一种高效的血浆、红细胞、淋巴细胞NAD+检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术和医学检测领域，尤其涉及一种高效的血液NAD

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD

目前常采用高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）、液相二级质谱（HPLC-MS/MS）以及酶循环法检测NAD

发明内容

本发明旨在解决快速准确测定哺乳动物血浆、红细胞、淋巴细胞中的NAD

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种高效的血浆、红细胞、淋巴细胞NAD

（1）样本制备：采集哺乳动物新鲜外周血，肝素锂抗凝，分离血浆，剩余部分采用淋巴细胞分离液，分离出红细胞和淋巴细胞，清洗后细胞计数。血浆、红细胞、淋巴细胞样本制备完成后，立即检测或液氮速冻后转至-80℃保存。

（2）试剂制备：包含0.1%DEPC水、0.3 M HCl、0.6 M KOH、0.36 M TEA-HCl、NAD

（3）r-SBFA制备：采用HEPES缓冲系统配制40g/L的BSA溶液，调整PH至7.4，使用前储存于-20℃。

（4）β-NAD标准品制备：包含 β-NAD 原液、β-NAD 工作液、Standard 1~Standard6。

（5）反应液制备：每个反应孔中按照25.72μmol TEA-Buffer 、129μmol无水乙醇、0.4μmol PMS、0.1μmol MTT、125U乙醇脱氢酶的量配制反应液。

（6）NAD

（7）干扰物质去除：血浆NAD

（8）NAD

（9）数据校准：红细胞和淋巴细胞的NAD

如上所述的一种高效的血浆、红细胞、淋巴细胞NAD

如上所述的一种高效的血浆、红细胞、淋巴细胞NAD

如上所述的一种高效的血浆、红细胞、淋巴细胞NAD

本发明的有益效果是：

1. 本发明采用离心法去除血浆样本中的大分子蛋白等干扰物质；采用离心法联合超滤法去除红细胞样本中细胞裂解物和血红蛋白等干扰物质；采用离心法去除淋巴细胞样本中的细胞裂解物等干扰物质，大大减少了干扰物质对吸光度测定的影响，显著提高了检测的准确性和灵敏度。

2. 本发明在β-NAD标准品中加入含BSA的r-SBFA，模拟肝素化血液环境，乙醇脱氢酶活性得到优化，增加了β-NAD标准品与血浆、红细胞、淋巴细胞样本中NAD

3. 本发明灵敏度高，检测限低至50nM，能够检测微量血液中血浆、红细胞、淋巴细胞中的NAD

4. 本发明所使用试剂、r-SBFA、β-NAD标准品、反应液均使用0.1%DEPC水配制，减少了溶媒中干扰物质对吸光度测定的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图；

图1为本发明具体实施方式β-NAD标准曲线图；

图2为本发明具体实施方式血浆样本Time-OD图；

图3为本发明具体实施方式红细胞样本Time-OD图；

图4为本发明具体实施方式淋巴细胞样本Time-OD图；

图5为本发明具体实施方式β-NAD标准品的Time-OD图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下面对本发明检测人血浆、红细胞、淋巴细胞的NAD

1. 样本制备：采集人新鲜外周血5ml，肝素锂抗凝，分离血浆，剩余部分采用GEFicoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液，分离出红细胞和淋巴细胞，细胞清洗并计数。血浆、红细胞、淋巴细胞制备完成后，立即检测或液氮速冻后转至-80℃保存。

2. 试剂制备：

（1）0.1%DEPC水：使用去离子水配制0.1%DEPC水，混匀过夜，121℃高温高压20min，去除残余的DEPC，4℃保存。

（2）0.3 M HCl：移取25.2ml浓HCl至适量0.1%DEPC水中，定容至1000ml，4℃保存。

（3）0.6 M KOH：称取33.6g KOH至适量0.1%DEPC水中，定容至1000ml，4℃保存。

（4）0.36 M TEA-HCl ：称取66.8g TEA-HCl至适量0.1%DEPC水中，定容至1000ml，调整PH至7.4，4℃保存。

（5）NAD

（6）NAD

（7）TEA-Buffer：使用0.1%DEPC水1 :10稀释TEA，调整 pH 至 7.4，4℃保存。

（8）PMS：使用0.1%DEPC水配制成10 mg/mL 溶液，-20℃保存。

（9）MTT：使用0.1%DEPC水配制成1 mg/mL 溶液，-20℃保存。

3. r-SBFA 标准品制备

使用0.1% DEPC水配制含TEA-HCl、NaCl、NaHCO

4. β-NAD 标准品制备

（1） β-NAD 原液：使用0.1%DEPC水配制β-NAD 原液，浓度为1 mg/mL ，保存至-80℃。

（2） β-NAD 工作液：使用0.1%DEPC水稀释β-NAD 原液至1ug/mL。

（3） Standard 1~Standard 6配制：Standard 1 即1000 µL 1ug/mL β-NAD工作液，Standard 2由500µL Standard 1 + 500 µL 0.1%DEPC水稀释而成，Standard 3~Standard 6按同样的方法以此稀释。

5. 反应液制备：按照下表体系配制反应液，现用现配。

6. NAD

（1）加NAD

A. 300ul血浆样本+300ul NAD

B. 红细胞样本+300ul NAD

C. 淋巴细胞样本+300ul NAD

D. 300ul Standard 1~Standard 6+300ul NAD

E. 300ul 空白对照+300ul NAD

（2）孵育

60℃孵育10min。

（3）平衡

迅速冰浴10min。

（4） 加NAD

所有样本中加适量NAD

7. 干扰物质去除

A. 血浆NAD

B. 淋巴细胞NAD

C. 红细胞NAD

血浆和淋巴细胞取上清备用，红细胞取超滤管底层液体备用。

8. NAD

样本在上样前Standard 1~Standard 6和空白对照中加入 r-SBFA，模拟血液环境；血浆、红细胞、淋巴细胞样本中加入0.1% DEPC水，模拟β-NAD标准品溶媒环境。

在酶标板相应的孔中分别加入50 µLStandard 1~Standard 6、空白对照、血浆样本、红细胞样本、淋巴细胞样本，再加入150 µL反应液混匀后置于酶标仪检测，检测波长565nm，检测时间30min，反应温度25℃。

9. 数据校准

红细胞和淋巴细胞的NAD

（1）按细胞数量计算

NAD

（2）按样本蛋白浓度计算

NAD

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。