一种基于荧光探针快速检测细菌的荧光方法

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于快速检测细菌的荧光方法。

背景技术

细菌存在于生活的方方面面，大多数细菌为有益菌对人类没有危害，而部分致病细菌的存在与疾病的发展直接相关，严重威胁着人类的健康。当这些致病细菌存在于促进生长的环境中时，它们能在很短的时间内增殖繁衍并引起病患间的交叉感染，是医院内病患产生严重并发症和死亡的主要原因之一。快速且灵敏的细菌检测方法能够指导医生合理治疗，从而控制细菌的扩散与交叉感染，提高细菌感染患者的生存率并且有效预防流行性疾病。

当前，医院对于细菌的常规检测方法为细菌血培养以及微生物表型鉴定，是当前的临床金标准。但是这种方法操作步骤繁琐，而且整个鉴定过程非常耗时(几天甚至几周)，并且通常依赖于操作员具备细菌的专业知识。作为替代方法，某些基因型方法例如实时聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)，可以将血液培养阳性后的测定时间有效地减少至数小时(约6-10小时)。但是，有限的检测灵敏度(例如，<100CFU mL-1)和缺乏特异性以及周围的大量非目标物种(例如，红细胞)产生的高背景信号仍然阻碍了它们的广泛使用。此外，所有这些常规方法都在一定程度上涉及复杂且费力的样品处理(例如，细胞培养，细胞裂解，核酸提取和PCR扩增)，这使得难以对临床样品进行高通量分析。因此，迫切需要开发快速，多重和超灵敏的方法，以在临床诊断中对病原菌进行高通量鉴别。

荧光探针法具有快速、灵敏的特点，近年来被广泛的开发用于细菌的快速检测。例如荧光传感器阵列法被报道用于细菌的区分与检测，由于各种细菌具有不同的表面特性(以电荷特性为主)，传感器阵列中的不同荧光探针与不同细菌表面之间的非特异性相互作用产生了差异的模式信号，最终使得荧光传感器阵列通过读取差异的模式信号来鉴别细菌。但是由于选择性和灵敏度不够，导致荧光传感器阵列能够诊断出的细菌种类有限。

芘作为一种经典的荧光团，根据作用模式的不同可以给出不同的响应信号。我们以芘荧光团为信号分子设计了一个简单的传感器分子，并以其为核心开发了一种简单的荧光方法用于快速识别不同种类的细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于快速细菌检测的荧光方法。该方法使用的比率荧光探针在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而显示较弱的激基复合物荧光，加入细菌以后，由于探针带正电荷，而细菌表面带大量负电荷，探针和细菌细胞壁作用使聚集体解聚集而显示出荧光增强信号。由于不同细菌表面存在细微差异，表现在荧光增强程度上会引起不同，利用这一荧光变化可以区分出不同细菌种类。具有制备方法简单，检测灵敏快速的特点，性能优于已有的细菌检测探针。

本发明提供了一种荧光探针，该荧光探针能在375nm发射芘单体荧光，在482nm发射芘激基复合物荧光。其结构式如下所示：

该化合物在水溶液中因疏水作用形成纳米聚集体而显示较弱的激基复合物荧光，加入细菌以后，由于探针带正电荷，而细菌表面带大量负电荷，探针和细菌细胞壁作用使聚集体解聚集而显示出荧光增强信号。由于不同细菌表面存在细微差异，表现在荧光增强程度上会引起不同，利用这一荧光方法可以区分出不同细菌种类。

一种用于快速检测细菌的荧光方法使用的比率荧光探针的合成方法及合成路线，如下：

具体步骤如下：

(1)中间体3-溴-1-芘基丙酮的合成：

在氮气保护下，将芘和3-溴丙酰溴溶解于二氯甲烷，冰盐浴冷却至-5-0℃，搅拌下向反应液中缓慢加入无水氯化铝，搅拌1-3小时后得反应液颜色变深；将反应温度升至室温，继续搅拌6-10小时后，将反应液倒入冰水中，随后用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱色谱分离，得到3-溴-1-芘基丙酮；

(2)中间体1-(3-溴丙基)-芘的合成：

在氮气保护下，将无水氯化铝和氢化铝锂溶于乙醚中，将3-溴-1-芘基丙酮溶于二氯甲烷后，缓慢加入反应液中，在室温下搅拌反应0.5-3小时，将反应液倒入冰水中，淬灭剩余的氯化铝和氢化铝锂，用盐酸调节反应液pH至酸性，随后用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱色谱分离，得到1-(3-溴丙基)-芘；

(3)对膜电荷响应的比率荧光探针PI-3的合成：

在氮气保护下，将二联咪唑和1-(3-氯丙基)-芘溶于乙腈中，升温至80-140℃，搅拌下反应24-96小时后，停止反应，有白色沉淀析出，过滤，沉淀用乙醚洗涤；随后将所得沉淀溶于甲醇中，向其中缓慢滴加饱和的六氟磷酸钾甲醇溶液，析出白色沉淀产物，即对膜电荷响应的比率荧光探针PI-3。

步骤(1)中，芘：3-溴丙酰溴的质量比为1:0.3-2；

芘：无水氯化铝的质量比为1:0.3-3；

芘的质量与二氯甲烷的体积比为1:5-50g/mL。

步骤(2)中，中间体3-溴-1-芘基丙酮：氢化铝锂的质量比为1:0.2-1；

中间体3-溴-1-芘基丙酮：无水氯化铝的质量比为1:0.5-2；

中间体3-溴-1-芘基丙酮的质量与乙醚的体积比为1:3-15g/mL。

中间体3-溴-1-芘基丙酮的质量与二氯甲烷的体积比为1:15-90g/mL。

步骤(3)中，中间体1-(3-溴丙基)-芘：二联咪唑的质量比为15-4:1；

中间体1-(3-溴丙基)-芘的质量与乙腈的体积比为1:20-200g/mL。

一种用于快速检测细菌的荧光方法，具体检测方法如下：

(1)细菌在37℃摇床震荡培养；

(2)细菌在13000rpm条件下离心2分钟，弃去上清液，用20mM、pH＝7.4的PBS缓冲液清洗细菌2-3次，最后用PBS缓冲液重悬细菌；

(3)在细菌中加入探针后用荧光光谱仪检测。

步骤(1)中细菌培养至OD

步骤(2)中用PBS重悬至细菌的OD

步骤(3)中，在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图，以荧光比率变化(I

本发明的优点和有益效果为：

带正电荷的探针与表面带有大量负电荷的细菌，相互作用引起荧光大幅度增强。由于不同种类细菌表面电荷分布不同，导致探针形成不同程度的单体和二聚体，从而产生芘单体和激基复合物荧光的比率变化(I

附图说明

图1实施例1制备的荧光探针核磁谱图氢谱；

图2实施例1制备的荧光探针核磁谱图碳谱；

图3为实施例2中描述的由实施例1制备的荧光探针在DMSO/H

图4为实施例2中描述的由实施例1制备的荧光探针在DMSO/H

图5为实施例4中描述的由实施例1制备的荧光探针在PBS缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中动态光散射图谱

图6为实施例5中描述的由实施例1制备的荧光探针在PBS缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中的扫描电镜图。

图7为实施例6中描述的由实施例1制备的荧光探针在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与不同浓度枯草杆菌作用前后的荧光光谱图。

图8为实施例7中描述的由实施例1制备的荧光探针在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与不同浓度大肠杆菌作用前后的荧光光谱图。

图9为实施例8中描述的由实施例1制备的荧光探针在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与不同细菌(OD

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

用于快速检测细菌的荧光方法使用的比率荧光探针的制备，基本合成方法如下：

(1)中间体3-溴-1-芘基丙酮的合成：

将芘(4g,19.77mmol)和3-氯丙酰溴(2.83g,16.48mmol)溶于40mL无水二氯甲烷。氮气保护下，将反应温度降到0℃。加入AlCl

(2)中间体1-(3-溴丙基)-芘的合成：

在氮气保护下将LiAlH

(3)探针PI-3的合成：

在氮气保护下，将化合物1-(3-氯丙基)-芘(0.439g,1.58mmol)和二咪唑基甲烷(0.10g,0.7mmol)溶于20mL乙腈中，回流24h得到沉淀。将沉淀过滤出来用乙醚洗涤。将沉淀溶于25mL甲醇溶液，向溶液中缓慢滴入饱和的KPF

PI-3探针分子的氢谱和碳谱数据如下：

实施例2

用于快速细菌鉴定的荧光探针的制备，基本合成方法如下：

(1)中间体3-溴-1-芘基丙酮的合成：

在氮气保护下，在100mL双口瓶中依次加入芘2.0g，3-溴丙酰溴0.6g，二氯甲烷10mL，冰盐浴冷却至-10℃，搅拌条件下向反应液中缓慢加入无水氯化铝0.6g，继续搅拌1小时后得反应液颜色变深；撤去冰浴，将反应温度缓慢升至室温，继续搅拌10小时后停止反应，将反应液倒入100mL冰水中，随后用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱分离，得到淡黄色固体3-溴-1-芘基丙酮，产率30％。

(2)中间体1-(3-溴丙基)-芘的合成：

在氮气保护下，在250mL史莱克瓶中依次加入无水氯化铝1g，氢化铝锂0.6g，乙醚6mL，搅拌条件下，将3-溴-1-芘基丙酮2g溶于30mL二氯甲烷后，缓慢加入反应液中，在室温下搅拌反应3小时，将反应液倒入冰水中，淬灭剩余的氯化铝和氢化铝锂，用盐酸调节反应液pH至酸性，随后用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱色谱分离，得到白色固体1-(3-溴丙基)-芘，产率33％。

(3)探针PI-3的合成：

在氮气保护下，在50mL单口瓶中依次加入二联咪唑10mg，1-(3-溴丙基)-芘150mg和3mL乙腈，升温至110℃，搅拌下反应96小时后，停止反应，有白色沉淀析出，过滤，沉淀用乙醚洗涤；随后将所得沉淀溶于甲醇中，向其中缓慢滴加饱和的六氟磷酸钾甲醇溶液，析出白色沉淀产物，产率8％。

其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：

经鉴定，产物结构为探针PI-3。

实施例3

用于快速细菌鉴定的荧光探针的制备，基本合成方法如下：

(1)中间体3-溴-1-芘基丙酮的合成：

在氮气保护下，在100mL双口瓶中依次加入芘2.0g，3-溴丙酰溴4g，二氯甲烷100mL，冰盐浴冷却至-10℃，搅拌条件下向反应液中缓慢加入无水氯化铝6g，继续搅拌1小时后得反应液颜色变深；撤去冰浴，将反应温度缓慢升至室温，继续搅拌10小时后停止反应，将反应液倒入100mL冰水中，随后用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱分离，得到淡黄色固体3-溴-1-芘基丙酮，产率75％。

(2)中间体1-(3-溴丙基)-芘的合成：

在氮气保护下，在250mL史莱克瓶中依次加入无水氯化铝4g，氢化铝锂2g，乙醚30mL，搅拌条件下，将3-溴-1-芘基丙酮2g溶于180mL二氯甲烷后，缓慢加入反应液中，在室温下搅拌反应3小时，将反应液倒入冰水中，淬灭剩余的氯化铝和氢化铝锂，用盐酸调节反应液pH至酸性，随后用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱色谱分离，得到白色固体1-(3-溴丙基)-芘，产率36％。

(3)探针PI-3的合成：

在氮气保护下，在50mL单口瓶中依次加入二联咪唑25mg，1-(3-溴丙基)-芘100mg和20mL乙腈，升温至110℃，搅拌下反应96小时后，停止反应，有白色沉淀析出，过滤，沉淀用乙醚洗涤；随后将所得沉淀溶于甲醇中，向其中缓慢滴加饱和的六氟磷酸钾甲醇溶液，析出白色沉淀产物，产率11％。

其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：

经鉴定，产物结构为探针PI-3。

实施例4

实施例1制备的荧光探针的聚集特性的研究

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，将探针溶于含水量分别为0％、20％、40％、60％、80％、99.5％的DMSO/H

图3中在纯的DMSO溶液中，探针在256nm、278nm、324nm、345nm处有强的紫外-可见吸收峰，随着H

实施例5

实施例1制备的荧光探针的聚集特性的研究

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，将探针溶于含水量分别为0％、20％、40％、60％、80％、99.5％的DMSO/H

图4中在纯的DMSO溶液中，在345nm波长激发光激发下，探针在纯的DMSO溶液中在375nm处显示出强的芘单体的峰，在482nm处显示芘的激基缔合物的峰。随着H

实施例6

实施例1制备的荧光探针形成的聚集体的尺寸研究

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，然后在1mL，20mM，pH＝7.4的PBS溶液中配制成5μM、10μM、20μM的溶液，然后用动态光散射仪测定其粒径大小得到图5。

图5中只有PI-3探针浓度为5μM时形成的粒子平均尺寸为366.2nm，探针浓度为10μM时形成的粒子平均尺寸为593.8nm，探针浓度为20μM时形成的粒子平均尺寸为805.7nm，可以看出，随着探针浓度增大，探针聚集形成的粒子的尺寸也在增大。

实施例7

实施例1制备的荧光探针的表面形貌的研究

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，然后在1mL，20mM，pH＝7.4的PBS溶液中配制成10μM的溶液，然后扫描电子显微镜观察其形貌得到图6。

图6中在PBS中只有PI-3探针存在时(10μM)首先形成很小的纳米粒子，这些纳米粒子又团聚在一起形成大的粒子簇。

实施例8

实施例1制备的荧光探针与不同浓度枯草芽孢杆菌作用的荧光谱图的研究

取枯草芽孢杆菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，取1mL不同浓度枯草芽孢杆菌菌液以及20mM，pH＝7.4的PBS溶液分别加入5μL探针，吹打均匀，探针终浓度为10μM，然后在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图7。

图7中只有探针存在时375nm和482nm处的峰很低，加入枯草杆菌以后，375nm和482nm处的峰均有明显的升高。随着枯草芽孢杆菌浓度的增加，375nm处的峰逐渐升高；而482nm处的峰值出现先升高、后降低的趋势。具体表现为枯草芽孢杆菌浓度从OD

实施例9

实施例1制备的荧光探针与不同浓度大肠杆菌作用的荧光谱图的研究

取大肠杆菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，取1mL不同浓度大肠杆菌的PBS溶液分别加入5μL探针，吹打均匀，探针终浓度为10μM，然后在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图8。

图8中只有探针存在时375nm和482nm处的峰都很低，加入大肠杆菌以后，375nm处的峰有轻微的升高，而482nm处的峰有明显的升高。随着大肠杆菌浓度的增加，375nm处的峰逐渐升高；而482nm处的峰值出现先升高、后降低的趋势。具体表现为大肠杆菌浓度从OD

实施例10

实施例1制备的荧光探针对不同细菌的检测

取细菌100μL与20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

将探针溶于DMSO中配制成2mM的母液，取1mL菌液加入5μL探针，吹打均匀，探针终浓度为10μM，然后在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图图9a，同种细菌测试重复5次。以荧光比率变化(I

图9a中只有探针存在时375nm和482nm处的峰都很低，加入细菌以后，375nm和482nm处的峰均有明显的升高。加入不同的细菌荧光增强的程度各不相同，这是由不同细菌表面结构差异引起的。

由图9a中荧光强度换算得到图9b中PI-3探针与不同细菌作用后的二维荧光比率图，横坐标为PI-3探针与各种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I