引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒。

背景技术

食源性寄生虫病是指进食生鲜的或未经彻底加热煮熟的含有寄生虫虫卵或幼虫的食品而感染的一类疾病的总称。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食来源和方式的多样化使食源性寄生虫病的暴发时有发生，由食品寄生虫引发的食品安全问题愈加突出。食源性寄生虫病不仅是影响我国人民健康的主要因素之一，且已成为重要的全球疾病负担之一。

异尖线虫是一种重要的食源性人兽共患的寄生虫，其分布范围广泛，很多鱼类和头足类动物都可以感染异尖线虫。异尖线虫的幼虫主要寄生于海鱼，成虫寄生于海洋哺乳动物体内。当人生食或半生食含有异尖线虫Ⅲ期幼虫的鱼可以引起异尖线虫病(anisakiasis)，其除了引起人强烈的胃肠反应外，还可以导致人的过敏症状，引起局部的皮肤肿胀，甚至过敏性休克从而危及生命。异尖线虫可以入侵肠壁直接导致组织损伤，伴随着嗜酸性肉芽肿的特征；由于人类不是异尖线虫的最佳宿主，所以异尖线虫感染人后容易发生异位的现象，如肠穿孔。目前人们对于异尖线虫的认识还不够全面。所以在临床中，异尖线虫病患者经常被误诊为其他疾病，胃部的异尖线虫病经常误诊为胃溃疡、胃息肉，肠道的异尖线虫病经常误诊为盲肠炎或腹膜炎。当下异尖线虫病还没有有效的治疗措施，临床上通常通过内窥镜人工的方法将虫体从人体中取出。近年来随着人们饮食结构的改变，饮食文化不断多元化，对于腌制品、寿司、生鱼片等一系列的食用越来越多，导致现在异尖线虫病的发病率也逐渐升高。联合国粮农组织(FAO)将异尖线虫列为重要的致病因子，我国也将其列为国家禁止入境的二类动物寄生虫。因此,建立海产品尤其是鱼类产品中异尖线虫的检测体系,对于主动预防、控制其安全危害人们健康是非常必要和重要的意义。

目前水产加工企业对海产品异尖线虫筛检常常为灯检法:包括日光灯检法和紫外灯检法，前者利用白色透射光和反射光的共同作用，使得鱼肉内虫体呈不同颜色或阴影；后者利用紫外线激发虫体产生明亮的点状或条线状的荧光加以辨别。其虽简便快速但准确性欠佳，检出率仅为60％～70％，容易误检、漏检。同时异尖线虫的检测标准《SC/T7210-2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法》依靠形态学方法和以PCR技术为基础的分子生物学方法。其中形态学鉴定因异尖线虫虫种种属多，其形态结构存在很大的差异而使鉴定不准确，而且需要受过专业训练的专业人员与专用仪器设备才能完成；使用PCR技术对虫体的基因进行扩增，通过测序比对可以判定虫种，但其周期漫长，需要笨重的仪器才能完成，耗时耗力，很难在基层推广。因此阻碍了在实际的应用。近年来核酸等温扩增技术逐步发展成熟，其不依赖复杂的仪器，也不需要热稳定的聚合酶，可以大大降低仪器成本、复杂性并实现便携性，值得在资源相对匮乏地区推广应用。LAMP(Loop-mediatedisothermal amplification)因其高特异性和灵敏度成为当前研究和应用相对广泛的等温扩增技术之一。但LAMP法的引物设计较复杂，数量多、难度大，需根据6个特定区域设计4对引物，且其扩增产物是一些大小不等的片段，易形成气溶胶而造成实验室的环境污染。因此，LAMP反应极易受到污染而产生假阳性结果，对操作人员及检测环境都有较高要求。

综上，建立快速准确便捷的异尖线虫测方法对的食品安全和进出口水产品的检疫工作都有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒。该引物组合的灵敏度可达1pg/μL，人工模拟污染样品结果呈阳性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物组合，所述引物具有：

(I)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

(II)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

(IV)、与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的引物组合在制备扩增异尖线虫基因组的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为30～40℃，所述扩增的时间为10～25min。

在本发明的一些具体实施方案中，以体积份计，所述扩增的反应体系为：

本发明还提供了所述的引物组合在制备异尖线虫的检测试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为30～40℃，所述扩增的时间为10～25min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为35℃，所述扩增的时间为25min。

在本发明的一些具体实施方案中，总体积为50μL，所述扩增的反应体系为：

基于上述研究，本发明还提供了异尖线虫的检测试剂，包括所述的引物组合以及可接受的助剂。

本发明还提供了异尖线虫的检测试剂盒，包括所述的引物组合以及可接受的助剂或载体。

此外，本发明还提供了异尖线虫的检测方法，取待测样本经所述的引物组合扩增、检测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新型的等温核酸体外扩增技术，其引物设计简单，反应在37-42℃下进行5～20min即可得到与传统PCR反应相当，可用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。RPA反应简单快速，不需要高温循环，对仪器的需求大大降低，在现场检测显示出突出的优越性。同时RPA检测技术灵活性强，可以与多种检测方法结合，其基础反应体系与其他技术结合，延伸出多功能多用途的核酸检测技术，可以真正实现便携式的快速核酸检测，发展空间大。

本发明对东海沿海舟山、温州、宁波、平潭、嘉兴市的九种鱼体内获得的异尖线虫用吸虫和线虫ITS区通用引物NC5-F、NC2-R进行PCR扩增。然后对PCR产物测序比对进行鉴定，获得了派氏异尖线虫、简单异尖线虫、典型异尖线虫、宫脂线虫和对盲囊线虫。然后根据获得的五种异尖线虫的ITS区通过DNAMAN进行序列比对设计通用引物。本发明建立的RPA方法可扩增出异尖线虫基因组的目的片段在340bp左右，可特异性的检测出异尖线虫，而对阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫检测结果成阴性。优化后在35℃、25min即可完成检测，其灵敏度可达1pg/μL，人工模拟污染样品结果呈阳性。此方法操作简单、便捷，对现场快速检测具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示引物的筛选结果；其中，M:DNA分子量标准(DL1500)；1：ITS-1；2：ITS-2；3：ITS-3；4：ITS-4；5：ITS-5；6：ITS-6；7：ITS-7；8：ITS-8；

图2示不同反应时间扩增结果；其中，M：DNA分子量标准(DL1500)；1～5：5、10、15、20、25min；

图3示不同反应温度温度扩增结果；其中，M:DNA分子量标准(DL1500)；1～5：20、25、30、35、40℃；

图4示RPA特异性结果；其中，M：DNA分子量标准(DL1500)；1：宫脂线虫；2：简单异尖线虫；3：派氏异尖线虫；4：对盲囊异尖线虫；5：典型异尖线虫；6：阔节裂头绦虫；7：华支睾吸虫；8：东方次睾吸虫；9：棘颚口线虫；10：ddH

图5示检测基因组的灵敏性结果；其中，M：DNA分子量标准(DL1500)；1：1ng/μL；2：100pg/μL；3：10pg/μL；4：1pg/μL；5：100fg/μL；

图6示人工模拟污染样品的检测结果；其中，M：DNA分子量标准(DL1500)；1-2：20g样本；3-4：50g样本；5-6：100g样本；7-8：阴性对照；9：ddH

具体实施方式

本发明公开了引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)建立了异尖线虫RPA的检测方法。首先对东海沿海舟山、温州、宁波、平潭、嘉兴市的九种鱼体内获得的异尖线虫进行分离鉴定，获得了派氏异尖线虫、简单异尖线虫、典型异尖线虫、宫脂线虫和对盲囊线虫。然后根据获得的五种异尖线虫的ITS区设计通用引物。

通用引物：

RPA-F，5’-TCTRCGCCBYAYCTAGYTWYYGCCTGGACCGTCR-3’；(如SEQ ID No.1所示)

RPA-R，5’-AATGAACCCGATRGCGCAATGTGCGTTCGAATTC-3’；(如SEQ ID No.2所示)

结果显示本发明建立的RPA方法可扩增出异尖线虫基因组的目的片段在340bp左右，可特异性的检测出异尖线虫，而对阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫检测结果成阴性。优化后在35℃、25min即可完成检测，其灵敏度可达1pg/μL，人工污染实验结果呈阳性。特异性实验结果表明，所建立异尖线虫RPA的检测方法与其他的寄生虫无交叉反应，具有良好的特异性。此方法操作简单、便捷，对现场快速检测具有重要的意义。本发明建立异尖线虫RPA检测方法能够快速诊断出异尖线虫。与常规的检测方法相比，具有良好的可操作性、快速、简单、对设备要求低、劳动强度较低，而且还具有耗时短的优点；同时也满足开展现场工作的要求，这对现场快速检测异尖线虫具有重要意义。同时也弥补了现有检测技术的不足。

本发明提供的引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。

主要实验材料和来源

1.虫种

样本来源主要是我国东海海域沿海城市地区海鱼(带鱼、大黄鱼、小黄花鱼、马鲛鱼、包公鱼、梭鱼、鱿鱼、鳗鱼、海鲫鱼)。对所有的鱼进行标记、称重剖捡。主要在鱼的肠系膜、腹腔、肌肉寻找异尖线虫的第Ⅲ期幼虫。所获得的异尖线虫用生理盐水冲洗后，于70％乙醇-80℃保存。

2.主要试剂

冰醋酸、氯化钠、琼脂糖粉、三水合醋酸钠DNA抽提液购自北京鼎国生物技术有限公司；TAE、EB购自Qiagen公司；葡萄糖、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1异尖线虫的鉴定

寄生虫虫基因组的提取(异尖线虫、阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫)

(1)将虫体从-80℃冰箱取出，用液氮和沸水反复冻融3-5次，每次30s。

(2)在1.5mL离心管中加入500μL的裂解液，再加入20μL浓度为2％的蛋白酶K，震荡混匀。

(3)将离心管放入56℃水浴锅中，孵育2h，每h翻转离心管3-5次(翻转的目的是为了充分裂解组织)。

(4)加入RNaseA 5μL，混匀后静置2min。

(5)加入等体积的Tris饱和酚(500μL)，稍微剧烈震荡混匀后静置10min。

(6)12000rpm4℃离心15min，离心后分为上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质，吸取上层DNA转移至新的1.5mL离心管中。

(7)DNA液体大约500μL，加入500μL的异丙醇，1/10总体积的3M NaAc，轻轻翻转混匀后静置10min。

(8)12000rpm4℃离心15min，弃上清，留下底部白色片状物沉淀(DNA)，加入约200μL经过4℃冷藏的75％酒精清洗两遍。

(9)加入30-50μL的无菌水溶解沉淀，放入-80℃保存。

用提取的基因组PCR获得ITS区，体系如下：

PCR总体积为50μL如下：

95℃5min；95℃30s,56℃30s,72℃75s,30个循环；72℃7min,4℃保存。

NC5-F：5′-TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

NC2-R：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′

通用引物是获得ITS1、5.8S、ITS2序列，然后通过测序比对确定异尖线虫的种。

实施例2引物设计及RPA条件优化

根据已测序鉴定虫种的ITS区通过DNAMAN进行序列比，设计RPA扩增引物8对，分别为ITS-1、ITS-2、ITS-3、ITS-4、ITS-5、ITS-6、ITS-7、ITS-8。序列如下：

ITS-1：F，5’-CTAGGTGGCCGCCAAAACCCAAAACACAACC-3’；

R,5’-ACAGTTCACCGTAATTCGACCCTCAGCCAGACG-3’；

ITS-2：F,5’-CTAGGTGGCCGCCAAAACCCAAAACACAACC-3’；

R,5’-ACGAACCGAGTGATCCACCGCCAAGATTTG-3’；

ITS-3：F,5’-TGCGATAAATAGTGCGAATTGCAGACACAT-3’；

R,5’-AATTGCTTGCCGAATGCTTCACAGTCCAGAAAAA-3’；

ITS-4：F,5’-GTCAGTTGCGATGAAAGATGCGGAGAAAGTTCC-3’；

R,5’-TGCTCAATGTGTCTGCAATTCGCACTATTTATCG-3’；

ITS-5：F,5’-TGTTGAACAACGGTGACCAATTTGGCGTCTACG-3’；

R,5’-AGTGATCCACCGCCAAGATTTGTACATTTTCAACACAT-3’；

ITS-6：F,5’-TGTTGAACAACGGTGACCAATTTGGCGTCTACG-3’；

R,5’-AGCTGGCTGCGTTCTTCATCGATCCACGAA-3’；

ITS-7：F,5’-TGCGATAAATAGTGCGAATTGCAGACACAT-3’；

R,5’-AATTGCTTGCCGAATGCTTCACAGTCCAGAAAAAC-3’；

ITS-8

RPA-F，5’-TCTRCGCCBYAYCTAGYTWYYGCCTGGACCGTCR-3’；

RPA-R，5’-AATGAACCCGATRGCGCAATGTGCGTTCGAATTC-3’；

预计扩增产物长度为340bp。

RPA总反应体积50μL如下：

反应在水浴锅内39℃20min进行扩增，筛选最佳引物。反应产物用利用普通DNA产物纯化试剂盒纯化扩增产物，最后取溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。引物的筛选结果如图1所示。与其他引物相比8号引物没有多余的杂带，且特异性高(图1)，最终确定8号引物。

在此基础上，利用8号引物，进行最佳反应温度和时间的优化。反应在水浴锅内20、25、30、35、40℃25min进行温度优化，在此基础上进行最佳反应时间的优化5、10、15、20、25min反应产物用利用普通DNA产物纯化试剂盒纯化扩增产物，最后取溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。

在10～25min条件下均有条带，扩增片段随反应时间的延长亮度逐渐增强(图2)，反应的温度在30～40℃均有条带，且在35℃扩增条带最明亮(图3)，并且扩增片段约为340bp，与预期大小一致。因此，为了下一步特异性和敏感性的确定，初步确定体系的最佳反应时间和温度为35℃和25min。

实施例3灵敏度和特异性检测

灵敏度检测：用Nanodroop 2000测定宫脂异尖线虫DNA的浓度(100.5ng/μL)，将其用无菌水10倍梯度稀释至1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。以稀释后不同浓度的DNA为模板进行RPA反应以确定该方法的灵敏度。

特异性检测：分别采用宫脂线虫(100.5ng/μL)、简单异尖线虫(85.7ng/μL)、派氏异尖线虫(60.3ng/μL)、对盲囊线虫(53.2ng/μL)、典型异尖线虫(60.2ng/μL)DNA为模板，同时设置阔节裂头绦虫(236.15ng/μL)、华支睾吸虫(200.6ng/μL)、东方次睾吸虫(132.7ng/μL)、棘颚口线虫(154.6ng/μL)为阴性对照和双蒸水为空白对照，进行RPA方法扩增。每个虫体的基因组加1.5μL。

灵敏度、特异性检测都在35℃、25min条件下进行。

特异性试验结果显示，异尖线虫的DNA均出现明显的特异性条带，而阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫和双蒸水的检测结果均为阴性(图4)。

灵敏性试验结果显示，以异尖线虫的DNA为模板梯度稀释后进行RPA反应，结果显示，样品浓度大于1pg/μL时，均能扩增出明显的条带；样品浓度小于1pg/μL时，检测效果不佳(图5)。

实施例5人工模拟污染样品的检测

将未感染异尖线虫的带鱼为临床样品，取20g、50g、100g带鱼肉样，然后分别混入一条异尖线虫放入组织捣碎机捣碎，肉样各取二份提取基因组DNA，同时提取未混入异尖线虫的带鱼肉样基因组作为阴性对照，并以双蒸水为空白对照，用已经建立好的RPA方法进行验证。

人工模拟污染样品实验结果显示：样品检验结果显示20g、50g、100g样品中均可扩增出目的片段，且随着肉样的增加目的片段亮度变暗，阴性对照和空白对照均无条带(图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒

<130> MP2028319

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctrcgccby ayctagytwy ygcctggacc gtcr 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatgaacccg atrgcgcaat gtgcgttcga attc 34