus)的提取物并且含有多种硫醇蛋白酶。菠萝蛋白酶具有体内和体外的蛋白水解活性，以及抗水肿、消炎、抗血栓形成和纤溶活性，并且因此可用于治疗诸如深静脉血栓形成和凝血障碍的病症。菠萝蛋白酶，单独地或与其他化疗试剂结合，还在体外和体内模型中显示出对某些类型癌症的抗癌性质。

因此，菠萝蛋白酶已被提出作为治疗某些类型癌症和其他涉及粘蛋白的疾病的治疗药物。然而，涉及全身施用(administration，给药)菠萝蛋白酶的临床试验还未进行，原因是与全身施用治疗有效量的菠萝蛋白酶相关的风险(特别是其纤溶作用和对出血的影响)(如先前的动物研究所示)。

以任何潜在的副作用都被最小化的方式向患者输送治疗有效量的影响粘蛋白的蛋白酶(比如菠萝蛋白酶)将是有利的。

发明内容

在第一方面中，本发明提供了用于输送到患者身体中的目标区域的微球。微球含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶并且适用于在暴露于生理条件时以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出。

将特定的药物加载到用于局部输送到患者身体中的微球中是已知的，例如，在称作经动脉化疗栓塞(TACE)的技术中。例如，由Biocompatibles UK Ltd以商品名DC

形成鲜明对比，影响粘蛋白的蛋白酶为具有高分子量的酶(或酶混合物)。例如，在菠萝蛋白酶的情况中，一些酶据报道的分子量为约33,000Da。因此以下完全不符合现有技术中的教导：影响粘蛋白的蛋白酶，比如菠萝蛋白酶可被加载到微球比如DC

这些现有技术的教导的结果是，通常认为微球，比如本文中描述的那些，不能用于持续输送未指明的分子，更不要说持续输送仍有活性的大酶或含有大酶的酶混合物了。

在发明人的令人惊奇和预料不到的发现菠萝蛋白酶(以及随后的木瓜蛋白酶(Papain))事实上可加载到本文描述的微球(比如DC

发明人认识到其发现具有提供用于局部输送治疗有效量的菠萝蛋白酶和其他影响粘蛋白的蛋白酶的载体的潜力，由此其潜在的副作用被最小化。其显著的优点对本领域技术人员而言将是显而易见的并且将在下文中进一步描述。

在第二方面中，本发明提供了药物组合物，其包含用于输送到患者身体中的目标区域的微球，所述微球含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶并且适用于在暴露于生理条件时以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出；和药学上可接受的载体。

在第三方面中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的第一方面的微球和药学上可接受的载体。

在第四方面中，本发明提供了用于将影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的方法。所述方法包括将微球添加至具有酸性pH(例如低至2或2.5)的溶液；将包含微球的溶液与包含影响粘蛋白的蛋白酶的溶液混合；和将混合物搅动足以使影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的时间。任选地，添加了微球的溶液可具有与患者身体中的目标区域处的离子强度类似的离子强度。

在第五方面中，本发明提供了治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化或慢性阻塞性肺病的方法。所述方法包括向患者施用治疗量有效的含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶的微球，其中微球适用于在施用之后以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出。

如上所述，加载有亚得利亚霉素或伊立替康的微球用于称作经动脉化疗栓塞(TACE)的用于治疗癌症(比如不能切除的肝细胞癌)的方法中。微球被注入到肿瘤上游的动脉中并且当动脉尺寸变小时形成栓塞物。亚得利亚霉素或伊立替康随后从微球中流出到非常接近于并且直达通向肿瘤的血管中，产生高局部浓度的药物。这样准确的有针对性的药物输送可导致更少的药物相关的负面效果

发明人相信在以动脉内的方式输送到患者中时，根据本发明的微球对局部输送影响粘蛋白的蛋白酶可类似地有效。发明人还预期以病灶内方式、以腹腔内方式或以体腔内方式(例如进入到腹膜或胸膜腔中)输送微球对于治疗其他相关疾病将会类似地有效，如将在下文描述。

在第六方面中，本发明提供了治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化或慢性阻塞性肺病的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明第一方面的微球或本发明第二或第三方面的药物组合物。

在第七方面中，本发明提供了本发明第一方面的微球用于制造治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化或慢性阻塞性肺病的药剂(medicament)的用途。

在第八方面中，本发明提供了本发明第一方面的微球用于治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化或慢性阻塞性肺病的用途。

在第九方面中，本发明提供了本发明第一方面的微球，其用作药剂。

在第十方面中，本发明提供了本发明第一方面的微球，其用于治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化或慢性阻塞性肺病。

在第十一方面中，本发明提供了组合物，其包含其中加载了影响粘蛋白的蛋白酶的微球，所述微球适用于在暴露于生理条件时以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出。

在第十二方面中，本发明提供了可注射的组合物，其包含其中加载了影响粘蛋白的蛋白酶的微球，所述微球适用于在暴露于生理条件时以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出。

在第十三方面中，本发明提供了持续释放的制剂，其包含其中加载了影响粘蛋白的蛋白酶的微球，所述微球适用于在暴露于生理条件时以持续方式使影响粘蛋白的蛋白酶流出。

下面将描述本发明的其他方面、特征和优点。

具体实施方式

如上所述，本发明提供了用于输送到患者身体中的目标区域的微球。微球含有一种(或多种)加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶并且适用于在暴露于生理条件时以持续方式使蛋白酶(一种或多种)流出。

微球的动脉内输送是相对良好建立的领域，并且含有用于局部肿瘤的化疗药物的可生物相容的微球已被用于治疗某些肿瘤。例如，由Biocompatibles UK Ltd以商品名DC

在发明人的令人惊奇的和预料不到的发现菠萝蛋白酶(以及之后的木瓜蛋白酶)可加载到微球比如DC

影响粘蛋白的蛋白酶

如上所述，影响粘蛋白的蛋白酶是一类可引起粘蛋白蛋白质的蛋白水解并且由此提供治疗效果的蛋白水解酶。如本文中所使用，术语“影响粘蛋白的”应理解为以任何治疗有效的方式影响粘蛋白，例如，使粘蛋白液化或分解(即使其粘度降低并且更容易被身体清除)或破坏粘蛋白。这样的蛋白酶可用于治疗产生粘蛋白的癌症(其如下文所定义地，可包括分泌粘蛋白的癌症和/或含有粘蛋白的癌症和/或产生粘蛋白的癌症)和其他涉及粘蛋白(例如下文所描述的)疾病。发明人相信任何影响粘蛋白的蛋白酶都可用于本发明中，其中仅需要常规试验和实验(鉴于本文中所包含的教导)以确定任何特定的影响粘蛋白的蛋白酶的适用性。

本发明在下文中将主要在菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的情形中进行描述，这两者都是植物来源的影响粘蛋白的蛋白酶。然而，本领域技术人员会理解本文中所包含的教导可使用常规试验和实验而适用于任何给定的影响粘蛋白的蛋白酶。

例如，影响粘蛋白的蛋白酶可选自影响粘蛋白的植物来源的蛋白酶、影响粘蛋白的真菌蛋白酶和影响粘蛋白的细菌蛋白酶中的一种(或多种)。

存在其他植物来源的蛋白水解酶，其表现出与菠萝蛋白酶相同的特性，并且发明人预期任何植物来源的对粘蛋白(例如其产生)有治疗效果的蛋白酶都可用于本发明，凭借常规实验能够确认任何特定的植物来源的蛋白酶的适用性。在一些实施方式中，例如，植物来源的蛋白酶可选自以下中的一种或多种：菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶(从木瓜中提取)，无花果蛋白酶(Ficain)(从无花果中提取)，奇异果蛋白酶(Actinidain)(从包括奇异果(kiwifruit，猕猴桃)、菠萝、芒果、香蕉和木瓜的水果中提取)，生姜蛋白酶(Zingibain)(从姜中提取)和凤梨蛋白酶(Fastuosain)(来自凤梨(Bromelia fastuosa)的半胱氨酸蛋白酶)。还可使用芦笋、芒果和其他奇异果以及木瓜蛋白酶。

发明人还相信影响粘蛋白的真菌蛋白酶和影响粘蛋白的细菌蛋白酶在本发明中可具有类似的应用。合适的真菌蛋白酶可包括黄曲霉、丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌类蛋白酶家族)、天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶家族)和金属蛋白酶(其中的一些已知通过以上皮细胞壁为目标而具有抗癌活性)。合适的细菌蛋白酶可包括源自蚕肽酶的那些。

如本文中所使用，术语菠萝蛋白酶应理解为涵盖影响粘蛋白以及任选地存在于菠萝植物(Ananas Comosus)提取物中的有治疗活性的物质中的一种或多种。菠萝蛋白酶为多种物质的混合物(包括不同的硫醇内肽酶以及其他组分，比如磷酸酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、纤维素酶、酯酶和几种蛋白酶抑制剂)并且提取物中所含有的全部物质不必须都被加载在微球中，条件是加载到微球中的物质的一部分可至少影响粘蛋白(例如通过引起粘蛋白蛋白质的蛋白水解)。本文描述的实验中使用的菠萝蛋白酶的商业来源为ChallengeBioproducts Co Ltd。

适应症

本发明的微球可被输送到患者身体中的目标区域以治疗任何疾病或病症，只要包含在微球中的影响粘蛋白的蛋白酶对于该疾病或病症是有效的。当微球暴露于生理条件时，适用于以持续方式使加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶流出的微球可潜在地用于治疗任何涉及粘蛋白疾病，以及尤其是全身输送影响粘蛋白的蛋白酶可构成问题的疾病。

例如，如上所述，菠萝蛋白酶已知在体内和体外具有蛋白水解活性。菠萝蛋白酶还具有抗水肿、消炎、抗血栓形和纤溶活性，并且已经显示出作为抗癌试剂的潜力。然而，由于其全身施用的风险，菠萝蛋白酶还未用作癌症的临床疗法，由于菠萝蛋白酶的纤溶作用和对出血的影响，菠萝蛋白酶的全身施用可构成问题。然而，通过本发明实现的菠萝蛋白酶的局部且持续释放可潜在地在患者身体的目标区域中产生高局部浓度的菠萝蛋白酶，而不存在全身毒性的风险。本发明还具有改进药物向癌症中的渗透的潜力以及对一些化疗试剂的细胞毒性具有协同效果。

例如，本发明可为产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化和慢性阻塞性肺病提供治疗。当影响粘蛋白的蛋白酶具有进一步的治疗活性时，则本发明还可为其他病症提供治疗。例如，在菠萝蛋白酶的情况中，本发明还可为深静脉血栓形成和凝血障碍提供治疗。

影响粘蛋白的蛋白酶引起粘蛋白蛋白质的蛋白水解并且因此在输送到患者身体中的目标区域时会影响(例如通过分解)患者身体中的目标区域处的任何粘蛋白。因此，至少来说，将本发明的微球输送到患者身体中的目标区域(例如产生粘蛋白的肿瘤)会引起该区域中的粘蛋白(例如围绕着肿瘤的粘蛋白)受到影响并且因此提供一定治疗效果(例如目标区域中的质量(mass)下降或改进的循环或消化能力)。进一步地，与粘蛋白未受影响的情形相比，共同施用治疗试剂(例如如将在下文中所描述的)将能够更有效的渗透到目标区域(例如肿瘤)中。如将会被理解地，这是非常有用的治疗效果并且可显著地提高现有治疗方案的功效，潜在地允许使用更低剂量的共同施用的治疗试剂。

本发明可用于治疗产生粘蛋白的癌症。如本文中所使用，术语“产生粘蛋白的”癌症应理解为意指含有粘蛋白的癌症和产生粘蛋白的癌症两者。含有粘蛋白的癌症包括，例如，印戒细胞癌症和杯状细胞癌。粘蛋白还在不被表征(characterised)为印戒或杯状细胞的细胞质中。产生粘蛋白的癌症包括，例如，分泌粘蛋白的类型，比如假性粘液瘤，或过度表达粘蛋白或围绕其细胞(壁)分泌粘蛋白的癌症，该粘蛋白充当化疗渗透的阻隔物并且还阻止免疫细胞识别。

举例而言，产生粘蛋白的癌症包括肺癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌、阑尾癌、腹膜癌、肝细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、间皮癌、神经母细胞瘤、小肠癌、淋巴瘤和白血病。这些癌症中的多种难以用常规疗法治疗。肝细胞癌(原发性肝癌)、肝转移(继发性肝癌)和胰腺癌的治疗是本发明特别优选的应用。本发明的微球还可用于治疗腺癌。特别地，腺癌可为印戒细胞癌。本发明的微球还可用于治疗腹膜假粘液瘤。

肝细胞癌(原发性肝癌)通常由乙型和丙型肝炎感染、任何原因的肝硬化引起，包括酒精类、非酒精类的脂肪性肝炎(NASH)和其他较不常见的诱因。现有的治疗包括肝移植、切除和热消融，但是只有少数人可通过这些潜在的治愈程序进行治疗。大部分患者接受TACE和亚得利亚霉素的微球输送，但是这在反应速率方面受到限制，并且许多患者仍有限地生存。

肝转移(继发性肿瘤)可发生自多种癌症，包括大肠、胃、胰腺和其他腺癌以及来自身体中腹部和其他位置两者的肿瘤。虽然在某些情况中热消融现在可产生类似的结果，但肝切除是最优疗法。全身化疗被广泛使用且结果适中。伊立替康的微球输送已被用作用于大肠来源的肝转移的姑息治疗。

因为在目标位置输送影响粘蛋白的蛋白酶，将本发明的微球通过进药的动脉而输送到患者的肿瘤中(例如在治疗肝癌时，肝动脉)，可提供侵入性显著更低的用于治疗肝肿瘤或胰(腺)肿瘤的程序，其中影响粘蛋白的蛋白酶的持续释放会具有最大效果并且降低与全身输送相关的副作用的风险。

进一步地，一些影响粘蛋白的蛋白酶自身可具有抗癌活性。例如，已经发现菠萝蛋白酶具有针对多种癌症的抗癌活性，包括，例如，胰腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、大肠癌、甲状腺癌、胃癌、阑尾癌、腹膜癌、肝细胞癌、间皮癌、腹膜假粘液瘤和其他腹膜癌、卵巢癌、肺癌、小肠癌以及其他癌症。例如，木瓜蛋白酶，可用于治疗癌症比如肺癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病或其他实体癌症。因此，将本发明的含有菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶的微球输送到产生粘蛋白的肿瘤会影响(例如破坏或分解)围绕肿瘤的粘蛋白并且使得菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶向肿瘤中的更有效的渗透成为可能，其中其抗癌活性应当是更为有效的(尤其是因为其将在一段时间内以持续方式输送)。

腹膜假粘液瘤(PMP)是特征在于在腹腔中过度积累由肿瘤细胞分泌的粘蛋白的形式的肿瘤。虽然结肠、直肠、胃、胆囊、小肠、膀胱、肺、乳腺、胰腺和卵巢的传播的癌症也可导致疾病，但肿瘤细胞主要是阑尾来源的。分泌的粘蛋白物质(mass)在腹腔中积累并且引起消化道内压升高，这与由于营养受损而导致发病率和死亡率显着增加相关。

传统上，开腹手术(移除粘蛋白物质)和细胞减灭术随后是腹腔温热灌注化疗(HIPEC)已经是PMP患者的优选疗法。然而，由于该疾病是渐进性的，在疾病过程期间患者可能需要多次治疗，其结果是发病率增加甚至死亡。

将本发明的微球输送到患者的腹膜中(在腹膜中影响粘蛋白的蛋白酶的持续释放会具有最大效果并且降低与全身输送相关的副作用的风险)，可提供侵入性显著更低的用于移除粘蛋白物质的程序，因为影响粘蛋白的蛋白酶液化了积累的粘蛋白(即，使得身体可易于移除它，或液化的粘蛋白可更易于从腹膜中被吸出)并且还潜在地治疗癌症(例如由于蛋白酶的抗癌活性或共同施用的化疗等)。

本发明可用于治疗囊肿性纤维化和慢性阻塞性肺病。囊肿性纤维化是一种损害肺和消化系统的紊乱。其通过使粘液、汗液和消化液这些流体变得稠且粘，而影响产生粘液、汗液和消化液的细胞，于是它们可堵住(plug up)管、管道和通道。慢性阻塞性肺病(COPD)是一类阻塞空气流动并且使得难以呼吸的肺部疾病(包括肺气肿和慢性支气管炎)。预期局部且持续的输送影响粘蛋白的蛋白酶到患者的肺中可为有效的治疗方案。

在一些实施方式中，除了其影响粘蛋白的性质之外，特定的影响粘蛋白的蛋白酶可具有治疗应用。这样的实施方式的实例将在下文描述。

血块的形成(血栓)是多种严重疾病的基础，比如心肌梗塞、冠状动脉疾病、中风、大规模肺栓塞和急性肢体缺血。罹患血栓形成的可能性在安装了支架的患者中可能得到提高。抗凝药物(比如肝素(heparin)和华法林(warfarin))可用于治疗血栓形成。然而，这样的抗凝剂仅抑制血栓的形成或抑制现有血栓的生长。一些证据显示蛋白酶在施用至患者时可一般地降低血液凝结。例如，在蛋白酶比如菠萝蛋白酶的情况中，这样的治疗效果有据可查。因此，在本发明包含菠萝蛋白酶(至少)的实施方式中，微球可用于治疗多种病症，比如深静脉血栓形成、凝血障碍、血友病、心肌梗塞、冠状动脉疾病、中风、大规模肺栓塞和急性肢体缺血、支架相关的血栓形成或关节积血。与以上描述的类似，将菠萝蛋白酶局部输送到患者身体中的相关区域与全身输送菠萝蛋白酶相比的可为显著地更有效的并且涉及更少的副作用。

进一步地，当影响粘蛋白的蛋白酶与其他治疗有效的试剂组合使用时，可获得协同效果。例如，当菠萝蛋白酶与其他粘液溶解试剂(如将在下面进一步详细描述的)组合使用时，本发明的所述微球在治疗其他涉及粘蛋白的疾病(比如胶耳、痰滞留、胸部感染和粘液和与胆道/胰支架相关的细胞碎片)中甚至可为更有效的。

还如本文所述，使用影响粘蛋白的蛋白酶比如菠萝蛋白酶例如与一种或多种其他化疗试剂组合使用，也可产生协同效果，其中菠萝蛋白酶(例如)促进化疗试剂(一种或多种)进入到(或更深地进入)肿瘤中。如可以理解的，这样的机制具有改进化疗试剂(一种或多种)的功效的潜力，并且潜在地以更低的剂量。

微球

本发明的微球可采取任何合适的形式并且可从任何合适的可生物相容的物质或多种物质的组合形成，条件是影响粘蛋白的蛋白酶可被加载在其中(并且被包含与治疗相关的一段时间而不显著地负面影响其活性)、可被输送到患者身体中的目标区域并且在暴露于生理条件时(即一旦处于目标区域)以持续方式使蛋白酶流出。

可使用任何合适的机制使微球将影响粘蛋白的蛋白酶保留在其中。在一些实施方式中，例如，微球中的化学电荷或官能团可足以保留蛋白酶。替代地(或此外)，位阻效果(例如孔径)可足以将蛋白酶保留在微球中直到暴露于生理条件。类似地，可使用任何合适的机制，使所述微球将影响粘蛋白的蛋白酶流出。在一些实施方式中，例如，在生理条件下蛋白酶可从微球的孔中排出(leech out)。在一些实施方式中，在生理条件下，所述微球自身可为可生物降解的，其中蛋白酶随着微球降解而以持续的速率释放。在一些实施方式中，微球暴露于生理条件可引起化学因素(例如微球中的化学电荷或官能团)改变使得微球不再保留蛋白酶使得蛋白酶以持续的速率释放。在一些实施方式中，微球暴露于生理条件可引起微球的孔变大使得蛋白酶以持续的速率释放。

基于前段所述的因素和本文包含的教导，发明人相信可合理预测特定微球是否可与特定的影响粘蛋白的蛋白酶一起用于本发明。可进行常规实验，比如以下描述的那些(相应地调整)，以确认该预测。

例如，微球可包含其中可加载蛋白酶的基体。在合适条件下使微球和影响粘蛋白的蛋白酶彼此接触(例如以下描述的)导致蛋白酶变为并入到基体中并且因此加载到微球中。

虽然发明人设想微球通常会从商业渠道购买(其已经批准用于人类的治疗用途)，但微球也可能由包含蛋白酶的组合物形成。在这样的实施方式中，基体会围绕着酶而形成，这可提供酶在整个如此形成的微球中更均匀的分散并且导致在目标位置处酶从微球中更持久的持续释放。

例如，微球可包含其中可加载影响粘蛋白的蛋白酶的水凝胶(或由该水凝胶所界定)。一种合适的水凝胶是聚乙烯醇(PVA)水凝胶。由PVA水凝胶形成的并且发明人试用的特定微球是市售的可生物相容的聚乙烯醇(PVA)水凝胶微球，由Biocompatibles UK Ltd以DC

另一种合适的水凝胶为聚(乙烯醇-共-丙烯酸钠)水凝胶。由聚(乙烯醇-共-丙烯酸钠)水凝胶形成的并且发明人试用的特定微球为以商品名HepaSphere

另一种合适的水凝胶为由聚(甲基丙烯酸)钠组成的水凝胶核和聚(双[三氟乙氧基]磷腈)的外壳。由该水凝胶形成的并且发明人试用的特定的微球为由BostonScientific以商品名Embozene TANDEM

如上所述，然而，描述为可加载到DC

发明人知晓的且相信可适用于本发明的其他市售的微球包括由Terumo EuropeNV以商品名LifePearl出售的那些。这些微球由聚(乙二醇)和3-磺基丙基丙烯酸酯的水凝胶网络组成。发明人还相信由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚乳酸(PLLA)水凝胶网络形成的微球将会适合用于本发明。

在一些实施方式中，微球可包含外包覆层，其中这样的包覆层可赋予微球有益的性质。例如，用这样的包覆层包覆微球可为有益的：所述包覆层在蛋白酶可开始流出之前，必须首先被溶解(或被去除)。例如，以此方式，在输送后在酶开始流出之前，所述微球有时间到达肿瘤位置(例如)。用在输送后保护微球并且直到达到合适的生理条件(例如目标区域处的pH和离子浓度)之时的包覆层包覆微球也可为有益的。

例如，发明人已发现包含藻酸盐外包覆层的微球在暴露于生理条件之后可延缓蛋白酶持续释放的开始。其他包覆试剂，比如包含壳聚糖的那些，也可用于本发明。

发明人还预期玻璃、树脂和陶瓷微球在本发明中也可利用。例如，以商品名Thera

在一些实施方式中，设想到不同的微球可被组合用于共同施用给患者。不同的微球可含有相同或不同的影响粘蛋白的蛋白酶或，事实上，任何其他活性试剂，比如以下描述的那些。不同的微球可在其尺寸、其尺寸分布和/或组成上不同。

为了可用于本发明，所述微球应理想地大致为球形并且尺寸在微米范围内。例如，球形微球适合用于栓塞，因为它们在通过血管输送时流动阻力较小。进一步地，具有一定尺寸的球形颗粒可在特定的体积内提供更高密度的颗粒。

微球可具有微球范围(以及直径测量)内的任意尺寸，其中可用于特定应用中的微球的尺寸取决于以下因素，比如加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶的性质和量(例如较大量的蛋白酶会需要较大量的微球)，所述微球输送到患者体内的路径(例如在与栓塞相关的治疗中，待发生栓塞处的血管的尺寸将决定微球必要的尺寸)。可以理解，一批微球中总是存在一定范围的直径。

在一些实施方式中，例如，虽然最高达刚好低于1000μm的直径可适宜用于腹膜输送和应用，但所述微球的直径可在约30和约700μm之间。在一些实施方式中，例如，所述微球的直径可在约30和约500μm之间，约50和约400μm之间，约60和约300μm之间，约80和约200μm之间，约60和约100μm之间，约50和约100μm之间，约40和约80μm之间，约30和约60μm之间，约30和约50μm之间或约40和约100μm之间。在一些实施方式中，例如，所述微球的直径可为约700μm，约600μm，约500μm，约400μm，约300μm，约200μm，约100μm，约80μm，约70μm，约60μm，约50μm，约40μm或约30μm。

一般来说，较大的微球对于通过体腔内路径输送会是更有用的(例如以腹腔内方式，来治疗PMP或其他腹膜癌)，其中较大量的影响粘蛋白的蛋白酶(以及潜在地其他活性试剂)会是有益的。较小的微球一般地在动脉内输送路径中是更有用的，其中它们可流动通过动脉直到它们在目标区域处栓塞。

本发明的微球适用于使得影响粘蛋白的蛋白酶在输送到目标区域时以持续方式流出。蛋白酶流出的机制是不重要的，只要流出是以持续的速率进行的。如上所述，所述微球可例如包括许多孔，酶可通过其中流出。在一些实施方式中，在生理条件下微球自身可降解，由此使得加载的蛋白酶暴露。

如本文中所使用，短语“以持续方式”应理解为意指包含在微球内的影响粘蛋白的蛋白酶(一种或多种)在对治疗有益的时间长度内流出。尽管总会出现“突释”(其中在微球首先暴露于生理条件时一定比例的加载的蛋白酶快速流出)，但是蛋白酶流出速率随后减慢使得剩余的包含在微球中的蛋白酶在几个小时、几天或甚至几周的时间内流出。蛋白酶的释放速率不需要在整个流出期间都是一致的。

取决于特定的应用，蛋白酶从微球中流出的速率以及时间段可变化。然而，典型地，蛋白酶应理想地释放至少与目标区域中的细胞复制所花费的时间一样长的时间。以此方式，蛋白酶(以及包含在微球内的任何其他活性试剂)可存在以抑制细胞复制，导致细胞死亡。

通常还有必要考虑输送到目标区域和流出之后蛋白酶将被清除的速率。例如，如果输送到具有相对高的血流量的区域，将预期蛋白酶会比具有相对低的血流量的区域的情况中更快地被清除(然而，注意到流量可显著地受到栓塞阻碍)。考虑到这一点，蛋白酶从微球中的释放速率可能需要被适应化。

在一个具体的实施方式中，例如，影响粘蛋白的蛋白酶可以持续方式从微球中在输送到目标区域后并且在最高达约120小时或可能甚至更长的时间段内释放。在一些实施方式中，例如，影响粘蛋白的蛋白酶可从微球中在约10小时至约120小时之间、约20小时至约100小时之间、约30小时至约80小时之间、约10小时至约50小时之间、约15小时至约40小时之间、约10小时至约30小时之间或约10小时至约20小时之间的时间段内释放。

本发明的微球可(受加载和尺寸限制)含有任何量的可为相关病症提供治疗效果的影响粘蛋白的蛋白酶。能够加载在特定的微球中的蛋白酶的量通常会需要基于个案凭经验确定，其释放曲线也是如此。最初加载到微球中的以及随后输送到患者身体中的影响粘蛋白的蛋白酶的量将取决于多种因素，包括被治疗的病症的性质、蛋白酶的持续释放速率和需要释放蛋白酶的时间段。

在一些实施方式中，可能需要输送相对较大量的微球以获得蛋白酶的特定释放曲线和/或输送的蛋白酶的量。例如，在菠萝蛋白酶的情况中，直径为300-500μm的微球可在60μL的微球中加载有高达约1800μg菠萝蛋白酶。例如，为了用菠萝蛋白酶治疗某局部区域内的肿瘤，肿瘤的特性和尺寸将是影响需要的加载菠萝蛋白酶的微球的量的主要因素。

本发明的微球能够被输送到患者身体中的目标区域。可在本发明中使用任何输送方法，通过该输送方法微球基本上完好无损地到达目标区域并且损失尽可能少的其中包含的影响粘蛋白的蛋白酶(等)。

典型地，所述微球适用于局部地输送到目标区域(这将主要取决于待被治疗的紊乱)。这样的局部输送确保了最大数量的微球(以及因此影响粘蛋白的蛋白酶)被输送到身体中需要它们的区域，这将使得治疗的功效最大化并且使得其潜在的副作用最小化。例如，微球可适用于以动脉内的方式、以病灶内的方式、以腹部内的方式或以体腔内的方式(例如到患者的腹膜或胸膜腔内)输送到患者。其他体腔内输送路径包括鼻内和支气管内(如果治疗囊肿性纤维化等，其可为有用的)、膀胱腔内或胆管内(例如用于胆管癌)。

患者身体中的目标区域可为肿瘤。肿瘤可例如位于患者的腹部中(例如在其胰腺、肝脏、结肠、卵巢或前列腺中)。肿瘤可例如位于患者的肺中。类似于以上描述的经动脉化疗栓塞(TACE)方法，所述微球可被施用到为这样的肿瘤供血的血管中以实现在持续的时间段内高局部浓度的影响粘蛋白的蛋白酶。如果持续释放甚至更长的时间段将对治疗是有益的，则可输送后续剂量的微球。

替代地，如果要治疗腹膜假粘液瘤或其他腹膜癌，可通过腹膜内注射来输送本发明的所述微球。如上所述，可将较大的微球输送到体腔(比如患者的腹膜)中，意味着可施用较大剂量的蛋白酶(等)。

替代地，在治疗血栓比如深静脉血栓形成时，可通过在血栓位置处注射来输送本发明的所述微球。

本发明的微球适用于在暴露于生理条件时以持续方式使蛋白酶流出。如将会理解地，不同的施用方案会导致微球被输送到患者身体的不同部位中(例如动脉中或体腔中)，这可使其暴露于不同的生理条件。例如，虽然整个患者身体的温度可能会合理地保持一致，但在患者的动脉和体腔之间的pH和电解质浓度(例如)可为不同的。评估这些参数(如果需要，通过预测试)以相应地使本发明的微球适应化是在本领域技术人员的能力范围内的。

其他试剂

虽然其自身就是有效的(即如上所述地，由于其对涉及粘蛋白的疾病的效果)，但是包含在本发明的微球内的影响粘蛋白的蛋白酶也可与其他试剂组合使用。这样的其他试剂的实例在以下描述。当需要时(或有益时)，这样的其他试剂的量可基于需要使用常规试验和实验确定。

微球自身可含有除了影响粘蛋白的蛋白酶(即共同加载蛋白酶和其他试剂)以外的其他试剂。替代地，可将与微球相组合的(一起或分开施用(例如依次地，以任意顺序)并且通过相同或不同的路径)其他试剂输送到患者(并且因此输送到目标区域)。其他试剂可例如存在于微球的载体中，化学结合到微球表面。替代地，或此外，其他试剂可包含在与含有影响粘蛋白的蛋白酶的微球分开的微球中，其中两组微球组合输送到患者(先、后或同时地)。例如，局部输送到肿瘤的含有影响粘蛋白的蛋白酶(比如菠萝蛋白酶)的微球还可与全身化疗方案(即其中化疗试剂以口服或静脉内方式输送)结合。在一些实施方式中，可在输送微球之前、期间或之后全身输送(例如口服或IV)其他试剂。

例如，其他试剂可选自化疗试剂、放疗试剂、其他粘液溶解试剂和造影试剂(contrast agent)中的一种或多种。这些其他试剂的每一种将在下面更详细地描述。

化疗试剂是用于治疗癌症的药理试剂。可用于本发明上下文中的化疗试剂的实例列于WO2014/094041中，其内容通过引用并入本文。可用于本发明的具体的化疗试剂可例如包括吉西他滨、紫杉醇、多细紫杉醇、亚得利亚霉素、伊立替康、丝裂霉素C、奥沙利铂、卡铂、5-氟尿嘧啶(或类似物)和/或顺铂。发明人先前已经描述了当这些化疗试剂中的一些与菠萝蛋白酶和粘液溶解试剂共同施用时观察到的理想的协同效果，并且设想了这些效果还可用于本发明中。特别地，发明人已观察到亚得利亚霉素、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、紫杉醇、紫杉醇(Taxol)、奥沙利铂和顺铂全部都表现出与菠萝蛋白酶的协同性质。

例如，如上所述，以动脉内的方式施用微球中的菠萝蛋白酶预期提高化疗的功效，无论化疗试剂(一种或多种)是全身输送的、在相同的球中共同加载的，或是在分开的球中共同加载的(同时或依次地施用)。发明人相信将菠萝蛋白酶添加到在目标区域处输送的微球会提供肝细胞癌或原发性肝癌、肝转移和胰腺癌的替代治疗并且可潜在地提高亚得利亚霉素和其他化疗的抗肿瘤效果。

放疗试剂还可与含有影响粘蛋白的蛋白酶的微球共同输送，例如，为了显示输送的位置和/或为了提高影响粘蛋白的蛋白酶的功效。例如，菠萝蛋白酶是已知的PARP抑制剂并且其与辐射的共同施用可阻碍受辐射损害的DNA的修复，造成局部的细胞死亡。

虽然放疗试剂可能理论上被共同加载到带有蛋白酶的微球中，但需要建立的是这样做不会引起对蛋白酶的损害并且影响其治疗活性。更可能地，放疗试剂将与含有蛋白酶的微球分开地输送到患者，其中将使得对影响粘蛋白的蛋白酶的任何辐射损害最小化。

例如，放疗试剂可分开地在玻璃、树脂或陶瓷球中提供，比如以商品名Quirem

如上所述，粘液溶解试剂影响(例如提高破坏或溶解等)粘液并且目前用于帮助缓解呼吸困难。虽然影响粘蛋白的蛋白酶是一类粘液溶解试剂，但在本发明的上下文中，本文中描述的粘液溶解试剂被定义为非酶试剂，其与影响粘蛋白的蛋白酶不同。这样的粘液溶解试剂与影响粘蛋白的蛋白酶的组合可提供多种优点，在本文中对其中的一些进行描述。

在WO2014/094041中，本发明人中的一些描述了当与粘液溶解试剂(比如N-乙酰半胱氨酸)和化疗试剂结合施用时菠萝蛋白酶的有益效果。发现菠萝蛋白酶和粘液溶解试剂的组合显著地提高了化疗试剂在产生粘蛋白的癌细胞中的细胞毒性效果，以具有直接抗肿瘤效果和对癌细胞的生存能力和生长的抑制效果，以深刻影响肿瘤粘蛋白生产，并且在液化肿瘤粘蛋白方面是极其有效的。菠萝蛋白酶的益处包括化疗向癌细胞中的提高的渗透、化疗向肿瘤基质中的提高的渗透以及与某些化疗试剂的协同作用。菠萝蛋白酶还具有肿瘤进入优势，尤其是在具有纤维包覆物的肿瘤中或在被粘连包围的肿瘤中。

在WO2017/063023中(其内容通过引用并入本文)，本发明人中的一些描述了菠萝蛋白酶与粘液溶解试剂半胱胺(或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药)结合的令人惊奇且预料不到的协同效果。在治疗固体或硬肿瘤时，这样的组合发现是非常有效的。

在本发明的所述微球含有粘液溶解试剂时，在治疗涉及粘蛋白的疾病比如产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、胶耳、囊肿性纤维化、痰滞留、胸部感染和粘液以及与胆管/胰支架相关的细胞碎片，以及涉及血栓的疾病比如血友病、心肌梗死、冠状动脉疾病、中风、大规模肺栓塞和急性肢体缺血、支架相关的血栓形成或关节积血(如上所述)时，本发明的所述微球可为甚至更有效的。虽然这些病症可单独使用影响粘蛋白的蛋白酶治疗，但是治疗的功效可通过共同施用进一步的粘液溶解试剂而改进。

例如，粘液溶解试剂可为减少或破坏粘蛋白中的二硫键的含有硫醇的粘液溶解试剂。粘液溶解试剂的具体实例包括N-乙酰半胱氨酸("NAC")、半胱胺、N-乙酰半胱氨酸赖氨酸盐(nacystelyn)、巯基乙磺酸盐、羧甲司坦(carbocysteine)、N-acystelyn、厄多司坦、阿法链道酶、凝溶胶蛋白、胸腺素P4、葡萄聚糖和肝素。NAC还是抗氧化剂和抗遗传毒性试剂并且在人类患者中其长期高剂量使用的安全性已确立，主要用于呼吸类疾病。其他粘液溶解试剂描述在WO2014/094041和WO2017/063023中，并且通过引用并入在此本文。

造影试剂也可包含在微球中，例如如果能够检测输送后微球的位置是有利的，或如果确定施用的正确位置是有利的。这种荧光可以帮助视觉上识别正确的位置并有助于剂量分布。

形成微球的方法

本发明还提供了将影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的方法。所述方法包括：将微球添加至具有酸性pH和任选地与患者身体中的目标区域处的离子强度类似的离子强度的溶液；将包含微球的溶液与包含影响粘蛋白的蛋白酶的溶液混合；和将混合物搅动足以将影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的时间。

发明人已经发现将影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的pH可影响加载的量并且因此可影响酶在暴露于生理条件时的释放速率。例如，在菠萝蛋白酶的情况中，已经发现降低pH引起向微球中更好的加载和在输送到目标区域后更慢的释放。不希望被理论所束缚，发明人推测该效应可能是由于菠萝蛋白酶上的净电荷在较低的pH下增多和/或降低pH影响孔径并且因此影响微球的释放模式。

发明人的初步实验表明在此方面，以低至2或2.5的pH的菠萝蛋白酶形式加载影响粘蛋白的蛋白酶可为有益的。

类似地，发明人已经发现将影响粘蛋白的蛋白酶加载到微球中的加载介质可因此影响在暴露于生理条件时酶的释放速率。

作为一般规则，发明人已经发现具有酸性pH和类似于患者身体中的目标区域处所预期的离子浓度的加载介质产生了向微球中的良好加载和随后以持续的速率释放。将菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶加载到特定微球中的具体实例更详细的描述在实施例中。

药物组合物

本发明还提供了药物组合物，其包含：

用于输送到患者身体中的目标区域的微球(例如以上描述的微球)，所述微球含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶并且适用于在暴露于生理条件时以持续方式使蛋白酶流出；和

药学上可接受的载体。

用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体将取决于组合物使用的途径。液体形式的制剂可包括溶液、悬浮液和乳液，例如用于肠胃外注射或腹膜内施用或注射的水或水-丙二醇溶液。用于本发明的药物组合物中的合适的药学上可接受的载体包括生理缓冲盐溶液、葡萄糖溶液和林格溶液等。

包括本发明的微球的液体形式的制剂和气溶胶制剂还可用于鼻腔内施用，例如治疗囊肿性纤维化。适合吸入的气溶胶制剂可例如包括溶液和粉末形式的固体，其可与药学上可接受的载体(比如惰性压缩气体，例如氮气)组合。

适合输送到患者的药物组合物可刚好在输送到患者身体中之前制备，或可预先准备并事先适当存储。

本发明的药物组合物和药剂可包含药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂和/或稀释剂。载体、稀释剂、赋形剂和佐剂必须在可与组合物或药剂的其他成分和输送方法是相容的方面是"可接受的"，并且通常不会对其接收者有害。在一些实施方式中可为适合使用的药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例为：去离子水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，比如花生油(peanut oil)，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油；芝麻油，比如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油，食用花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，比如甲基聚硅氧烷，苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷(methylphenyl polysolpoxane)；挥发性有机硅；矿物油，比如液体石蜡，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，比如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，比如棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮；琼脂；黄蓍胶或金合欢胶(gum acacia)，和凡士林。典型地，一种或多种载体将形成组合物或药剂的约10重量％至约99.9重量％。

应理解，在合适情况下，微球或本发明的药物组合物中的一些组分还可以代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的形式提供。

本发明的微球中的组分的"代谢物"指的是代谢的中间体和产物。

"药学上可接受的"，比如药学上可接受的载体、赋形剂等，意指对被施用特定的化合物的个体而言是药理上可接受的且基本上无毒的。

药学上可接受的盐"指的是常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留了组分的生物有效性和性质，并由合适的无毒的有机或无机酸或有机或无机碱形成。样品酸加成盐包括衍生自无机酸的那些，比如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸，和衍生自有机酸的那些，比如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。样品碱加成盐包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物的那些，例如，氢氧化四甲铵。药物化合物(即药物)的化学改性为盐是药物化学家熟知的一种技术，用于获得改进的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动能力和溶解性。参见，例如，H.Ansel等，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems(第6版，1995)第196和14561457页，通过引用将其并入本文。

还考虑本发明的微球或药物组合物中的一些组分的"前药"和"溶剂化物"。术语"前药"意指在体内转化产生本发明所需的化合物或其代谢物、其药学上可接受的盐或溶剂化物的化合物(例如，药物前体)。这种转化可通过各种机制发生(例如，通过代谢或化学过程)。使用前药的讨论提供在T.Higuchi和W.Stella的"Prodrugs as Novel DeliverySystems,"A.C.S.Symposium Series的第14卷中，和在Bioreversible Carriers in DrugDesign，ed.Edward B.Roche，American Pharmaceutical Association and PergamonPress，1987中。

治疗方法

本发明还提供了治疗涉及粘蛋白(影响粘蛋白的蛋白酶对其具有治疗相关活性)的疾病和病症的方法。例如，菠萝蛋白酶对治疗产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病、深静脉血栓形成和凝血障碍具有治疗相关活性。进一步地，共同施用菠萝蛋白酶与其他化疗试剂使得这些试剂能够更容易地渗透到肿瘤中并且因此是更加有效的。木瓜蛋白酶对治疗一些产生粘蛋白的癌症和其他病症具有治疗相关活性。其他对粘蛋白有效的蛋白酶会预期具有类似的活性，并且通过将其以本文中描述的局部且持续的方式输送可获得优点(例如克服或改善与其全身输送相关的问题)。

本发明提供了治疗患者的产生粘蛋白的癌症、腹膜假粘液瘤、囊肿性纤维化和慢性阻塞性肺病(其中如上所述，取决于微球中的蛋白酶，可治疗其他疾病或病症)的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的含有加载在其中的影响粘蛋白的蛋白酶的微球(例如以上描述的微球)，其中微球适用于在施用之后以持续方式释放蛋白酶。

如上所述，菠萝蛋白酶有许多治疗益处，包括抗癌活性，但是，当全身施用时，其副作用至今阻碍其进行临床试验。然而，含有菠萝蛋白酶的微球可特定地针对需要治疗的身体区域，其中局部输送相对少量的菠萝蛋白酶(与全身施用所需要的量相比)可能显著地减少那些副作用。如上所述，含有菠萝蛋白酶的微球可有效治疗的癌症包括具有良好的供血的癌症，比如肝细胞癌、胰腺癌和大肠癌。

所述方法可包括动脉内输送微球，其中微球通过一个导管进行注射，该导管已预先放置在尽可能靠近为肿瘤供血的血管的位置(以避免阻塞通往其他地方的血管)。以此方式，所述微球将被直接带到(或非常接近于)肿瘤中，在此处栓塞的微球会以持续的速率释放菠萝蛋白酶(或其他影响粘蛋白的蛋白酶)。这样的方法类似于在以上所示的目前在经动脉化疗栓塞(TACE)方法中进行的方法。

将加载的微球直接注射到肿瘤中(病灶内注射)也可为有用的输送方法。以此方式，处于治疗有效剂量的相对大量的影响粘蛋白的蛋白酶可被直接输送到肿瘤，使其功效最大化而使得与针对性较低的输送模式相关的副作用的风险最小化。

所述方法还可包括将微球体腔内输送到患者的体腔中(例如到腹膜或胸膜腔中)。如上所述，这样的方法对于治疗腹膜假粘液瘤或其他腹膜癌或涉及肺或胸膜的癌症将是尤其有用的。微球或药物组合物还可通过包括脊柱内、皮下或肌内注射的路径施用到接受者。

如本文中所使用的术语"治疗有效量"在其含义内包括一种无毒但足以用于本发明的药剂或组合物以提供所需的治疗效果的量。所需的确切量因个体而异，取决于以下因素，比如，所治疗的种类、个体的年龄和一般状况、所治疗的病症的严重程度、施用的特定试剂、施用模式等。因此，不可能规定对所有实施方式都适用的确切的"有效量"。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可仅使用常规实验来确定合适的"有效量"。

一般来说，本发明的所述微球和药物组合物可以可与接受者的施用途径和物理特性(包括健康状态)相容的方式和以引发所需的效果(一种或多种)的方式施用。例如，适当的剂量可取决于多种因素，包括但不限于，个体的物理性质(例如年龄、体重、性别)，该试剂、组合物或药剂是否被作为单一试剂使用或作为佐剂疗法使用，被治疗的疾病或病症的进展(即病理状态)，和对本领域普通技术人员显而易见的其他因素。在确定试剂、组合物和药剂的适当剂量时，各种一般考虑描述在例如Gennaro等(Eds)，(1990)，"Remington'sPharmaceutical Sciences"，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania，USA；和Gilman等，(Eds)，(1990)，"Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases ofTherapeutics"，Pergamon Press中。

一般可以有效实现期望目的的量施用微球。更具体地，其可以治疗有效量施用，这意味着有效防止目标疾病或病症的发展或减轻其现有症状的量。有效量的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，给定的微球的治疗有效剂量最初可从细胞培养分析中估算。例如，可在动物模型中制定剂量以达到循环浓度范围(包括细胞培养中确定的ICSO)。此类信息可用于更准确地确定对人类和其他哺乳动物个体的有用剂量。

一般来说，本发明的所述微球可以发生治疗效果的任何量施用到患者。治疗效果的性质将取决于多种因素，比如被治疗的粘蛋白相关的疾病或病症以及施用的影响粘蛋白的蛋白酶。例如，在治疗肿瘤时，发明人相信确定合适的剂量时，更应该考虑例如肿瘤的体积的因素而不是体重因素。例如，胰腺肿瘤的平均尺寸估计是约20cm

典型地，在治疗应用中，治疗可针对疾病状态或病症的持续。进一步地，对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，单个剂量的最佳量和间隔可通过被治疗的疾病状态或病症的性质和程度、施用的形式、途径和位置以及被治疗的特定个体的性质确定。最佳剂量可使用常规技术确定。对于本领域的普通技术人员来说，可使用常规的治疗过程确定试验来确定最佳的施用过程。

当两种或更多种实体(例如试剂或药剂)"结合(地)"施用到个体时，它们可同时在单一组合物中施用，或同时在分开的组合物中施用，或在时间上分开的(彼此之间先后地)分开的组合物中施用。

本发明的某些实施方式可例如涉及以多个分开的剂量施用微球或药物组合物。相应地，本文中描述的用于治疗的疗法涵盖在限定的时间段内对个体施用多个分开剂量。在一些实施方式中，所述方法可包括施用初始剂量，随后可能是加强剂量。在一些实施方式中，所述微球或药物组合物可施用至少一次、两次、三次或更多次。

治疗有效剂量指的是减轻症状和/或延长受治疗个体的生存所需要的微球(和影响粘蛋白的蛋白酶)的量。酶的毒性和治疗功效等可通过细胞培养和/或实验动物中的标准药物分析来确定(例如通过测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体有效治疗的剂量))。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可表示为LD50和ED50之间的比率。表现出高治疗指数的试剂、组合物和药剂是优选的。从此类细胞培养分析和/或动物研究中获得的数据可用于制定用于人类或其他哺乳动物的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED50的具有毒性很小或无毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。个体医师可根据个体状况而容易选择确切的制剂、施用途径和剂量(参见，例如，Fingl等，(1975)，在"The Pharmacological Basis ofTherapeutics"，Ch.1p.1中，其通过引用并入本文)。

本发明可用于治疗任何合适的患者或个体。在一些实施方式中，该患者是哺乳类个体。典型地，患者将是人类患者，虽然其他个体也可以从本发明中受益。例如，个体可能是小鼠、大鼠、狗、猫、牛、羊、马或其他任何具有社会、经济或研究重要性的哺乳动物。

实验结果

现在将描述，发明人实施的实验证明了菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶形式的影响粘蛋白的蛋白酶可加载到市售的微球中并且随后在暴露于生理条件时以持续方式流出。

使用以商品名DC

用分别含有3、5和10mg/ml菠萝蛋白酶的三种溶液在室温(23℃)下伴随剧烈搅动培育100μl的PVA水凝胶珠(DC

在该分析之后，将各批加载的珠在蒸馏水中轻轻洗涤并且随后在37℃下释放到5ml的蒸馏水溶液中。定期移出250μl的各溶液以使用偶氮酪蛋白分析来进行分析以确定已从珠中释放出的菠萝蛋白酶的量，其中用新的蒸馏水替换移出的体积。该分析的结果示于列在下面的表1和图1中。

表1:

图1:

可以看出，一旦已发生最初的突释，则观察到剩余的菠萝蛋白酶从微球中更持续地释放，尤其是具有较低的菠萝蛋白酶浓度的微球。这些结果教导了多少菠萝蛋白酶可被加载到DC Beads中，和较高的加载增大了突释。

类似于实验1，用200μl的在蒸馏水中含有1.0mg/ml或3.0mg/ml菠萝蛋白酶的菠萝蛋白酶溶液在室温(23℃)下伴随搅动培育60μl的PVA水凝胶珠(DC

将珠从200μl的菠萝蛋白酶溶液中移出，洗涤并且然后添加至5ml的pH 7.0的蒸馏水，随即开始流出。按照实验1，定期移出250μl的该溶液用于菠萝蛋白酶分析，其中用新的蒸馏水替换移出的体积。该分析的结果示于列在下面的表2和图2中。

使用在开始30分钟后菠萝蛋白酶随时间的线性增加(图形化)来计算菠萝蛋白酶释放速率。在这些实验中，发现突释相对较低，可能是因为在被释放到蒸馏水之前，珠已被洗涤。

表2:

图2:

实验1和2中描述的实验结果证明了可将相对大量的菠萝蛋白酶加载到尺寸不同的DC Beads中，并且随后以持续方式释放(尽管在最初的突释后)。

使用以下方法将菠萝蛋白酶加载到DC

然后，以以下方式使如此加载的菠萝蛋白酶从DC

图3:

从以上所示图3中可以看出，菠萝蛋白酶从珠中释放了几乎77小时，在此之后不存在由偶氮酪蛋白分析所分析得到的蛋白水解活性。这可表明剩余的菠萝蛋白酶被锁定在水凝胶珠内，或菠萝蛋白酶仍在被释放，但是它已经丧失了蛋白水解活性，这可能是因为它处于37℃超过了76小时或由于搅动。尽管如此，菠萝蛋白酶对热是相对敏感的，并且将蛋白水解活性在37℃下保持几乎80小时对于发明人而言是令人惊讶的。

在此时间段内，约37％(66μg)的加载到微球中的菠萝蛋白酶以活性形式(即具有蛋白水解活性)释放。

对3.0mg/ml菠萝蛋白酶溶液进行类似的程序，其中将60μl的DC

图4:

可以看出，当将60μl的DC

将80μL的DC

图5:

从图5中可以看出，实现了木瓜蛋白酶的持续释放并且持续超过16小时。

随后，进行实验以确定从珠中释放的木瓜蛋白酶的功效。在这些实验中，将HT29细胞(人类大肠癌细胞系)接种在24孔板中。在24小时之后，用在Transwell腔室中的5mg/ml木瓜蛋白酶(500μg/80μl珠)加载的珠对板进行处理。每隔3小时，将含有珠的Transwell腔室转移到新的孔中。该过程持续最高达3天。这些实验显示从DC Beads中释放的木瓜蛋白酶保持了其蛋白水解活性，导致在3小时后Transwell腔室中的全部细胞死亡。

输送到肿瘤的体内初始药物浓度主要取决于肿瘤的尺寸，而体液中随后的药物浓度取决于身体体积(身体质量)。来自患者身体中的各个目标区域的药物清除率将取决于灌注(供血)，这是器官特有的。以下描述的模型(图6.0、6.1、6.2、6.3和表3)意在提供在流体中的菠萝蛋白酶的初始释放及其随后的清除率这两者的指示。

图6.0-释放到20ml PBS中，样品大小250μL：

将81.0μg的菠萝蛋白酶以类似于先前描述的方式加载到60μl的PVA(100-300μm)珠。然后将珠添加到20mL的PBS(pH 7.4，37℃)中并且测量随时间流出的菠萝蛋白酶的量。与较早的实验相似，在多个时间点取出250μl的样本用于分析菠萝蛋白酶含量，其中添加相同体积的PBS以保持流出介质的体积，从以上所列的图(图6.0)中可以看出，菠萝蛋白酶向20ml的PBS(pH 7.4)中的释放在第一个1/2小时内表现出突释30μg，此后在28小时的时间段内观察到逐步释放(dx/dt)＝1.78μg/hr。

图6.1-释放到5ml PBS中，样品大小250μL：

将相同的加载的珠添加到5mL的PBS(pH 7.4，37℃)并且测量随时间流出的菠萝蛋白酶的量，结果示于图6.1中。可以看出，在第一个30分钟内，释放了8μg(突释)，此后在37小时内存在缓慢释放(图的线性部分)。Dx/dt＝58/37＝1.57μg/hr。

在此模型中(即如图6.1所示)，释放介质(PBS pH 7.4)为仅5.0ml并且因此与之前模型中使用4倍体积的该模型(图7.0)相比，初始突释显著地较小。这表明在释放介质体积降低时，突释流出的菠萝蛋白酶的量降低。

将相同的加载的珠添加到20mL的PBS(pH 7.4，37℃)并且采样以测定随时间流出的菠萝蛋白酶的量。然而，在这些实验中，样品大小为500μL，而不是250μL，以模拟具有比之前实验中更高的药物流量/清除率的患者身体中的目标区域。从图6.2(下方)中可以看出，在这些实验中，dx/dt＝2.45μg/hr并且在23小时内，全部81μg的加载的菠萝蛋白酶都从60ul的PVA珠中释放。

图6.2-释放到20ml PBS中，样品大小500μL：

图6.3-释放到5ml PBS中，样品大小1ml：

在这一系列实验的最后，将相同的加载的珠加载到20mL的PBS(pH7.4，37℃)并且采样以测定随时间流出的菠萝蛋白酶的量。然而，在这些实验中，样品大小为1mL，而不是500μL或250μL，以模拟具有甚至更高的药物流量/清除率的患者身体中的目标区域。这些实验的结果示于以上图6.3中。可以看出，与全部所使用的其他释放模型相比，其具有最高的采样体积(代表高流量/清除)以及因此在17小时内，全部释放81μg的加载的菠萝蛋白酶(dx/dt＝4.5μg/hr)。

表3：图6.0、6.1、6.2和6.3的总结

图7:

在体内，释放速率体积的选择将取决于多个因素，包括身体体积、代谢速率、器官灌注、pH、输送珠的位置等。体内流出的影响粘蛋白的蛋白酶的清除率将是确定合适的剂量方案的重要因素。已进行此处描述的实验以模拟目标区域处提高的流量和证明释放体积的选择会影响初始爆发幅度，并且采样体积(即体内清除率)会影响随后的释放速率(见图7)。

在这些实验中，用具有2.5、3.4和4.0的不同pH水平的菠萝蛋白酶溶液对DC

图8：

表4:

该实验表明加载溶液的pH对菠萝蛋白酶释放的突释和随后的速率确实有影响。虽然在全部三种pH水平下的加载非常相似，但是在pH 2.5的加载下的释放速率显著较低，而pH 3.4和pH 4.0下的加载非常相似。

在24小时内在环境室温(25℃)下在振动器上伴随搅动，通过添加200μl的溶液，用在水中(pH 2.8、3.0&3.2)或在PBS(pH 2.77)中制备的菠萝蛋白酶(3.0mg/ml)对DC

然后在37℃的水浴中，伴随轻轻的搅动，将PVA珠添加到10ml的PBS(pH 6.5)。为了测定菠萝蛋白酶的突释，在0.5小时时，移出500μl的溶液用于分析(其中添加500μl的新的PBS以保持恒定体积)。然后以每小时的间隔，进行类似的程序用于分析菠萝蛋白酶。这些实验结果示于以下图9和表5中。

图9：

表5：

使用溶解在pH 2.77的PBS中的菠萝蛋白酶，加载的百分比几乎为100％，表明这可能是用于有效加载菠萝蛋白酶的良好的方法。同时，处于所研究的pH的水中的菠萝蛋白酶也是相当有效的，加载效率在86-89％变化。

与其他加载pH水平或与在PBS(pH2.77)中加载相比，在pH 2.8的水中加载菠萝蛋白酶的突释是最低的。然而，当使用总加载的％比较突释时，在pH 2.8的水中和在pH 2.77的PBS中加载这两者似乎表现一样。

在pH 2.0、2.2、2.4&2.6的分开的PBS样品中制备菠萝蛋白酶(3.0mg/ml)。将60μl的DC

将全部珠添加到10ml的PBS(pH 6.5)，并且在30分钟时，以及随后在1小时、2、3等之时收集500μl的溶液以评估突释(其中用500μl新的PBS替换该体积)。在一定时间段内对在500μl的PBS中流出的菠萝蛋白酶进行定量分析，直到没有菠萝蛋白酶释放(偶氮酪蛋白蛋白水解活性)。这些实验的结果示于以下所列的图和表(图10、表6.0、6.1、6.2)中。推测加载溶液酸性越强，释放时间越长(与图8相比)。

突释后的菠萝蛋白酶释放速率以12小时的时间段进行分隔并且从图对时间的线性部分计算菠萝蛋白酶流出速率。

图10：

表6.0–总加载和突释：

表6.1–菠萝蛋白酶随时间的释放速率

表6.2–总菠萝蛋白酶随时间的百分比释放

可以看出，将菠萝蛋白酶加载到微球中的pH影响可加载的量、加载的菠萝蛋白酶的突释和随后的流出速率。因此可利用加载介质的pH来调节微球的流出性质以满足特定的患者以及治疗方案。

例如，胰腺肿瘤的平均大小估算为约20cm

在突释之后，60μl的DC

80kg的瘦患者可能具有约6升的血液体积，这意味着53μg/hr的释放的菠萝蛋白酶将被稀释为约8.83ng/ml并且其中的大部分与白蛋白、抗胰蛋白酶和巨球蛋白结合。对凝血参数的毒性可能是一个问题，然而，这是伴随有流动的并且不代表上游栓塞模型，比如在肝和胰腺癌中。在与化疗的协同模型中使用较低的菠萝蛋白酶暴露也将是可能的。

以pH 2.4加载也可用于该肿瘤模型，其中加载的PVA珠的体积可增加20倍用以模拟先前实施例中的情形。

伴随连续搅动，用300μl的不同pH(2.0、2.2、2.4&2.6)的PBS中的菠萝蛋白酶溶液(3mg/ml)处理HEPA微球(40μl)24小时。然后对含有珠和溶液的管进行离心，并且吸出上清液(300μl)并且分析剩余的菠萝蛋白酶含量以对菠萝蛋白酶的加载进行定量分析。

伴随持续搅动，然后将HEPA珠添加到浸没在37℃的水浴中的50ml离心管中的10mlPBS(pH 6.5)。自1/2小时开始，并且随后每小时移出500μl的溶液。伴随每次采样，移出的采样溶液(500ul)都被替换。然后使用偶氮酪蛋白分析，分析采样溶液的菠萝蛋白酶含量。这些实验的结果示于以下图11和表7、7.1和7.2中。

图11：

表7.0–微球珠的总加载：

表7.1–突释

使用图的线性部分计算每12小时的释放速率(dx/dt)，排除菠萝蛋白酶的突释量。

表7.2–释放速率/hr

全部珠(40μl)都暴露于含有900μg的菠萝蛋白酶的菠萝蛋白酶溶液(300μl)，并且在不同的pH水平下，加载容量仅有微小差异，虽然在pH 2.2和2.0下，加载是类似的并且轻微高于pH 2.6或2.4的加载。在其他实验中(未描述)，在pH 3.4下暴露于1200μg的菠萝蛋白酶时，发现加载量显著更高(87％)。

在pH.2.6下加载菠萝蛋白酶时，突释最高(125μg–总加载的19.2％)，并且在pH2.0下加载菠萝蛋白酶时，突释最低。pH已知对微球的孔径有影响，并且因此这可影响突释。

在每12小时计算的释放速率显示在pH 2.6下，其再次成为最高，表明在特定的pH值下，加载pH可能与珠的孔径有关。在52小时时，在pH 2.6下加载的HEPA微球已流出了86％的加载的菠萝蛋白酶，而在pH 2.4下加载，其为48％，在pH2.2和2.0下加载，其分别为26和13％。这表明加载pH在释放模式和在特定时间的总释放中可能起关键作用。

HEPA微球为聚乙烯醇-共-丙烯酸钠，并且，在酸性环境中，菠萝蛋白酶中带正电荷的质子化的氨基与带负电荷的乙酸根基团形成键并且这是将菠萝蛋白酶栓系(tethering)至珠的基础。当将加载的珠添加至稀释介质时，离子键容易断裂以释放菠萝蛋白酶，直到此时，在pH 6.5的PBS中的栓系的菠萝蛋白酶和游离菠萝蛋白酶之间的量达到平衡。在采样和使用新的PBS溶液进行补充时，菠萝蛋白酶浓度下降，这导致菠萝蛋白酶从珠中进一步释放直到达到平衡。在当前模型中，使用10ml的PBS，其中移出500μl用于采样并且这相当于5％的通量变化或5％的清除。

平均肝肿瘤尺寸据报道为21.8cc(Dachman等，Tumor size on ComputedTomography Scans.Cancer，2001；91(3):555-560)并且对于不可切除的肿瘤，需要用能够输送约20μg/ml浓度的加载菠萝蛋白酶的微球治疗。40μl的在pH 2.6下加载的微球具有125μg菠萝蛋白酶的突释并且这在肿瘤处换算为5.73μg/cc。将160μl的微球输送至肿瘤位置基本上会将菠萝蛋白酶浓度提高至22.9μg/cc。假设清除为约10％/hr，这等于损失2.3μg/hr。第一个24的释放速率/hr为约8μg/hr(X4＝32μg/hr)并且这将抵消肿瘤位置处损失的菠萝蛋白酶。

在1.5mL离心管中收集40uL Tandem珠(75μm)。添加200uL的在蒸馏水中的5mg/mL菠萝蛋白酶。将所述管在室温下伴随温和搅动放置24小时。第二天，珠用蒸馏水洗涤两次并且在5mL蒸馏水中再次悬浮。首先，在30分钟时收集250μL样品并且此后在接下来的32小时每小时收集后续的样本(其中每次用250μL新的水替换)。各样品的菠萝蛋白酶含量通过偶氮酪蛋白分析测量，并且用于计算图12.1和12.2中所示的菠萝蛋白酶的释放曲线。

图12.1：累积的菠萝蛋白酶释放

图12.2：百分比菠萝蛋白酶释放

在32小时后不再有菠萝蛋白酶释放。这些实验证明菠萝蛋白酶可加载到其他形式的市售微球中并且随后以仍有活性的形式并且以持续方式流出。菠萝蛋白酶在TANDEM球中的释放模式可通过调节球的尺寸、加载时的pH和加载量、包覆以及先前描述过的其他技术而改变。

在室温下用菠萝蛋白酶(5mg/mL)加载DC Beads(300uM-500μM)24小时。加载到珠中的菠萝蛋白酶经计算为900μg。在浸没到2％藻酸盐溶液中之前，珠用蒸馏水洗涤两次并且然后浸入到2％CaCl溶液中15分钟以形成微球最外层表面上的藻酸盐包覆层。

然后将含有菠萝蛋白酶的、藻酸盐包覆的珠添加到10mL水中并且在接下来的30小时中，其菠萝蛋白酶释放以以上描述的方式测量，结果示于图13.2中。加载菠萝蛋白酶的DC

图13.1：

图13.2：

从上面列出的图中可以看出，包含在藻酸盐包覆的DC

以类似于先前描述的方式制备三个批次的DC

将CFPAC-1细胞(人类胰腺癌细胞系)铺放(plated)在96孔板中。制备珠的系列稀释液，并将其沉积在四联(quadruplet)孔中，并铺放培育72小时。培育期结束后，进行SRB分析，并计数每孔的珠数，结果列于以下(图14.1、14.2、14.3)。

图14.1：仅加载菠萝蛋白酶的DC

第一列对照-没有珠

第二列第一次稀释(平均40珠/孔)

第三列第二次稀释(平均22珠/孔)

第四列第三次稀释(平均9珠/孔)

第五列第四次稀释(平均6珠/孔)

第六列第五次稀释(平均3珠/孔)

在图14.1中，在40珠/孔和22珠/孔下存在具有生长抑制的剂量(珠稀释)效应，但在9珠/孔明显失去了该效应。

图14.2：

第一列对照-没有珠

第二列第一次稀释(平均45珠/孔)

第三列第二次稀释(平均24珠/孔)

第四列第三次稀释(平均15珠/孔)

第五列第四次稀释(平均8珠/孔)

第六列第五次稀释(平均4珠/孔)

图14.3：

第一列对照-没有珠

第二列第一次稀释(平均39珠/孔)

第三列第二次稀释(平均18珠/孔)

第四列第三次稀释(平均12珠/孔)

第五列第四次稀释(平均7珠/孔)

第六列第五次稀释(平均3珠/孔)

从以上呈现的实验结果可以清楚地看出(图14.1、14.2和14.3)，与加载单独的菠萝蛋白酶或亚得利亚霉素的珠相比，用菠萝蛋白酶和亚得利亚霉素加载的珠杀死了更多细胞。这些数据表明与单独的亚得利亚霉素或菠萝蛋白酶相比，亚得利亚霉素和菠萝蛋白酶之间有协同作用。

以与上述类似的方式用菠萝蛋白酶(400μg/mL)加载DC Beads(100-300μM)。随后将微球连续稀释并且如以上实施例5中所述的那样确定其针对CFPAC-1细胞的功效。这些实验的结果如下图15.1和15.2所示。

图15.1：

这些数据(图15.1，上方)显示，对于0.149ug/珠，在小于62珠/孔时在胰腺癌细胞系CFPAC-1中的抑制降低。在此加载剂量下，需要130珠以实现90％的细胞死亡。

在胰腺癌细胞系CFPAC-1中，对于加载程度更高的珠，在小于22珠/孔时抑制降低(图15.2，下方)。图15.1显示需要130的菠萝蛋白酶加载程度较低的珠(0.149ug/珠)来杀死90％的细胞，而仅需要43的加载程度较高的珠(0.403ug/珠)以实现大致与图15.2中相同的功效。

图15.2：

在此实验中，测试了加载不同浓度的菠萝蛋白酶(0.149或0.403μg/珠)的珠的抑制效果。数据显示每个DC Bead加载的菠萝蛋白酶浓度越高，抑制细胞增殖所需的珠数越少。

将人类卵巢癌细胞系的OVCAR-3细胞接种到96孔板中。在24小时后，用亚得利亚霉素(50nM)、N-乙酰半胱氨酸(2.5mM)和不同浓度的菠萝蛋白酶(不在微球中施用)处理所述板。在1小时、3小时、6小时、18小时、24小时和48小时后，移出药物和介质并且所述板用PBS洗涤。在合适的孔中再次开始亚得利亚霉素处理并且将不含药物的介质添加到所有其他孔中。将所有的板进一步处理72小时。这些实验的结果示于以下图16.1、16.2和16.3中。

这些研究的目的是确定菠萝蛋白酶从微球中流出以具有与共同施用化疗试剂的协同效果所需要的时间长度。这些结果表明在暴露于菠萝蛋白酶24小时且优选48小时时，看到了与50nM的亚得利亚霉素的良好的协同作用。在更高的亚得利亚霉素浓度下，比如100nM(结果未示出)，观察到甚至暴露于菠萝蛋白酶3小时产生了协同的癌细胞杀灭效果。

图16.1：用菠萝蛋白酶、N-乙酰半胱氨酸或组合处理18小时，用亚得利亚霉素处理

图16.2：用菠萝蛋白酶、N-乙酰半胱氨酸或组合处理24小时，用亚得利亚霉素处理

图16.3：用菠萝蛋白酶、N-乙酰半胱氨酸或组合处理48小时，用亚得利亚霉素处理

以与上述类似的方式用菠萝蛋白酶加载DC Beads(100-300μM)。

在这项安全性研究中，用以与上述类似的方式加载有总共5或10mg菠萝蛋白酶的DC Beads处理新西兰兔。珠的悬浮液直接注射到肝总动脉(即通过动脉内途径)中，随即DCBeads被血流携带直到它们栓塞并且随时间使菠萝蛋白酶流出。

处理后，在1h、3h、6h、24h或7d时，对动物实施安乐死。然后，进行验尸、内部器官的比较观察、血浆和肝中菠萝蛋白酶浓度测量。这些观察结果列在以下图17.1-17.6中。

图17.1：

图17.2：

图17.3:

图17.4:

图17.5:

图17.6:

从以上列出的图中可以看出，在肝总动脉内注射之后，包含在DC

将ASPC-1和HT-29细胞系的细胞接种到96孔板中。在24小时后，以与上述类似的方式(参见实施例5)用5mg/ml的加载到DC Beads(100-300μM)中的菠萝蛋白酶处理所述板。微球随后被连续稀释。在48小时后，移出药物和介质并且使用SRB分析测试细胞增殖。这些实验的结果示于以下图18.1和18.2中。

图18.1：用加载5mg/ml菠萝蛋白酶的DC

图18.2：用加载5mg/ml菠萝蛋白酶的DC

在此实验中，测试了加载菠萝蛋白酶的珠(50、30和10珠/孔)的系列稀释液的抑制效果。数据显示与胰腺癌细胞系ASPC-1(图18.1)相比，加载菠萝蛋白酶的DC Beads的稀释液对大肠细胞系HT-29(图18.2)更有效。

将胰腺癌CFPAC-1细胞系的细胞接种到24Transwell板中。在24小时后，使用Transwell腔室插入物用加载到DC Beads(300-500μM)中的菠萝蛋白酶处理板。每隔3小时，将含有珠的Transwell插入物转移到其他的新的孔中。该过程持续进行3天。细胞增殖使用SRB分析进行测试。这些实验的结果示于以下图19.1中。

图19.1：Transwell腔室实验中加载菠萝蛋白酶的DC

在此实验中，结果显示珠释放细胞毒性剂量的菠萝蛋白酶最高达17小时。

以下实施例描述了发明人如何相信根据本发明的实施方式的微球可用于治疗癌变的肿瘤，例如治疗原发性或继发性肝癌。该方法与以上描述的TACE方法类似，其中将微球注射到为癌变的肿瘤供血的动脉中。在达到血管床之前，微球携带在患者的动脉中直到它们物理上受困。以此方式，所述微球切断或限制肿瘤的供血并且以持续方式局部输送菠萝蛋白酶(或其他影响粘蛋白的蛋白酶)以及任意其他共同加载或共同施用的其他试剂。

如本文中所描述的，本发明提供了新颖的输送载体，通过该载体可以其潜在副作用被最小化的方式将有效量的菠萝蛋白酶(或其他具有治疗应用的影响粘蛋白的蛋白酶)输送到患者。本发明的实施方式提供了相对于现有疗法的多个优点，其中的一些汇总如下：

·本发明的微球提供影响粘蛋白的蛋白酶的输送方法，其是局部的且其提供了蛋白酶的持续释放(任选地与其他活性物质一起)，强化其效果同时降低潜在的副作用；

·本发明可在目标区域处产生高局部浓度的影响粘蛋白的蛋白酶，具有所有附带的好处，但没有与全身毒性相关的风险；

·本发明可改进药物向癌症(尤其是具有纤维状包覆物的肿瘤或被粘连包围的肿瘤)中的渗透，并且当与其他化疗试剂一起使用时可提供协同效果；和

·持续释放影响粘蛋白的蛋白酶可被改造成在相关细胞的复制时间内发生，确保细胞死亡。

本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出许多修改。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。

还应当理解，尽管前面的描述指的是微球、药物组合物和治疗方法的特定形式，但是提供这些细节仅出于说明目的，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

应当理解，本文所涉及的任何现有技术出版物并不构成承认该出版物构成本领域公知常识的一部分。

在所附权利要求和本发明的先前描述中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另外需要，否则以包括性(inclusive)含义使用词语“包含(comprise)”或变体例如“包括(comprises)”或“含有(comprising)”，即在本发明的各种实施方式中说明存在所述特征，但不排除其他特征的存在或添加。