一种高山杜鹃种子外植体的消毒方法

技术领域

本发明涉及农林繁殖育苗领域，尤其涉及一种高山杜鹃种子外植体的消毒方法。

背景技术

杜鹃花是中国传统十大名花之一。高山杜鹃是杜鹃花科常绿杜鹃亚属的俗称，产于高海拔地区，喜凉爽湿润的气候，恶酷热干燥。高山杜鹃包括：马缨杜鹃、迷人杜鹃和露珠杜鹃等花序常硕大、色艳，是著名的观赏花卉，不仅具有非常高的园艺价值，还具有较高的医药价值，但其种子非常细小，露地实生繁殖困难。

组织培养是当前一种重要的育苗繁殖方式。在高山杜鹃的组织培养中，无菌苗的获得一般都是由种子培养的到，此外杂交育种由于种子少，一般杂交后代种子量少，育苗也先以组织培养方式为主。外植体的消毒灭菌对于组织培养而言至关重要，是获得无菌苗的关键，由于种子非常细小，消毒不当极易导致发芽率降低或不能发芽。

在高山杜鹃无菌苗的生产过程中，种子消毒是第一步骤，杜鹃种子常用的消毒剂多是氯化汞。氯化汞是一种强氧化消毒剂，很容易对细小种子产生极大损伤，且氯化汞容易残留，从而降低种子萌发率，甚至由于过度氧化褐化而不能正常萌发。此外，氯化汞因有剧毒，对组培操作人员及环境也不友好。现有技术中也使用氯化汞和次氯酸钠同时对种子进行消毒，如：CN106258959A，不仅氯化汞有剧毒有污染，而且对种子进行两次强氧化剂的消毒，造成对种子过度消毒，对种子造成伤害，种子发芽率很低。

发明内容

本发明的目的是提供一种高山杜鹃种子外植体的消毒方法，可以使得高山杜鹃种子消毒更彻底、被污染率降低、褐变率降低，提高种子发芽率。

为了解决上述技术问题，本发明提供的高山杜鹃种子外植体的消毒方法是这样实现的：

一种高山杜鹃种子外植体的消毒方法，包括：在高山杜鹃种子中加入硼酸浸泡24小时；

然后在所述浸泡过硼酸的高山杜鹃种子中加入乙醇消毒，使用移液器吹打乙醇液体使得所述浸泡过硼酸的高山杜鹃种子均匀地悬浮在所述乙醇中，20秒后，使用移液器吸出所述乙醇，所述移液器吸头的容量大于或等于所述加入的乙醇体积；

将无菌去离子水吹打在所述使用乙醇消毒过的高山杜鹃种子上；

然后，吸出所述无菌去离子水，在所述经无菌去离子水吹打的高山杜鹃

种子中加入次氯酸钠溶液消毒，使用移液器吹打所述次氯酸钠液体使得所述经无菌去离子水吹打的高山杜鹃种子均匀悬浮在所述次氯酸钠液体中，8-9分钟后，使用移液器吸出所述次氯酸钠液体，所述移液器吸头的容量大于或等于所述加入的次氯酸钠溶液；

然后，再次将无菌去离子水吹打在所述使用次氯酸钠溶液消毒过的高山杜鹃种子上，完成消毒。

可选的，所述高山杜鹃种子完成消毒后，使用移液器将所述完成消毒的高山杜鹃种子吸出放在滤纸上，用药匙将种子均匀撒在培养基内。

可选的，所述培养基为由1/4MS、KT1.0mg/L、25g/L蔗糖和8g/L琼脂制成，PH为5.8。

可选的，所述硼酸的浓度为0.5%。

可选的，所述乙醇的浓度为70%。

可选的，所述次氯酸钠溶液的浓度为5%。

可选的，所述在所述经无菌去离子水吹打的高山杜鹃种子中加入次氯酸钠溶液消毒的时间为9分钟。

可选的，所述无菌去离子水是高压灭菌30分钟后的去离子水。

可选的，使用乙醇消毒时，所述高山杜鹃种子所占体积是所述乙醇体积的二分之一。

可选的，使用次氯酸钠溶液消毒时，所述高山杜鹃种子所占体积是所述次氯酸钠溶液体积的二分之一。

本发明提供的高山杜鹃种子外植体的消毒方法，经硼砂处理、乙醇消毒、高压无菌水清洗、次氯酸钠溶液消毒、再次使用高压无菌水清洗，经试验证明褐变率和被污染率均低于现有技术中使用氯化汞对杜鹃种子消毒，更低于同时使用氯化汞和次氯酸钠消毒的种子褐变率和被污染率，且本发明杜鹃种子的发芽率，高于现有技术中使用氯化汞消毒、和同时使用氯化汞和次氯酸钠消毒的杜鹃种子的发芽率。

附图说明：

图1是本发明消毒方法消毒的马缨杜鹃种子发芽培养20d的马缨杜鹃苗；

图2是本发明消毒方法消毒的马缨杜鹃种子发芽培养24d的马缨杜鹃苗；

图3是本发明消毒方法消毒的马缨杜鹃种子发芽培养30d的马缨杜鹃苗；

图4是本发明消毒方法消毒的马缨杜鹃种子发芽培养75d的马缨杜鹃苗；

图5是本发明消毒方法消毒的马缨杜鹃种子发芽培养85d的马缨杜鹃苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例以马缨杜鹃杜鹃种子为试验对象，说明本发明高山杜鹃种子外植体的消毒方法，但是高山杜鹃中比如迷人杜鹃种子、露珠杜鹃与马缨杜鹃种子差别不大，因此也适用迷人杜鹃和露珠杜鹃等高山杜鹃种子。本发明提供的高山杜鹃种子外植体的消毒方法包括如下步骤：

步骤一、马缨杜鹃种子的选择，浸泡硼酸

将马缨杜鹃进行浸泡处理：取适量健康饱满的马缨杜鹃种子放入10ml离心管中，再加入质量体积比为0.5%硼酸浸泡24h。然后，倒掉硼酸，对操作台面进行消毒后，将装有马缨杜鹃种子的离心管用75%乙醇消毒后放入超净工作台，再打开乙醇灯对金属药匙、镊子、金属置物台等工具进行灼烧灭菌。

步骤二、乙醇消毒

将步骤一处理过的马缨杜鹃种子放入1.5ml的离心管中，使用1000ul的移液器吸取1ml浓度为70%的乙醇消毒；加入马缨杜鹃种子的量和乙醇的量正好可以占满离心管，根据具体试验得出马缨杜鹃种子所占体积是乙醇体积的二分之一。期间使用移液器吹打乙醇溶液使得马缨杜鹃种子均匀地悬浮在乙醇溶液中；20秒后，使用移液器吸出乙醇丢弃，然后换上新的吸头，进入步骤三。需要说明的是，乙醇消毒的20秒只是一个消毒时间的限定，可以是一个范围，比如18秒-22秒，相比本发明使用的20秒的消毒时间，消毒19秒或者21秒也是可以的，本发明对此不做限定。该步骤中，移液器吸头的容量大于或等于加入的乙醇体积，确保一次性加入乙醇。

步骤三、无菌去离子水冲洗

移液器换上新的吸头，吸取无菌去离子水冲洗种两次；具体是：使用移液器吸取无菌去离子水，将无菌去离子水吹入到种子中，无菌去离子水全部加入后，使用移液器吹打液体。冲洗完成后将离心管中的上清液吸出丢弃。无菌去离子水是高压灭菌30分钟后的去离子水。

步骤四、使用次氯酸钠消毒

用体积比为5%的次氯酸钠消毒，分别设置消毒7min、8min、9min、10min和11min5组 试验，换上新的吸头，分别用移液器吸取1ml次氯酸钠放入1.5ml离心管消毒处理，移液器吸 头的容量大于或等于加入的次氯酸钠溶液的量，马缨杜鹃种子占体积是次氯酸钠溶液体积 的二分之一；期间通过移液器吹打液体使种子均匀的悬浮在液体中，达到时间后将离心管 中的上清液吸出丢弃。如表一所示，是使用次氯酸钠消毒不同时间的对照试验，从表一中可 以看出消毒9分钟时，种子发芽率最高，被污染率较低，褐变率较低；消毒8分钟时，发芽率次 高，被污染率次低，褐变率次低；消毒10分钟时，发芽率较8分钟的低，被污染率低于8、9分 钟，但褐变率较8、9分钟高；因此本发明设定次氯酸钠消毒时间9min±15s，也就是次氯酸钠 消毒时间是8分钟45秒到9分钟15秒。再次进行试验，如表一所示数据，8min45s和9min15s发 芽率略低于9min的发芽率，被污染率9min15s略低、8min45s略高，褐变率9min15s略高、 8min45s略低，但是都能达到较高的发芽率、较低的被污染率和较低的褐变率，因此本发明 认为次氯酸钠消毒时间为8min45s-9min15s，在本发明其他步骤均相同的情况下，是能够实 现本发明发明目的一个时间范围；其中次氯酸钠最佳的消毒时间是9分钟。本发明最佳的消 毒方法为75%乙醇消毒20s+无菌去离子水冲洗2次+5%次氯酸钠消毒9min+无菌去离子水冲 洗3次。按照此方法对马缨杜鹃种子进行消毒，发芽率超过80%，污染率仅3.3%，且发芽后褐 变率才4.9%。需要说明的是，表一中各试验仅次氯酸钠消毒时间有差别，其他步骤均相同。 其中，被污染数是种子消毒后被污染的种子数目，被污染率是被污染的种子数除以接种数； 其中，褐变数是种子消毒后被消毒液影响而发生褐变的种子数目，褐变率是褐变的种子数 除以接种数。

表一

步骤五、无菌去离子水冲洗3次，完成消毒

移液器换上新的吸头，吸取1ml的无菌去离子水，冲洗种子三次，期间通过移液器吹打液体使种子均匀的悬浮在液体中。

至此，完成马缨杜鹃种子外植体的消毒，接下来进行组织培养。

步骤六：组织培养

将步骤一至步骤五消毒锅后的马缨杜鹃种子播于培养基内：向离心管中加入1ml无菌去离子水，然后通过移液器吹打液体使种子均匀悬浮在液中，然后用移液器将种子吸取出来放在滤纸上，由于马缨杜鹃种子较小，所以用药匙将种子均匀的撒在配方为1/4MS+KT1.0mg/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH=5.8的培养基上，每个处理接5瓶，每瓶30粒种子。给每个培养瓶贴上标签，分别写上次氯酸钠消毒时间，日期等。

将培养基放在培养室内进行培养，第5天开始观察种子的萌发情况、污染情况以及成苗后数和无菌苗褐变率等，并记录数据，持续观察30天，发芽情况如图1到图3所示，30天时统计发芽率。

如下是采用现有技术中马缨杜鹃消毒方法的试验步骤和结果；

现有技术1：

主要步骤如下：

（1）取马缨杜鹃种子，用自来水冲洗2遍.

（2）在超净工作台上用75%乙醇消毒30s。

（3）在步骤（2）完成后用0.1% HgCl2分别以5个处理时间（8min、9min、10min、11min、12min）对种子进行消毒处理。

（4）最后用无菌水清洗5次，在消毒滤纸上吸干表面的水分后均匀抖撒在种子萌发培养基上进行培养。

实验结果：

由表二可知在0.1% HgCl2消毒时间为10min 时，萌发率显著高于其他处理时间，污染率也较低，最高发芽率为54%，最低污染率为13.3%。表二中各组试验仅氯化汞消毒时间有区别，其他步骤相同。

表二

表三记录的是两种现有技术消毒方法与本发明消毒方法的对比，其中现有技术对照1的氯化汞消毒时间采用表二中最佳的消毒时间，现有技术二是吴雅文等人在《种子》2015年3月期刊上发表的《迷人杜鹃组培快繁技术的研究》。

表三

从表三综合分析可以得出，通过本发明方法与现有技术两组所做的对照实验比较，本发明的消毒方法处理的发芽率相对于现有技术1和现有技术2最高，且被污染率和褐变率相对于现有技术1和现有技术2较低。虽然现有技术2用0.1%氯化汞消毒种子被污染率也较低，但是由于氯化汞具有剧毒，对组培操作人员及环境也不友好，且难以清除附着在种子表面的残留液；而且，虽然现有技术2中没有提供发芽率数据，但是从其较高的褐变率来看其种子发芽率没有本发明的种子发芽率高。由此可见采用本发明技术方案，通过组织培养可以获得大量实生无菌苗，所萌发的种子中95%以上能成活，如图4-图5所示，种子发芽培养75天和85天的杜鹃苗生长健壮有活力能够有效提高实生苗成活率，为后期移栽种植杜鹃提供健壮的实生苗，也为进一步基于组培的其它高山杜鹃研究提供大量无菌材料。本发明克服了现有技术中种子上残留的消毒剂而降低萌发率和成活率的问题，同时也提高了实验的稳定性和安全性。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的同等替换和修改，均应包含在本发明的保护范围之内。