通过微生物水解由家禽羽毛生产角蛋白微纤维和蛋白水解产物的方法

技术领域

本发明涉及将羽毛材料转化为富含角蛋白的微纤维和可溶性蛋白水解产物的方法，该方法包括使用微生物水解技术。

背景技术

在过去的几十年中，全球对使用可再生资源设计和制造新材料的兴趣有所增加。工业界和社会都在寻找可以替代传统油基材料同时又对环境更加友好的材料。最近的趋势是开发能够从线性经济转变为循环经济的解决方案，其中可以将废物作为资源加以利用，从而产生经济和环境效益。一个这样的实例是利用全球丰富的来自鸡肉业的废弃羽毛(每年约500万吨)作为便宜且可再生的纤维源来增强材料(Aranberri等人，2017；

羽毛纤维可用于制造绝缘材料、生物吸附剂、膜、细胞支架等。这些纤维具有强化增强复合材料的生物可降解性、弹性、疏水性和密度的潜力，显示出在建筑、医药、化妆品和农业领域的广泛材料应用。(Tesfaye等人，2017；Reddy,2015)

在绿色建筑应用中，完整的原始羽毛作为便宜的可再生材料被用于增强混凝土的密度和机械性能。(Manginsay,G.P.,Guinita-Cabahug,R.,2015)。设计了几种机械方法由家禽羽毛制备细纤维(Meyerhoeffer和Showalter,2002；Graeter,1998)，但是细纤维的尺寸范围大且变化多以及质量回收率低成为了成本效率工艺的障碍。(Tesfaye等人，2017)

羽毛增强材料通常显示出改善的机械性能；但是，纤维的浓度和尺寸影响纤维与材料相之间的界面粘合。(Supri等人,2015；Büyükkaya,2017)

近年来，来自不同种类蛋白质的微纤维/纳米纤维引起了人们的极大兴趣，但是不能应用通常用于制造它们的电纺丝方法，除非在化学溶解角蛋白结构之后。除了对环境造成负面影响外，这项技术既昂贵又难以放大规模进行大量材料的生产。(Molins等人，2012)

热化学角蛋白水解方法也用于羽毛废料的饲料应用。然而，所产生的水解物“羽毛粉”的低营养价值降低了这些方法的工业关注度。(Papadopoulos,1985)

大多数纤维应用，尤其是纤维增强材料(如木质或塑料复合材料)的生产，都要求纤维在微尺寸范围内。迄今为止，由羽毛材料以高产率获得微纤维一直是一个挑战，这个问题严重限制了它们在工业中的使用。

本文提出的方法是一种温和的基于生物的技术，用于生产角蛋白微纤维结构以及水溶性角蛋白寡肽和氨基酸。

发明概述

本发明涉及衍生自家禽羽毛材料的富含角蛋白的微纤维。由于其尺寸，本公开的富含角蛋白的微纤维相对于先前公开的微纤维是特别有利的。实际上，发明人已经发现，通过简单地用细菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)水解湿羽毛材料，获得了长度为20至200μm的富含角蛋白的微纤维。本文提出的方法是一种温和的基于生物的技术，其中微生物菌株短小芽孢杆菌的生长将家禽羽毛部分地水解成其微纤维结构。此外，该方法还释放出一部分水溶性角蛋白寡肽和氨基酸，其可用于生产饲料材料和/或肥料。

本公开的一个方面涉及一种包含角蛋白微纤维的微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述角蛋白微纤维的长度为20μm至200μm并且直径为1μm至10μm，并且其中所述角蛋白微纤维包括中空圆柱体结构。

本公开的一个方面涉及一种包含富含角蛋白的微纤维的微纤维组合物，其中所述富含角蛋白的微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述微纤维的长度为20μm至200μm。

本公开的另一方面涉及一种由羽毛材料生产角蛋白微纤维的方法，该方法包括：

a)提供发酵培养基；

b)以至少25克干重/L发酵培养基的浓度提供羽毛材料；

c)提供降解角蛋白的细菌；

d)使发酵培养基、羽毛材料和降解角蛋白的细菌接触，从而使羽毛材料发酵以获得发酵组合物；

e)将步骤d)中获得的发酵组合物分离为一个上清液部分和一个沉淀物部分，其中在分离步骤中获得的沉淀物部分包含角蛋白微纤维，

从而获得角蛋白微纤维，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述微纤维的长度为20μm至200μm。

本公开的一个方面涉及通过本公开的方法获得的角蛋白微纤维组合物。

本公开的另一方面涉及一种由羽毛材料生产微纤维的方法，该方法包括：

a)提供羽毛材料；和

b)发酵羽毛材料以获得包含微纤维的组合物。

本公开的另一方面涉及一种生产蛋白水解产物的方法，其中该方法包括

a.提供羽毛材料；和

b.发酵羽毛材料以获得包含蛋白水解产物的组合物。

在另一方面，本发明涉及包含通过本文公开的方法可获得的蛋白水解物的组合物。

此外，本公开的一个方面涉及本文公开的组合物作为饲料产品的用途。

在另一方面，本公开涉及本文公开的微纤维组合物和/或通过本文公开的方法可获得的微纤维组合物在制造复合材料中的用途。

本公开的另一方面涉及一种用于从羽毛材料提取微纤维的系统，其包括发酵反应器，所述系统被布置用于执行本文公开的生产微纤维的方法。

本公开的又一个方面涉及一种用于提取微纤维的多部分试剂盒(kit of parts)，其包含细菌菌株短小芽孢杆菌FH9和使用说明书。

附图说明

图1：显示了羽毛的物理结构：鸟羽毛的宏观和微观结构(一般示例，其中放大图解释了微观部分。(从Stettenheim 2000修改而来)。图例：1：羽片(vane)；2：羽轴(rachis)；3：羽支(barb)；4：羽小枝(barbule)；5：羽小钩(hooklet)(节(node))；6：节间(internode)。

图2：用于获得纯微纤维和蛋白水解产物的羽毛水解工艺流程图：

A)在基础培养基中使种子培养物生长12-18小时

B)羽毛发酵水解24-80小时(24小时)。干羽毛浓度为50-60g/L

C)高速离心或微滤分离可溶性角蛋白水解产物

D)在室温下混合10-30分钟，在水中洗涤纤维

E)通过低速离心或微滤将纤维从细胞中分离出来

F)在步骤D)和E)中重复洗涤和分离回收的微纤维

G)回收细胞并将其用作植物/土壤肥料

H)对回收的纯微纤维进行干燥。

图例：7：种子培养物；8：湿羽毛；9：水解；10：可溶性水解产物；11：粗微纤维；12：混合和洗涤；13：细菌细胞；14：纯微纤维；15：干燥图3：用于获得粗微纤维的羽毛水解工艺流程图，包括细胞回收：

A)在基础培养基中使种子培养物生长12-18小时

B)羽毛发酵水解24-80小时(24小时)。干羽毛浓度为50-60g/L

C)低速离心或微滤分离可溶性角蛋白水解产物

D)回收细胞并将其用作下一水解批次的接种物或用作植物/土壤肥料

E)对回收的粗微纤维进行干燥。

图例：7：种子培养物；8：湿羽毛；9：水解；10：可溶性水解产物；11：粗微纤维；15：干燥

图4：来自家禽羽毛的微纤维：A)干粉形式的回收的微纤维，B)微纤维的显微图，C)高倍率(100倍透镜)的微纤维的显微图。

图5：微纤维复合材料浇铸：A)通过直接浇铸回收的微纤维并在60℃下干燥24h制成的同质复合材料；B)PHA-微纤维复合材料(9:1)，在室温下干燥；C)Capa-微纤维复合材料(9:1)，在室温下干燥。

图6：代表性CABA-角蛋白微纤维(A和B)和PHB-角蛋白微纤维(C和D材料。

发明详述

本公开的一个方面涉及一种包含角蛋白微纤维的微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述角蛋白微纤维的长度为20μm至200μm，并且直径为1μm至10μm，并且其中所述角蛋白微纤维包括中空圆柱体结构。

本公开的一个方面涉及一种包含富含角蛋白的微纤维的微纤维组合物，其中所述富含角蛋白的微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述微纤维的长度为20μm至200μm。

在另一方面，本公开涉及一种包含通过本文公开的方法可获得的微纤维的组合物。

本文所用的术语“富含角蛋白的微纤维”和“角蛋白微纤维”是指包含75％的角蛋白并且包含羽毛典型的中空圆柱体结构的微纤维。

本公开的角蛋白微纤维的尺寸和组成以及它们的包括羽毛典型的中空圆柱体结构的三维(3D)结构一起确保了本文公开的微纤维具有低密度和低重量，特别是与通过机械和化学方法(例如包括溶解羽毛材料、使溶解的羽毛材料沉淀和使沉淀的羽毛材料再聚合的方法)获得的角蛋白颗粒相比更低的密度和更低的重量。因此，本公开的微纤维是用于制造复合材料(例如木质复合材料和塑料复合材料)的理想成分。由于它们的尺寸和组成，本公开的富含角蛋白的微纤维容易与用于制造塑料的大多数聚合物共混，从而允许容易地生产纤维增强塑料。

当在复合材料中使用微纤维时，本公开的微纤维的尺寸也是有利的。与更长的纤维和颗粒相比，这种尺寸范围的微纤维具有更大的弹性。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含至少75％干重的角蛋白。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含75％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如80％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如85％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如75％干重的角蛋白至90％干重的角蛋白。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含约90％干重的角蛋白。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，其长度为20μm至200μm，例如长度为25μm至200μm，例如30μm至200μm，例如35μm至200μm，例如40μm至200μm，例如50μm至200μm，例如60μm至200μm，例如70μm至200μm，例如80μm至200μm，例如90μm至200μm，例如100μm至200μm，例如20μm至180μm，例如20μm至150μm，例如20μm至120μm，例如20μm至100μm，例如20μm至90μm，例如20μm至80μm，例如20μm至70μm，例如20μm至60μm，例如30μm至150μm。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含长度为30μm至150μm的富含角蛋白的微纤维。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维的长度为至少20μm，例如长度为至少25μm，例如长度为至少30μm，例如长度为至少35μm，例如长度为至少40μm，例如长度为至少50μm，例如长度为至少60μm，例如长度为至少70μm，例如长度为至少80μm，例如长度为至少90μm，例如长度为至少100μm。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维的长度为至多60μm，例如长度为至多70μm，例如长度为至多80μm，例如长度为至多90μm，例如长度为至多100μm，例如长度为至多120μm，例如长度为至多150μm，例如长度为至多180μm，例如长度为至多200μm。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维的直径或宽度为1μm至10μm，例如1μm至6μm，例如2μm至6μm，例如3μm至6μm，例如4μm至6μm，例如5μm至6μm，例如1μm至5μm，例如1μm至4μm，例如1μm至3μm，例如1μm至2μm。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含直径或宽度为2μm至6μm的富含角蛋白的微纤维。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维的直径或宽度为约1μm，例如直径或宽度为约2μm，例如直径或宽度为约3μm，例如直径或宽度为约4μm，例如直径或宽度为约5μm，例如直径或宽度为约6μm，例如直径或宽度为约7μm，例如直径或宽度为约8μm。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含不溶于水性溶液的角蛋白微纤维。这归因于用于制造微纤维的工艺及其结构特征。这特别有利于所述微纤维组合物的大多数用途，特别是有利于微纤维组合物在复合材料中的用途，因为通常需要在高湿度和水性条件下的稳定性。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含角蛋白微纤维，其水溶性低或无水溶性。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含角蛋白微纤维，其在水性条件下(例如在高湿度下)是稳定的。

测量微纤维的长度和直径的方法是本领域已知的。例如，可以通过在透射电子显微镜(TEM)下观察获得的粗微纤维或纯化的微纤维的样品来估计纤维的直径和长度。存在确定或估计纤维长度和直径的其他方法和仪器，例如可以使用Zetasizer Nano-Z(MalvernInstruments)通过动态光散射来测量纳米颗粒的尺寸。存在甚至更多的确定或估计纤维长度和直径的方法，并且它们是本领域技术人员已知的。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含中空圆柱体结构。

实际上，本公开的富含角蛋白的微纤维是由家禽羽毛材料获得的，其特征在于各种直径的中空圆柱体结构，大部分直径或宽度为1μm至10μm。这些结构通常被称为羽支和羽小枝(见图1)。特别地，将羽小枝连接到羽支，并且相邻羽小枝之间的距离为20μm至50μm，通常约为30μm。羽小枝的特征是具有较小的纤维，称为节间，与羽小钩(节)连接在一起。羽小枝上的相邻羽小钩之间的平均距离为20μm至50μm。本公开的富含角蛋白的微纤维包含羽支和羽小枝段，其中每一个所述段包含一个至六个节间。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含至少一个节间且至多六个节间，例如至少一个节间且至多五个节间。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含75％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如80％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如85％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如75％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白，例如80％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白，例如85％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白。

在一个实施方案中，根据本公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含本文所述量的蛋白质、水和脂质。

在一个实施方案中，根据本公开的微纤维组合物包含富含角蛋白的微纤维，所述富含角蛋白的微纤维包含0.1％干重的脂质至2％干重的脂质，例如约1％干重的脂质。

在一个实施方案中，本文公开的微纤维组合物是本文公开的方法的产物。

本公开涉及富含角蛋白的微纤维和使用细菌水解生产所述富含角蛋白的微纤维的方法。本申请发明人发现，单个发酵步骤(其中在降解角蛋白的细菌的帮助下进行发酵)足以水解羽毛材料并因此获得富含角蛋白的微纤维。然后，采用简单的分离方法就足以将发酵组合物分成包含粗微纤维的沉淀物和包含蛋白水解产物的上清液。发明人已经优化了发酵条件，并且发现需要初始浓度为至少25克干重/升发酵培养基、优选40-60g/L的羽毛材料来引导水解朝向生产角蛋白微纤维，而不是朝向生产富含氨基酸的水解产物。本公开的方法使初始羽毛材料转变成约50至90％干重的微纤维和10至50％的蛋白水解产物。而且，1％至11％干重的初始羽毛材料未被转化。

在一些实施方案中，以30g干重/L或更高，例如35g干重/L或更高，例如40g干重/L或更高，例如50g干重/L或更高，例如40-60g干重/L发酵培养基的浓度提供羽毛材料。

在一些实施方案中，羽毛材料是降解角蛋白的细菌的唯一碳源和/或氮源。

在一些实施方案中，提供的发酵培养基不含碳源和/或氮源。因此，羽毛材料是降解角蛋白的细菌唯一可用的碳源和/或氮源。

羽毛材料将刺激降解角蛋白的细菌产生必要的酶，以将羽毛水解为微纤维。

在一些实施方案中，本文公开的方法将初始羽毛材料转化成约50％干重的粗微纤维和约45％的蛋白水解产物，例如约55％干重的粗微纤维和约40％的蛋白水解产物，例如约60％干重的粗微纤维至约35％的蛋白水解产物，例如约65％干重的粗微纤维至约30％的蛋白水解产物，例如约70％干重的粗微纤维至约25％的蛋白水解产物，例如约80％干重的粗微纤维至约15％的蛋白水解产物，其中1-11％干重的初始羽毛材料未被转化。

但是，如果本文公开的方法的条件发生实质性变化，则该方法的结果可能有所不同，并且可能获得不同比例的微纤维与蛋白水解产物。例如，从初始浓度低于25克干重/L发酵培养基、优选为20克干重/L或更小的羽毛材料开始，该羽毛材料在很大程度上被水解为蛋白质和/或氨基酸，而不是微纤维，这意味着羽毛材料可能发生完全水解。

本公开的一个方面涉及一种由羽毛材料生产角蛋白微纤维的方法，该方法包括：

a)提供发酵培养基；

b)以至少25克干重/L发酵培养基的浓度提供羽毛材料；

c)提供降解角蛋白的细菌；

d)使发酵培养基、羽毛材料和降解角蛋白的细菌接触，从而使羽毛材料发酵以获得发酵组合物；

e)将步骤d)中获得的发酵组合物分离为一个上清液部分和一个沉淀物部分，其中在分离步骤中获得的沉淀物部分包含角蛋白微纤维，

从而获得角蛋白微纤维，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述微纤维的长度为20μm至200μm。

因此，本公开的另一方面涉及一种由羽毛材料生产富含角蛋白的微纤维的方法，该方法包括：

a)提供羽毛材料；和

b)使羽毛材料发酵以获得包含微纤维的组合物。

通过本文所公开的方法获得的富含角蛋白的微纤维在上文“富含角蛋白的微纤维”部分中详细描述。

在一个实施方案中，通过根据本公开的方法获得的微纤维是富含角蛋白的微纤维。

发酵组合物包含微纤维以及蛋白水解产物和发酵细胞。因此，将微纤维与组合物的剩余部分分离是有益的。在一个实施方案中，本公开的方法还包括分离步骤。例如，所述分离步骤可以包括离心和/或过滤。例如，可以进行一次或多次高速离心。离心的替代方法是过滤。微滤可以适合用于仅一步或仅几步就将获得的富含角蛋白的微纤维与发酵组合物的剩余部分分离。因此，在本公开的一个实施方案中，分离步骤在发酵步骤之后进行。

本公开的方法的分离步骤将产生一个上清液部分和一个沉淀物部分。在本文公开的分离步骤中获得的沉淀物部分包含微纤维，例如粗微纤维。在一些实施方案中，取决于所使用的分离方法，在本文公开的分离步骤中获得的沉淀物部分还包含发酵细胞。

分离步骤之后获得的粗微纤维可以不经任何进一步纯化而使用，例如用于生产用作建筑材料的复合材料。粗微纤维可以例如不经进一步纯化就用于生产木质复合材料、塑料复合材料和同质复合材料(homocomposite)。

然而，本公开的富含角蛋白的微纤维的一些应用可能需要高度的纯度。因此，在一个实施方案中，本公开的方法还包括纯化沉淀物部分例如粗微纤维的步骤。

粗微纤维的纯化可以通过应用一个或多个分离循环，例如一个或多个离心步骤，或一个或多个过滤步骤，或一个或多个离心步骤与一个或多个过滤步骤的组合而容易地获得。

在一个实施方案中，根据本公开的方法的纯化步骤包括重悬沉淀物部分。例如，可以将粗微纤维重悬在水中或另一种合适的液体溶液中。

在一个实施方案中，根据本公开的纯化步骤包括洗涤沉淀物部分和/或将沉淀物部分与水或在另一种合适的液体溶液中混合。例如，可以将粗微纤维与水或在另一种合适的液体溶液中混合并洗涤，以使其充分重悬。

在一个实施方案中，根据本公开的方法的纯化步骤包括a.用水重悬沉淀物部分，和/或用水洗涤沉淀物部分，和/或将沉淀物部分与水混合；b.离心和/或过滤经重悬、洗涤和/或混合的沉淀物部分。

在一个实施方案中，根据本公开的方法的纯化步骤包括离心和/或过滤经重悬、洗涤和/或混合的沉淀物部分。如果使用离心，则可以有利地应用不同速度的不同离心步骤，从而使富含角蛋白的微纤维与发酵细胞和可溶性物质分离。

在一个实施方案中，根据本公开的方法的纯化步骤产生一个上清液部分和一个沉淀物部分。在根据本公开的方法的纯化步骤中获得的沉淀物部分包含纯化的角蛋白微纤维。在根据本公开的方法的纯化步骤中获得的上清液部分包含发酵细胞。

在一个实施方案中，任选地对沉淀物部分重复根据本公开的方法的纯化步骤至少两次，例如至少三次或更多次，或直至获得所需程度的微纤维纯度，所述沉淀物部分包含最初的粗微纤维和然后纯化的微纤维。

第一纯化步骤之后获得的上清液部分包含发酵细胞。上清液部分可以这样再循环到发酵罐或种子培养物反应器中，使得发酵细胞在随后的发酵中被重新使用。例如，可以将上清液部分再循环至发酵罐，因此将不需要种子培养物反应器。第一纯化步骤之后获得的上清液部分可以包括在大量水中的发酵细胞，并且在将细胞重新用于发酵之前除去所述水可能是有益的。

在根据本公开的方法的纯化步骤中获得的沉淀物部分包含纯化的微纤维，并且还可以包含水。取决于预期的应用，可能期望从包含微纤维的沉淀物部分中除去任何残留的水。类似地，从分离步骤获得的粗微纤维也可以包含残留的水，其可以被有利地除去。

因此，在一个实施方案中，本公开的方法还包括对从分离步骤和/或从纯化步骤获得的沉淀物部分进行干燥的步骤。在一个实施方案中，本公开的方法进一步包括对从分离步骤和/或从纯化步骤获得的上清液部分进行干燥的步骤。

干燥步骤应小心进行，并且在不损害富含角蛋白的微纤维和/或发酵细胞的条件下进行。本领域技术人员知道哪些干燥方法可用，并且能够基于普通知识选择适当的方法。

在根据本公开的方法的分离步骤中获得的上清液部分包含蛋白水解产物。例如，蛋白水解产物可以包含可溶性蛋白质、氨基酸和/或寡肽。所获得的蛋白水解产物是所公开方法的副产物；然而，蛋白水解产物也是有价值的产品。分离步骤之后获得的蛋白水解产物还可以包含发酵细胞，并且可以以多种方式使用，例如，可以将其再循环到发酵反应器中，从而带来可用于发酵中的蛋白质和氨基酸。蛋白水解产物也可以进一步加工成饲料产品，或者加工成土壤或植物肥料。

因此，在一个实施方案中，根据本公开的方法还包括将获得的蛋白水解产物加工成饲料产品和/或植物或土壤肥料的步骤。

本公开涉及使用羽毛材料生产角蛋白微纤维，例如富含角蛋白的微纤维，以及任选的蛋白水解产物。

在本公开的一个实施方案中，羽毛材料包括羽毛的羽根(quill)和/或羽片。实际上，本公开的方法能够将羽毛的羽片部分和羽根部分两者都水解为微纤维。

在本公开的一个实施方案中，进料至本公开的方法的羽毛材料包括羽毛或由羽毛组成。例如，这些羽毛可以选自有羽片的羽毛(vaned feathers)、绒羽(down feathers)、正羽(pennaceous feathers)、廓羽(contour feathers)、纤羽(filoplume)、飞羽(remiges)和翼羽(flight feathers)。

在本公开的一个实施方案中，羽毛是有羽片的羽毛或绒羽。

在本公开的一个实施方案中，羽毛来自家禽。优选地，羽毛来自鸡和/或火鸡。不同类型的羽毛以不同的氨基酸含量为特征。例如，与鸡羽毛相比，火鸡羽毛富含半胱氨酸和半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。与火鸡羽毛相比，鸡羽毛的赖氨酸和甲硫氨酸含量更高。

在一个实施方案中，根据本公开的方法还包括机械处理的步骤，其中对羽毛材料的固体部分进行机械处理以减小尺寸。例如，机械处理可以包括湿磨或由湿磨组成。

不需要将羽毛材料弄碎；但是，根据发酵反应器的尺寸，具有小段的羽毛材料可能是有益的。

因此，在一个实施方案中，根据本公开的方法还包括机械处理的步骤，并且所述机械处理在包括切碎机泵、一个或多个旋转刀和/或一个或多个切碎刀的设备中进行。所述任选的机械处理步骤可以在发酵步骤之前进行。

为了将羽毛材料转化为如本文所公开的富含角蛋白的微纤维，需要发酵步骤。所述发酵步骤包括通过降解角蛋白的微生物，优选地通过降解角蛋白的细菌水解羽毛材料。

因此，在一个实施方案中，发酵步骤包括通过降解角蛋白的微生物发酵羽毛材料。在本公开的一个实施方案中，降解角蛋白的微生物或细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)。例如，降解角蛋白的微生物或细菌可以是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。根据本公开的适于进行羽毛材料水解的芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌FH9，其在2014年3月24日保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen und ZellkulturenGmbH)，保藏编号为DSM 28594。

短小芽孢杆菌的细胞特征等同于芽孢杆菌属的其他物种，包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。因此，可以用这些细菌细胞进行发酵步骤。

在一个实施方案中，根据本公开的方法中的发酵步骤是需氧的。发酵步骤的温度为30℃至42℃，例如32℃至38℃，例如34℃至38℃，例如36℃至38℃，例如37℃。在一个实施方案中，发酵步骤的温度为约37℃。

根据本公开的方法中的发酵步骤的pH为pH 5至pH 8，例如pH 6至pH9，例如pH 6.5至pH 8.5，例如pH 8。在一个实施方案中，发酵步骤的pH为pH 8。

根据本公开的方法的发酵时间为12h至96h，例如12h至84h，例如24h至84h，例如36h至84h，例如48h至72h，例如24h。在一个实施方案中，发酵时间为24h。

对本文公开的发酵条件和培养基组成进行优化，以将羽毛材料转化为富含角蛋白的微纤维，并获得高产率的微纤维。改变这些条件可以产生不同产率的微纤维，以及不同产率的蛋白水解产物。

在一个实施方案中，发酵步骤包括机械搅拌。例如，发酵步骤可以在搅拌釜发酵罐中进行。这种机械搅拌可以有助于破裂羽毛材料并因此促进细菌水解。

在一个实施方案中，发酵步骤包括添加降解角蛋白的微生物或细菌的预培养物。所述预培养物可以来自种子培养物反应器。

在一个实施方案中，根据本公开的方法还包括灭菌步骤和/或加热步骤。例如，在发酵步骤之前对羽毛材料进行灭菌和/或加热步骤。以这种方式，从羽毛材料中消除了任何潜在的病原性和/或任何其他污染性微生物，并且降低了或消除了将竞争性微生物引入发酵罐的风险。这产生了无病原体的产物，并防止了发酵反应器的污染，并使羽毛材料更高效且安全地水解。

本文公开的方法还可以包括另外的可选步骤。

在一个实施方案中，根据本公开的方法还包括在发酵步骤之后对微纤维和/或蛋白水解产物进行灭菌和/或加热步骤。仅当微纤维和/或蛋白水解产物将要用于需要无菌材料的应用(例如化妆品、药品和食品工业等)时，这才是必需的。

当存在时，可以通过高压灭菌、巴氏灭菌、超高压灭菌(pascalization)、电离辐射、UV辐射或抗生素处理来进行灭菌。应注意不要使用损坏蛋白质和氨基酸的条件。

在一个实施方案中，根据本公开的方法包括：

a.提供羽毛材料；

b.使羽毛材料与发酵培养基和降解角蛋白的细菌接触；

c.使羽毛材料发酵以获得包含微纤维和蛋白水解产物的组合物；

d.将步骤c)中的组合物分离成上清液部分和沉淀物部分，其中沉淀物部分包含粗微纤维，和

e.任选地纯化沉淀物部分以获得纯化的微纤维。

如果存在，本文上面公开的方法的步骤d.包括将沉淀物部分分离成纯化的微纤维和上清液。

在一个实施方案中，本文描述的方法中获得的(并且特别是由步骤c.和/或步骤d.得到的)上清液部分包括发酵细胞，并且可以再循环至发酵步骤。

在一个实施方案中，本文描述的方法中获得的(并且特别是由步骤c得到的)上清液部分可以进一步加工成肥料。或者，本文描述的方法中获得的(并且特别是由步骤c得到的)上清液部分可以进一步加工成饲料产品。

本公开的另一方面涉及生产蛋白水解产物的方法，其中该方法包括

a.提供羽毛材料；和

b.使羽毛材料发酵以获得包含蛋白水解产物的组合物。

如上所述，本公开的方法包括将羽毛材料转化为富含角蛋白的微纤维，并且作为副产物获得蛋白水解产物。所述蛋白水解产物可以是有价值的产品，并且本文描述了其进一步的加工和可能的应用。

特别地，所获得的蛋白水解产物可以具有的蛋白质含量为按重量计至少75％的蛋白质，例如按重量计至少80％的蛋白质，例如按重量计至少85％的蛋白质。

此外，获得的蛋白水解产物可以包含至少15种不同的氨基酸，例如至少16种不同的氨基酸，例如至少17种不同的氨基酸，例如至少18种不同的氨基酸，例如至少19种不同的氨基酸，例如约20种不同的氨基酸。因此，回收所述蛋白水解产物是有价值的。

本公开的另一方面涉及一种用于从羽毛材料中提取微纤维的系统，其包括发酵反应器，所述系统被布置用于执行本文公开的生产微纤维的方法。

在一个实施方案中，本公开的系统任选地包括布置在发酵反应器之前的用于机械处理的设备。如上文“羽毛材料”部分中所述，可以使用各种用于机械处理的设备。

在一个实施方案中，本公开的系统包括发酵反应器，其布置用于使羽毛材料发酵以获得微纤维。所述发酵反应器可以例如是具有机械搅拌的反应器，例如搅拌釜反应器。

在一个实施方案中，本公开的系统包括发酵反应器，其中使羽毛材料发酵是通过降解角蛋白的微生物或细菌来进行的。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括预培养反应器，其被布置用于预培养降解角蛋白的微生物或细菌。所述预培养反应器或种子培养物反应器方便地连接至发酵罐，使得降解角蛋白的微生物或细菌从预培养反应器转移至发酵罐。因此，在一些实施方案中，将预培养反应器连接至发酵反应器以提供降解角蛋白的微生物或细菌。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括分离装置，其配置为使获得的发酵组合物的可溶性部分与不溶性部分分离。可溶性部分或上清液可以包含蛋白水解产物和发酵细胞。不溶性部分或沉淀物包含粗微纤维。在一个实施方案中，所述分离装置包括一个或多个离心机和/或一个或多个过滤装置。所述分离装置已经在本文中例如在“羽毛材料的水解”部分中进行了描述。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括一个或多个纯化装置，其配置为从发酵组合物的不溶性部分中纯化微纤维。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括一个或多个纯化装置，其中所述纯化装置包括(i)反应器，其被配置用于洗涤和混合发酵组合物的不溶性性部分，和(ii)另外的分离装置，其被配置用于在将发酵组合物的不溶部分混合并洗涤后，从发酵组合物的不溶性部分中分离发酵细胞。所述纯化装置已经在本文中例如在“羽毛材料的水解”部分中进一步描述。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括一个或多个循环装置，例如泵，其被配置为使流体在系统的各部分之间向前流动。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括一个或多个循环装置，可以是泵，并且可以被配置为使流体以回流的方式从一个或多个分离装置通向预培养反应器和/或发酵反应器。因此，本公开的系统还可以包括将分离装置连接至发酵罐和/或预培养反应器的连接装置。本公开的系统还可以包括将纯化装置连接至发酵罐和/或预培养反应器的连接装置。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括风扇、干燥器和/或旋风分离器，其被配置成从所获得的发酵组合物和/或从分离自所获得的发酵组合物的不溶性部分中除去水。干燥步骤的好处在上面的“羽毛材料的水解”部分中进一步描述。例如，干燥器可以是喷雾干燥器、箱式干燥器或冷冻干燥器。

在一个实施方案中，本公开的系统还包括一个或多个被配置为执行灭菌的灭菌反应器。例如，灭菌反应器可以被配置成在将所述羽毛材料添加到发酵罐之前对羽毛材料进行灭菌。

在一个实施方案中，本公开涉及一种系统，该系统包括：

a.发酵反应器，其被配置用于水解羽毛材料，所述发酵反应器连接到

b.分离装置，其被配置用于将上清液部分与沉淀物部分分离，所述分离装置通过将上清液部分从分离装置再循环至发酵反应器的装置连接至发酵反应器，其中所述沉淀物部分包含粗微纤维，

c.任选地，纯化装置，其被配置用于纯化沉淀物部分，其中所述纯化装置将沉淀物部分分离成包含微纤维的组合物和包含发酵细胞的组合物，并且其中所述纯化装置任选地通过将发酵细胞从纯化装置再循环到发酵反应器的装置连接到发酵反应器，

d.干燥器，其被配置用于干燥沉淀物部分和/或包含微纤维的组合物。

本公开的另一方面涉及一种用于提取微纤维的多部分试剂盒，其包括细菌菌株短小芽孢杆菌FH9和使用说明书。

在一些实施方案中，本公开的多部分试剂盒还包含盐，例如适合用于培养细菌菌株短小芽孢杆菌FH9的培养基组分。例如，本公开的多部分试剂盒可以包含适合用于培养细菌菌株短小芽孢杆菌FH9同时不含碳源和/或氮源的培养基组分。

说明书可以包括对本文公开的生产微纤维的方法的描述和/或对本文公开的从羽毛材料中提取微纤维的系统的描述。

细菌菌株短小芽孢杆菌FH9在“发酵”部分中详细描述。

在另一方面，本公开涉及本文公开的和/或通过本文公开的方法可获得的微纤维组合物在制造复合材料中的用途。

例如，包含富含角蛋白的微纤维的组合物可以用于生产基于木质的复合材料。包含富含角蛋白的微纤维的组合物还可以用于生产基于塑料的复合材料，例如通过将富含角蛋白的微纤维与通常用于生产塑料的聚合物共混。包含富含角蛋白的微纤维的组合物还可以用于生产同质复合材料，例如主要包含富含角蛋白的微纤维的材料。

本公开的另一方面涉及本文公开的包含蛋白水解产物的组合物作为饲料产品的用途。包含蛋白水解产物的组合物还可以用于生产植物或土壤肥料。值得注意的是，如果将包含蛋白水解产物的组合物用于生产肥料，则该组合物还包含发酵细胞可能是有益的，所述发酵细胞可以有助于施肥作用。

本公开的或通过本公开的方法获得的角蛋白微纤维的特征在于具有低密度、低重量和良好的隔音性能，这归因于它们的特定尺寸和其特征在于存在羽毛典型的中空圆柱体结构的三维结构。

1.一种包含角蛋白微纤维的微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述角蛋白微纤维的长度为20μm至200μm并且直径为1μm至10μm，并且其中所述角蛋白微纤维包括中空的圆柱体结构。

2.根据项目1所述的角蛋白微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含75％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如80％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如85％干重的角蛋白至100％干重的角蛋白，例如75％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白，例如80％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白，例如85％干重的角蛋白至95％干重的角蛋白。

3.根据前述项目任一项所述的角蛋白微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维的长度为25μm至200μm，例如30μm至200μm，例如35μm至200μm，例如40μm至200μm，例如50μm至200μm，例如60μm至200μm，例如70μm至200μm，例如80μm至200μm，例如90μm至200μm，例如100μm至200μm，例如20μm至180μm，例如20μm至150μm，例如20μm至120μm，例如20μm至100μm，例如20μm至90μm，例如20μm至80μm，例如20μm至70μm，例如20μm至60μm，例如30μm至150μm。

4.根据前述项目任一项所述的角蛋白微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维的直径为1μm至6μm，例如2μm至6μm，例如3μm至6μm，例如4μm至6μm，例如5μm至6μm，例如1μm至5μm，例如1μm至4μm，例如1μm至3μm，例如1μm至2μm。

5.根据前述项目任一项所述的角蛋白微纤维组合物，其中每个角蛋白微纤维包含至少一个节间且至多七个节间，例如至少一个节间且至多六个节间，例如至少一个节间且至多五个节间。

6.根据前述项目任一项所述的角蛋白微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含75％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如80％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如85％干重的蛋白质至100％干重的蛋白质，例如75％干重的蛋白质至90％干重的蛋白质。

7.根据前述项目任一项所述的角蛋白微纤维组合物，其中所述角蛋白微纤维包含0.1％干重的脂质至2％干重的脂质，例如约1％干重的脂质。

8.一种用于由羽毛材料生产角蛋白微纤维的方法，该方法包括：

a)提供发酵培养基；

b)以至少25克干重/L发酵培养基的浓度提供羽毛材料；

c)提供降解角蛋白的细菌；

d)使发酵培养基、羽毛材料和降解角蛋白的细菌接触，从而使羽毛材料发酵以获得发酵组合物；

e)将步骤d)中获得的发酵组合物分离为一个上清液部分和一个沉淀物部分，其中在分离步骤中获得的沉淀物部分包含角蛋白微纤维，

从而获得角蛋白微纤维，其中所述角蛋白微纤维包含至少75％干重的角蛋白，并且其中所述微纤维的长度为20μm至200μm。

9.根据项目8所述的方法，其中分离步骤包括离心和/或过滤。

10.根据项目8至9中任一项所述的方法，其中分离步骤在发酵步骤之后进行。

11.根据项目8至10中任一项所述的方法，其中分离步骤产生一个上清液部分和一个沉淀物部分。

12.根据项目8至11中任一项所述的方法，其中分离步骤中获得的沉淀物部分包含微纤维，例如粗微纤维。

13.根据项目8至12中任一项所述的方法，其中分离步骤中获得的沉淀物部分还包含发酵细胞。

14.根据项目8至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化沉淀物部分的步骤。

15.根据项目8至14中任一项所述的方法，其中纯化步骤包括重悬沉淀物部分。

16.根据项目8至15中任一项所述的方法，其中纯化步骤包括用水洗涤沉淀物部分和/或将沉淀物部分与水混合。

17.根据项目8至16中任一项所述的方法，其中纯化步骤包括离心和/或过滤经重悬、洗涤和/或混合的沉淀物部分。

18.根据项目8至17中任一项所述的方法，其中纯化步骤产生一个上清液部分和一个沉淀物部分。

19.根据项目8至18中任一项所述的方法，其中纯化步骤中获得的沉淀物部分包含纯化的微纤维。

20.根据项目8至19中任一项所述的方法，其中纯化步骤中获得的上清液部分包含发酵细胞。

21.根据项目8至20中任一项所述的方法，其中任选地对沉淀物部分重复纯化步骤至少两次，例如至少三次。

22.根据项目8至21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对从分离步骤和/或从纯化步骤获得的沉淀物部分进行干燥的步骤。

23.根据项目8至22中任一项所述的方法，其中所述微纤维是角蛋白微纤维。

24.根据项目8至23中任一项所述的方法，其中分离步骤中获得的上清液部分包含蛋白水解产物。

25.根据项目8至24中任一项所述的方法，还包括将获得的蛋白水解产物加工成饲料产品的步骤。

26.根据项目8至25中任一项所述的方法，其中蛋白水解产物包含可溶性蛋白质、氨基酸和/或寡肽。

27.根据项目8至26中任一项所述的方法，其中羽毛材料包括羽毛或由羽毛组成。

28.根据项目8至27中任一项所述的方法，其中羽毛选自有羽片的羽毛、绒羽、正羽、廓羽、纤羽、飞羽和翼羽。

29.根据项目8至28中任一项所述的方法，其中羽毛是有羽片的羽毛或绒羽。

30.根据项目8至29中任一项所述的方法，其中羽毛来自家禽。

31.根据项目8至30中任一项所述的方法，其中羽毛来自鸡和/或火鸡。

32.根据项目8至31中任一项所述的方法，还包括机械处理的步骤，其中对羽毛材料的固体部分进行机械处理以减小尺寸。

33.根据项目8至32中任一项所述的方法，其中机械处理包括湿磨。

34.根据项目8至33中任一项所述的方法，其中机械处理在包括切碎机泵、一个或多个旋转刀和/或一个或多个切碎刀的设备中进行。

35.根据项目8至34中任一项所述的方法，其中机械处理在发酵步骤之前进行。

36.根据项目8至35中任一项所述的方法，其中降解角蛋白的细菌是芽孢杆菌。

37.根据项目8至36中任一项所述的方法，其中降解角蛋白的细菌是短小芽孢杆菌。

38.根据项目8至37中任一项所述的方法，其中降解角蛋白的细菌是短小芽孢杆菌FH9，其在2014年3月24日保藏在德国微生物菌种保藏中心，保藏编号为DSM 28594。

39.根据项目8至38中任一项所述的方法，其中发酵步骤是需氧的。

40.根据项目8至39中任一项所述的方法，其中发酵步骤的温度为30℃至42℃，例如32℃至38℃，例如34℃至38℃，例如36℃至38℃，例如37℃。

41.根据项目8至40中任一项所述的方法，其中发酵步骤的pH为pH 5至pH 8，例如pH 6至pH 9，例如pH 6.5至pH 8.5，例如pH 8。

42.根据项目8至41中任一项所述的方法，其中发酵时间为12h至96h，例如12h至84h，例如24h至84h，例如36h至84h，例如48h至72h，例如24h。

43.根据项目8至42中任一项所述的方法，其中发酵步骤包括机械搅拌。

44.根据项目8至43中任一项所述的方法，其中发酵步骤包括添加降解角蛋白的微生物的预培养物。

45.根据项目8至44中任一项所述的方法，还包括灭菌步骤。

46.根据项目8至45中任一项所述的方法，还包括加热步骤。

47.根据项目8至46中任一项所述的方法，其中在发酵步骤之前对羽毛材料进行灭菌和/或加热步骤。

48.根据项目8至47中任一项所述的方法，其中在发酵步骤之后对微纤维和/或蛋白水解产物进行灭菌和/或加热步骤。

49.根据项目8至48中任一项所述的方法，其中通过高压灭菌、巴氏灭菌、超高压灭菌、电离辐射、UV辐射或抗生素处理来进行灭菌。

50.根据项目8至49中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

a.提供羽毛材料；

b.使羽毛材料发酵以获得包含微纤维和蛋白水解产物的组合物；

c.将步骤b)中的组合物分离成上清液部分和沉淀物部分，其中沉淀物部分包含粗微纤维，和

d.任选地纯化沉淀物部分，以获得纯化的微纤维。

51.根据项目8至50中任一项所述的方法，其中任选的步骤d.包括将沉淀物部分分离成纯化的微纤维和上清液。

52.根据项目8至51中任一项所述的方法，其中步骤c.和/或步骤d.的上清液部分包括发酵细胞，并且被再循环至发酵步骤。

53.根据项目8至52中任一项所述的方法，其中步骤c.的上清液部分被进一步加工成肥料。

54.根据项目8至53中任一项所述的方法，其中步骤c.的上清液部分被进一步加工成饲料产品。

55.一种生产蛋白水解产物的方法，其中该方法包括

a.提供羽毛材料；和

b.使羽毛材料发酵以获得包含蛋白水解产物的组合物。

56.根据项目55所述的生产蛋白水解产物的方法，其中所述方法根据项目8至54中任一项。

57.一种组合物，其包含通过根据前述项目任一项的方法可获得的蛋白水解产物。

58.根据项目57所述的组合物，其中所述组合物是发酵步骤后获得的上清液。

59.一种组合物，其包含通过根据前述项目任一项的方法可获得的微纤维。

60.根据项目59所述的组合物，其中所述组合物是微纤维组合物，并且是发酵步骤后获得的沉淀物。

61.根据项目59至60中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少75％干重的角蛋白，例如至少80％干重的角蛋白，例如至少85％干重的角蛋白。

62.根据项目57和58中任一项所述的组合物作为饲料产品的用途。

63.根据项目1至7中任一项所述的微纤维组合物和/或通过根据项目8至54中任一项所述的方法可获得的微纤维组合物用于制造复合材料的用途。

64.根据项目63所述的用途，其中所述微纤维组合物用于制造同质复合材料。

65.根据项目63所述的用途，其中所述微纤维组合物用于制造纤维增强塑料。

66.一种从羽毛材料中提取微纤维的系统，其包括发酵反应器，所述系统被布置成用于执行根据前述项目中任一项所述的生产微纤维的方法。

67.根据项目66所述的系统，其任选地包括布置在发酵反应器之前的用于机械处理的设备。

68.根据项目66至67中任一项所述的系统，其中所述发酵反应器被布置成使羽毛材料发酵以获得微纤维。

69.根据项目66至68中任一项所述的系统，其中通过降解角蛋白的微生物使羽毛材料发酵。

70.根据项目66至69中任一项所述的系统，其还包括预培养反应器，所述预培养反应器被布置用于预培养降解角蛋白的微生物。

71.根据项目66至70中任一项所述的系统，其中预培养反应器连接至发酵反应器，以提供降解角蛋白的微生物。

72.根据项目66至71中任一项所述的系统，其还包括分离装置，所述分离装置被配置为将获得的发酵组合物的可溶性部分与不溶性部分分离。

73.根据项目66至72中任一项所述的系统，还包括一个或多个纯化装置，所述纯化装置被配置为从发酵组合物的不溶性部分中纯化微纤维。

74.根据项目66至73中任一项所述的系统，其中纯化装置包括(i)反应器，其被配置用于洗涤和混合发酵组合物的不溶性部分，和(ii)另外的分离装置，其被配置用于在混合和洗涤发酵组合物的不溶性部分后，从发酵组合物的不溶性部分中分离发酵细胞。

75.根据项目66至74中任一项所述的系统，其中所述分离装置包括一个或多个离心装置和/或一个或多个过滤装置。

76.根据项目66至75中任一项所述的系统，其还包括一个或多个循环装置，例如泵，所述循环装置被配置为使流体在系统的各部分之间向前流动。

77.根据项目66至76中任一项所述的系统，其还包括一个或多个循环装置，例如泵，所述循环装置被配置为使流体以向后流动的方式从一个或多个分离装置通向预培养反应器和/或发酵反应器。

78.根据项目66至77中任一项所述的系统，其还包括风扇、干燥器和/或旋风分离器，其被配置成从所获得的发酵组合物和/或从分离自所获得的发酵组合物的不溶性部分中除去水。

79.根据项目66至78中任一项所述的系统，其还包括一个或多个配置为执行灭菌的灭菌反应器。

80.根据项目66至79中任一项所述的系统，其中灭菌反应器被布置成对羽毛材料进行灭菌。

81.根据项目66至80中任一项所述的系统，所述系统包括：

a.发酵反应器，其被布置用于水解羽毛材料，所述发酵反应器连接到

b.分离装置，其被布置用于将上清液部分与沉淀物部分分离，所述分离装置通过将上清液部分从分离装置再循环至发酵反应器的装置连接至发酵反应器，其中所述沉淀物部分包含粗微纤维，

c.任选地，纯化装置，其被布置用于纯化沉淀物部分，其中所述纯化装置将沉淀物部分分离成包含微纤维的组合物和包含发酵细胞的组合物，并且其中所述纯化装置任选地通过将发酵细胞从纯化装置再循环到发酵反应器的装置连接到发酵反应器，

d.干燥器，其被布置用于干燥沉淀物部分和/或包含微纤维的组合物。

82.根据项目66至81中任一项所述的系统，其中干燥器是喷雾干燥器、箱式干燥器或冷冻干燥器。

83.一种用于提取微纤维的多部分试剂盒，其包括细菌菌株短小芽孢杆菌FH9和使用说明书。

84.根据项目83所述的多部分试剂盒，其中所述多部分试剂盒还包括适合用于培养短小芽孢杆菌FH9的盐。

实施例

羽毛材料：鸡或火鸡所有身体部位(翅膀、尾巴和绒羽)的羽毛混合物是从瑞典

干重测定：用剪刀将未加工的湿羽毛(鸡或火鸡)切成1-3cm大小，并充分混合，以更好地分配所有羽毛部位，然后在60℃下干燥24-48小时。

微生物：用于羽毛水解的微生物菌株是革兰氏阳性、需氧和野生型细菌：短小芽孢杆菌FH9，于2014年3月24日保藏在德国微生物菌种保藏中心，保藏编号为DSM 28594。短小芽孢杆菌或能够产生角蛋白酶或蛋白酶的任何其他微生物都可以用于该方法中。

培养基：接种物(种子培养物)是在基础培养基(BM)中制备的，所述基础培养基含有(g/L)0.5NH

用于发酵水解的培养基：使用具有与种子培养物培养基相同的组成的基础培养基用于生长和水解发酵罐培养物中的羽毛。用羽毛代替酪蛋白、酵母提取物和NH

在5-L规模的发酵罐(B.Braun Biostat B)中，使用循环水浴加热和冷却来控制温度。在3-L发酵罐(Applikon Biobundles)中，使用循环自来水进入冷却指，或使用电加热毯进行加热来控制温度。

以5-L生物反应器规模(Biostat B)发酵水解火鸡羽毛

50克干羽毛/升(80小时)

微纤维的来源是火鸡羽毛150克，切成1-3厘米，并在3升基础培养基中高压灭菌。用生长16小时的预培养物(5％接种物大小)接种培养物。以0.85-1.8L/L/min(0.5-1.0体积/体积/分钟，vvm)对培养物供气，并以400-1000rpm连续搅拌混合。使用3M NaOH或3M HCl将培养物的pH控制在8.0。培养温度保持在37℃。

80h后，通过在10-24℃下以66000rpm，5554x g离心10分钟收获培养物(最终体积3L)。将回收的不溶性产物在60℃下干燥24小时并称重。

结论：回收了总计99.76g的干物质(起始羽毛材料的三分之二)，其包括微纤维、细胞和非羽毛杂质。三分之一的羽毛被转化为水溶性部分，作为澄清的上清液回收。(表1)

3-L生物反应器规模(Biobundles)发酵水解鸡羽毛。

60克干羽毛/升(50小时)

将鸡羽毛供应至相当于90克干重的1.5升基础培养基中。

在这个实施例中，使用第二类型的家禽羽毛(鸡)作为微纤维和可溶性蛋白水解产物生产的原料底物。使用了稍微更高的浓度，60g/L干重。将接种物和水解培养物控制在与实施例2相同的条件下。在更短的水解时间(50小时)后收获培养物。通过以(6000rpm，5554xg在10-24℃下离心10分钟)离心来分离可溶性和不溶性部分。

通过以下步骤进一步纯化回收的不溶性材料：在自来水中混合并洗涤三遍，然后低速离心(10-24℃，1200rpm，222x g，2分钟)，以沉淀出微纤维，从而将其与保留在倾析出的上清液中的细菌细胞分离。将回收的纤维在60℃干燥24h。干燥的微纤维占起始羽毛重量的36.53％。

结论：干燥的微纤维占起始羽毛重量的约37％。与实施例2中的火鸡羽毛相比，相对大部分的羽毛被溶解(约45％)。

短时发酵水解火鸡羽毛5-L生物反应器(Biostat B)

60克干羽毛/升(24h)

以比实施例2中使用的浓度略高的浓度使用切碎的火鸡羽毛。将总计120g的干羽毛混合到2升具有相同组成的基础培养基中。将空气控制在0.5-1.0vvm，同时通过以400-600rpm搅拌混合培养物。

水解发酵运行显著更短的时间(24小时)。通过离心(10-24℃，6000rpm，5554x，10分钟)收获整个培养物混合物。

如实施例3中所述进行用于微纤维纯化的下游加工。

结论：在保持相似的生产率和回收率的同时，实施例4中的改进的发酵水解过程在与采用具有略微更低浓度(干重50g/L)的火鸡羽毛的实施例2以及实施例3中具有相似浓度(干重60g/L)的鸡羽毛相比在显著更短的时间周期后实现了羽毛水解。

在这些实施例中使用的简化的下游加工容易地将水溶性部分分离为用于饲料应用中的高营养水解产物。粗不溶性部分占原始羽毛重量的三分之二(66.50％，实施例2)。它可以作为低级微纤维用于材料应用，或者它也可以通过简单的水洗步骤(实施例3和4)进一步纯化，以生产用于精细生物材料应用的高纯度角蛋白微纤维。膜过滤系统可以帮助提高微纤维的纯度和回收率。

以3-L生物反应器规模(BioBundle)20克干羽毛/升发酵水解鸡羽毛(73小时)。将总共30克干的鸡羽毛(切成1-3cm)在1.5L包含酵母提取物和氯化铵的基础培养基中灭菌。用生长16小时的预培养物(5％接种物大小)接种培养物。将培养物以1.0-2.0L/L/min(0.67-1.33体积/体积/分钟，vvm)充气，并以400-1000rpm连续搅拌混合。用3M NaOH或3MHCl控制培养物的pH并保持在8.0。培养温度保持在37℃。发酵继续进行直到观察到可见的完全水解，总计约73小时。然后以6000rpm(5554x g)离心15分钟分离残留物和未水解的羽毛。

实施例2、3、4和5的结果总结在表1中，以概述来自羽毛细菌水解的不同的粗产物和纯化产物。

表1.通过细菌水解由鸡和火鸡的羽毛生产微纤维和角蛋白水解产物。(由于发酵培养基中存在盐，或者由于不完全干燥/冻干，总％可能超过100。)

表1中的数据表明，初始羽毛浓度是引导细菌水解朝向产生角蛋白微纤维(不溶于水/水性条件)或可溶性蛋白质浓缩物的重要因素。特别地，似乎需要25g干重/L、优选50g干重/L或更高的初始羽毛浓度来引导水解朝向生产微纤维。

蛋白质含量和氨基酸分析、Dumas和氧化水解分别在瑞典Eurofins Food&FeedTesting Sweden AB,

表2.鸡和火鸡羽毛中可溶性水解产物的氨基酸谱和浓度的比较。

图1说明了禽羽毛的物理结构。

不溶性羽毛水解产物代表了从鸡和火鸡羽毛中回收的水解产物的主要部分，几乎占回收的水解产物的一半或三分之二(表1)。从羽毛回收的角蛋白纤维代表了天然羽毛物理结构的最小纤维构建模块(图3B)。细菌水解过程将羽毛的羽支和羽小枝部分地降解为1-5个节间的空心圆柱体微纤维。这些纤维的长度为30-150μm，宽度为2-6μm。这些基于角蛋白的且具有中空圆柱体结构的微米级纤维将在材料工业和生物医药中具有更广泛的应用范围。(Reddy，2015年)

将纯化的不溶性部分在60℃下干燥24h。干燥后回收了极细粉末形式的角蛋白微纤维，如图4A所示。

为了检查纤维水解产物的复合材料增强适用性，通过简单的浇铸和干燥，使用回收的粗微纤维与可生物降解聚合物一起制造复合材料：

A)羽毛同质复合材料

将实施例4中回收的湿羽毛水解产物微纤维浇铸在塑料托盘(托盘尺寸：28×38cm；层厚度：1-3mm)中，并在60℃下干燥24小时。

干燥的羽毛微纤维形成紧密的角蛋白纤维复合材料，其外观与基于木质的复合材料相似。(图5A)

B)羽毛增强生物塑料：通过剧烈混合成溶解的生物聚合物(以实验室聚酯生物塑料聚羟基链烷酸酯PHA和可堆肥的聚己内酯Capa的形式获得，Perstorp，瑞典)来增强回收的羽毛微纤维。

将一份干羽毛微纤维增强到9份溶解的聚酯PHA和Capa(0.1g纤维：0.9g聚酯)中。将混合物浇铸在玻璃板上并在室温下干燥。图5B、C。在这些混合比下的干燥复合材料显示出连续的膜，其外观与所用的生物塑料材料相似。该结果简单地证明了所生产的微纤维对生物复合材料形成的增强适用性。

通过剧烈混合到溶解的生物聚合物来增强回收的羽毛微纤维，然后在50℃下干燥过夜。通过在氩气供应下在适当的熔融温度下在存在或不存在干燥的微纤维的情况下混合干燥的聚合物，每种聚合物混合3min，从而完成复合：

·100℃(CABA)；180、180、185℃(PHB)

·70RPM

·氩气

·3min

通过在每种聚合物的理想熔融温度下熔融复合的同质复合材料或混合复合材料完成注射模塑，然后在较低的温度下在压力下分三步挤出：

·100℃(熔融，CAPA)；185℃(熔融，PHB)；

·40℃(模塑，CAPA)；90℃(模塑，PHB)；

·步骤1：10巴2s

·步骤2：16巴10s

·步骤3：16巴15s

将复合材料挤出成狗骨和长丝(纤维)两种形式。重复，挤出每种复合材料的三个或四个不同的样品重量。根据以下方案使用ThermoFischer Scientific挤出机(ThermoFisher Process 11挤出生产线)：

表3.角蛋白微纤维增强材料

结果显示在表3“最终产品的重量”和图6中。此处未显示没有用角蛋白微纤维增强同质复合材料的结果。

1.微生物水解24h后，将纤维过滤通过1-5mm筛网，以除去大的羽毛部位。

2.采用高速离心以分离水解产物(20℃，8000rpm，9722x g，15min)

3.可以回收微纤维沉淀并转移回到发酵罐。填充2-L自溶缓冲液，其含有(g/L)NaCl，9.0；K

4.将粗微纤维沉淀在控制的pH 7.0和温度37℃下以400-600rpm混合2小时。

5.通过低速(1200rpm，200x g)离心收集净化的微纤维。

6.净化的微纤维用水洗涤1-3次，然后在50℃干燥过夜。

7.可以在第一个水洗步骤期间加入表面活性剂(餐具洗涤剂)，以减少蛋白质气味，使颜色更白，并防止在干燥期间聚集。

此处未显示根据步骤1-6纯化的角蛋白微纤维的结果。

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