一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的建立方法

技术领域

本发明属于水产品加工技术领域，涉及一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的 建立方法。

背景技术

鳜鱼，又名桂花鱼，隶属于鲈形目、鲈亚目、鳜亚科、鳜属，是我国特产的一种名贵淡 水鱼。目前关于鳜鱼产品开发以盐腌低温发酵制成臭鳜鱼和即食臭鳜鱼罐头为主，产品比较 单一。鳜鱼肉质细嫩，营养价值高，味道鲜美，富含丰富的优质蛋白，作为鱼糜生产原料既 可以开拓鳜鱼制品市场又能保证品质要求。然而淡水鱼鱼糜与海水鱼相比凝胶特性较低，谷 氨酰胺转氨酶作为一种生产新型蛋白食品的添加剂，具有提高鱼糜制品肉质口感、凝胶属性 等特点，其改善鱼糜凝胶网络结构的作用也受到国内外学者广泛关注。

TG酶是一种催化酰基转移的酶，可使蛋白质以及肽和各种伯胺之间发生交联。当蛋白 质中赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体时，在蛋白质分子间和分子内交联生成ε-(γ-谷氨酰) 赖氨酸异肽键，从而改善蛋白质的凝胶能力。Chanarat等研究不同鱼类肌肉蛋白质的组成和 性质可能决定TG酶诱导的蛋白质交联，从而影响其凝胶性质。尚永彪等在PSE加工的重组 肉制品中添加TG酶，增强其肉制品的凝胶强度，减少加工蒸煮损失。董建国等研究发现超 高压和TG酶结合处理碎牛肉能够提高牛肉凝胶的咀嚼性、硬度和凝胶强度。严菁等研究表 明添加10U/g TG酶于42℃处理2h鱼糜凝胶强度较未添加组增加1倍。

已有研究探讨TG酶对鲢鱼、鲤鱼和鱿鱼凝胶特性的影响，然而关于TG酶对鳜鱼鱼糜 凝胶特性的研究基本空白。本实验通过运用半透膜-鱼糜肠模型，探究向鳜鱼鱼糜凝胶中添 加一定量的TG酶，分析持水性、色泽、质构、感官评价变化、蛋白质二级结构、微观结构以及蛋白电泳情况，为TG酶应用于鳜鱼发酵过程提供理论参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的建立方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于臭鳜鱼腌制效果 分析的半透膜肠模型的建立方法，包括下列步骤：

步骤1：将鲜活鳜鱼作为原材料，宰杀后去除内脏、鳃和鳞，留取鳜鱼鱼肉；

步骤2：将鳜鱼鱼肉去皮去骨，搅碎得到粗鱼糜；将粗鱼糜放入其体积3-5倍的0-4℃的 蒸馏水中漂洗2-3次，然后用灭菌纱布拧干其中水分，得到鱼糜；

步骤3：将半透膜透析袋置于pH只为8.0±0.2的溶液中煮沸10-12min；冷却后取出透析 袋，用蒸馏水浸泡清洗；

步骤4：将所述鱼糜放入半透膜透析袋中，半透膜透析袋的两端密封，形成鱼糜半透膜 肠；然后将鱼糜半透膜肠放入一容器中，再向所述容器中加入盐水，使盐水完全浸没半透膜 肠，将装有盐水和鱼糜半透膜肠的容器放入洁净的0-6℃环境中，即构建了半透膜肠模型。

优选的技术方案为：所述半透膜透析袋的型号为MD34-5M、材质为标准RC膜。

优选的技术方案为：所述半透膜透析袋的预处理方法包括：用NaHCO

优选的技术方案为：盐水的浓度30g/L，鱼糜半透膜肠与盐水的质量比例为1:4。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明的研究结果可为鳜鱼发酵改进提供理论支撑。

附图说明

图1为半透膜模型。

图2反应过程中鳜鱼鱼糜盐度的变化。

图3为TG酶添加量对鳜鱼鱼糜凝胶持水性的影响。

图4为TG酶添加量对鳜鱼鱼糜凝胶色泽的影响。

图5为TG酶添加量对鳜鱼鱼糜凝胶质构的影响。

图6为鳜鱼鱼糜凝胶蛋白的红外光谱分析。注：1～6分别为0U/g，0.2U/g，0.4U/g，0.6 U/g，0.8U/g，1.0U/g TG酶添加量鱼糜凝胶。

图7TG酶添加量对蛋白质二级结构含量的变化。

图8鳜鱼鱼糜凝胶微观结构图。

图9鱼糜凝胶SDS-PAGE。注：M为标准蛋白Marker；1～6为肌浆蛋白；7～12为肌原纤维蛋白；13～18为基质蛋白。不同蛋白组分间TG酶添加量分别为0U/g，0.2U/g，0.4U/g，0.6U/g，0.8U/g，1.0U/g。

图10添加不同量TG酶的鳜鱼鱼糜凝胶。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭 露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-10。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合 说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限 定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不 影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能 涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间” 及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关 系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例：一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的建立方法

1.1材料与试剂

新鲜鳜鱼购于安徽省池州市东至县大联圩农业开发有限公司。

透析袋(MD34-5M)MYM Biological Technology Company limited；谷氨酰胺转氨酶 (100U/g)、彩虹245广谱蛋白Marker北京索莱宝科技有限公司；过硫酸铵、 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、Acr/Bis上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二硫苏糖醇、甘 氨酸、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠上海麦克林生化科技有限公司；其他 生化试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

JYS-A800绞肉机九阳股份有限公司；H1750R离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CR-400色差分析仪柯尼卡美能达控股公司；TA.XT Plus质构仪英国Stable MicroSystem公司；PD-ICE冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司；IS5傅里叶红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司；SU8010扫描电子显微镜株式会社日立制作所；JY600C电泳仪北 京君意东方电泳设备有限公司。

1.3实验方法

1.3.1鳜鱼模拟发酵肠制备

新鲜鳜鱼去皮去骨后置于料理机中，低速搅碎30s，放入3倍体积4℃预冷的蒸馏水中漂 洗2次，用2层灭菌纱布拧干其中水分，控制水分含量最终一致。

称取100g新鲜鱼糜放入料理机中加入谷氨酰胺转氨酶(TG酶添加量分别为0U/g、0.2 U/g、0.4U/g、0.6U/g、0.8U/g、1.0U/g)，低速斩拌30s再高速斩拌30s，促进鱼糜与谷氨酰胺转氨酶充分接触进行反应。

透析袋预处理方法：配制1000mL 1M的EDTA，用NaHCO3将溶液pH调节为8，将 透析袋置于pH为8的溶液中煮沸10min，冷却后用蒸馏水清洗。

如图1所示，将搅碎的鱼糜用分子量为500的透析袋灌肠，将透析袋两端密封后放入30 g/L的盐水中，使得肠与反应液的比例为1:4，之后放入4℃冰箱反应48h。待反应结束采用 两段水浴加热方式，即40℃加热20min使鱼糜凝胶化后，立即转入90℃水浴加热30min使其熟化。

1.3.2盐度测定

将鱼肠放入盐水中反应开始后，按0、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、 40、44、48h取样，用手持式盐度计测定盐度值。

1.3.3持水性测定

参考Yi Shumin等方法称取5g鱼糜凝胶(M1，g)，3层滤纸包裹后放入50mL离心管中，4℃下6000×g离心10min，离心后准确称重(M2，g)。持水性按以下公式计算：

1.3.4色泽测定

取出4℃冰箱中存放的鱼糜凝胶样品室温下平衡1h，切成高为1cm左右的圆柱体。使 用手持式色差仪测定鱼糜凝胶切面的L*值、a*值、b*值。按以下公式计算：

白度＝100-[(100-L*)

1.3.5质构分析

参考周迎芹等方法。将鱼糜凝胶样品在室温下平衡1h，将其切成1cm高的圆柱体，放 在质构仪上测定硬度、粘附性、弹性、粘结性、胶黏性、咀嚼性、回弹性，使用直径35mm 的圆柱形探头(p/50)。

具体参数设定：触发类型Auto(Force)、触发力5.0g，测试前速度1.0mm/s，测试中速 度5.0mm/s测试后速度5.0mm/s，变形量10mm。

1.3.6傅里叶红外光谱测定

参考Moreno等方法。将鳜鱼鱼糜凝胶样品冷冻干燥，称取1～2mg试样与200mg溴化钾研细均匀，置于模具中，在油压机上压成透明薄片，将样品放入红外光谱仪中测试，波长范围4000～400cm-1，扫描次数32，分辨率4cm-1。

1.3.7扫描电子显微镜

参考Kudre等方法取对照组和TG酶添加量为0.6U/g鱼糜凝胶，切成2～3mm厚的小块，经2.5％戊二醛4℃固定过夜，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；再 经1％锇酸溶液4℃固定1h，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；然后依 次用30％、50％、70％、80％和90％(v/v)的乙醇进行梯度脱水，各梯度脱水时间均为 15min，最后再经无水乙醇脱水30min。冷冻干燥，镀膜后置于扫描电子显微镜下观察。

1.3.8SDS-PAGE凝胶电泳

参考杨慧的方法提取肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白。分别吸取蛋白提取液加入上 样缓冲液，98℃水浴加热10min，在5000r/min下离心2min。选用15％分离胶和5％浓缩胶 进行电泳，电泳全程电压为250V，待溴酚蓝到达底部时结束。用蒸馏水洗涤3次，置于摇 床上用考马斯亮蓝-R250过夜染色。乙醇-醋酸脱色液脱色4-6h，于凝胶成像系统中采集图 像。

1.3.9感官评定

将鳜鱼鱼糜凝胶切成1cm厚度的圆柱体，置于一次性塑料碗中，邀请10名食品专业学 生组成评定小组，主要对色泽、气味、组织状态和表观特征进行评判，每项指标的得分及评 定标准见表1。

表1感官评定标准

1.4数据处理

每个实验重复3～5次，测定结果表示为平均值±标准差，采用PS软件绘图，采用OriginPro 2017软件作图，采用SPSS 16.0软件中的Duncan方法进行方差显著性分析(P<0.05 表示差异显著)。

2结果与分析

2.1反应时间对鳜鱼鱼糜盐度的影响

食盐作为鳜鱼腌制发酵的主要成分，其含量变化反映了鳜鱼的腌制程度，也是判断本实 验应用发酵肠模型发酵鳜鱼时间的主要指标。本研究中新鲜鳜鱼经漂洗后的盐度值为 0.09％，随着反应的进行，盐度的变化很明显。由图2可知，4～24h期间盐度随着时间的变 化越来越大，第24h时，盐度达到1.02％；24～36h期间盐度缓慢增加，反应到36h时盐度 达到最大，随后稍有下降最终趋于平稳。因此，本实验选取反应至48h时测定各指标变化。

2.2TG酶添加量对鳜鱼鱼糜凝胶持水性的影响

持水性可以直观的评价鱼糜的质量和品质，反映蛋白质的结合水能力。由图4可以看 出，添加TG酶后持水性较对照组降低，说明TG酶催化蛋白质交联，使鱼糜基质结构更紧密，因此通过离心从鱼糜凝胶网络中排出更多的水。当TG酶添加量为0.2U/g和0.4U/g时 持水性偏低，说明凝胶基质中存在未结合的过量水经离心后被释放出来。随着TG酶添加量 的增加持水性呈阶段性变化，相比于较低添加量的TG酶来说持水性上升，其中添加量为0.6U/g时持水性达到86.27％。这是因为TG酶催化蛋白交联形成ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共 价结合键，使鱼糜凝胶形成更牢固的三维网络，从而更大限度的包容大量水分。

2.3TG酶添加量对鳜鱼鱼糜色泽的影响

色泽是微生物学和生物化学变化的外部表现，是影响消费者可接受程度的重要指标之 一。由图4可知，添加TG酶后，L*值、a*值和b*值显著上升(P<0.05)，可能是因为TG 酶与蛋白质交联后，凝胶基质中释放的水产生的光色散效应有关，与对照组相比较，所有 TG酶处理组的白度值都有增加，随着TG浓度的增加白度无显著变化(P>0.05)，这与 Chanarat等研究表明TG酶的添加通常对所得鱼糜凝胶的白度没有显著影响结果一致[6]。

2.4TG酶添加量对鳜鱼鱼糜质构的影响

质构特性是评价鱼糜凝胶感官品质的重要参数，能间接反映出蛋白基质的结构完整性及 与其他成分相结合的状态。由图6可以看出，随着TG酶添加量的增加，鱼糜凝胶硬度显著 增大(P<0.05)。当TG酶添加量为0.2U/g时与对照组差异不显著(P>0.05)，添加量为0.4 U/g、0.6U/g、0.8U/g、1.0U/g时硬度显著高于对照组(P<0.05)，硬度分别提高了14％、25％、26％、35％。从弹性变化趋势来看，随着TG酶添加量的增加弹性呈上下往复变化，总体较对照组有所提高，但差异不显著(P>0.05)。添加TG酶以后，能够提高鱼糜凝胶的硬 度和弹性，这可能是因为在加热过程中蛋白高级结构的舒展，疏水基团暴露出来，蛋白分子间发生交联形成更加稳定致密的三维凝胶网络。

黏聚性表示在探头与样品接触时用以克服两者表面间吸引力所必须的总功。胶黏性表示 咀嚼半固体食品至可吞咽状态时所需要的能量，数值上用硬度和黏聚性的乘积表示。当TG 酶添加量为0.2U/g时与对照组相比黏聚性提高了55％，鱼糜凝胶黏聚性的增大可能TG酶催 化蛋白发生交联使得肌球蛋白尾部通过尾对尾相互作用发生连接，从而产生永久性的线和丝 状凝胶网络结构。TG酶添加后胶黏性显著提高(P<0.05)，说明添加TG酶能够增大鱼糜凝 胶内部的粘合力。TG酶添加量为0.8U/g和1.0U/g时胶黏性较0.6U/g组显著上升(P>0.05)， Duangmal等发现添加0.3U/g TG酶可提高凝胶的粘性，考虑到吞咽时口感问题，0.6U/g是 较适合的TG酶添加量。

回弹性用来表示样品形变的外力撤除后，物体迅速恢复原来形状的能力。TG酶添加后 鱼糜凝胶的咀嚼性和回弹性都显著提高(P<0.05)，说明TG可以明显的改善鱼糜凝胶的品 质。当TG酶添加量为0.8U/g时两者数值降低，可以看出咀嚼性和回弹性有良好的相关性。 TG酶添加量为0.2～0.6U/g时咀嚼性和回弹性呈上升趋势，继续增加TG酶添加量两者指标 上下浮动，较0.6U/g添加量变化不显著(P>0.05)。说明添加0.6U/g TG酶足够达到鱼糜凝 胶较为理想的品质。

傅里叶红外光谱分析

蛋白质二级结构是指肽链主链骨架原子的空间构象，不涉及氨基酸残基侧链的空间排 列，二级结构的变化很大程度上决定了蛋白质的功能特性。由图6可以看出，添加不同量 TG酶的傅里叶红外光谱中吸收峰的位置差异较小，但特征峰形存在一定变化。酰胺I带(1600-1700cm-1)与C＝O或C＝N的伸缩振动有关，通常用来分析蛋白质的二级结构，其中1600-1640cm-1属于β-折叠，1640-1650cm-1属于无规则卷曲，1650-1660cm-1属于α-螺 旋，1660-1695cm-1属于β-转角。选择酰胺I带进行去卷积、二阶求导处理，并作高斯曲线 拟合得到蛋白质二级结构的相对含量变化。

由图7可知，鱼糜凝胶中无规则卷曲含量很少，与对照组相比，鱼糜凝胶样品在TG酶 添加量为0.4U/g、0.8U/g、1.0U/g时，无规则卷曲含量变为0％，α-螺旋含量依次减少了6.23％、8.53％、6.69％，β-折叠含量增加了7.69％、7.07％、11.28％，这可能是肌球蛋白发生溶解、展开、聚集，使得α-螺旋部分转化为无规则卷曲和β-折叠[27]。α-螺旋含量降 低，表明了蛋白质分子展开，疏水基团暴露[28]，β-折叠含量增加说明蛋白质分子间聚集程 度增加，从而提高鱼糜凝胶强度。α-螺旋含量减少通常会导致持水性的降低，通过观察α- 螺旋含量变化可以反映持水性的变化，这与测得的持水性数据基本一致。β-转角为蛋白质 分子的无序结构，随着TG酶含量的增加其含量没有较大变化，说明TG酶的加入没有改变 β-转角结构。

2.6扫描电子显微镜的分析

蛋白凝胶的三维网状结构是影响鱼糜质地特性的重要因素。图8的A、B分别为鳜鱼鱼 糜凝胶放大100倍和50倍的电镜图，根据持水性和质构等因素分析，选择TG酶添加量为0.6 U/g鱼糜凝胶观察微观结构。由SEM图可以看出，未添加TG酶处理组形成的凝胶网络松散 无规则，空隙大小不一且分布不均匀，而添加TG酶处理后凝胶网络结构更为紧密，孔洞较 小，分布有序，这是因为TG酶交联形成大量多聚体促进三维网状结构更加稳定。Trespalacios等研究TG酶对鸡肉凝胶微观结构的影响也得到类似的结论。

2.7SDS-PAGE结果

添加不同量TG酶，鳜鱼鱼糜肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白SDS-PAGE图谱如图7所示。鳜鱼鱼糜肌原纤维蛋白主要的条带有肌球蛋白重链(MHC，220kDa)、肌动蛋白 (AC，43kDa)、原肌球蛋白(Tm，36kDa)、2条.肌球蛋白轻链(MLC，17、19kDa)。 MHC带、Tm带随着TG酶添加量的增加逐渐减弱，添加量为1.0U/g时几乎不可辨别，表明 MHC通过TG酶的催化作用形成了ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键，进而提高鱼糜凝胶的硬度和弹 性指标。与对照组相比，加入TG酶后AC带有一定程度的减弱，继续增加TG酶的添加量不 会影响AC带强度，此结果与Hsieh等研究向鲭鱼中添加TG酶可促使MHC聚合，而对AC 带几乎没有影响情况相似。肌球蛋白和肌动蛋白二者以肌动球蛋白复合体形式存在于鱼糜凝 胶中，Choe等指出两者质量比为15:1，且系统中15％～20％的总蛋白以肌动球蛋白复合体存 在，而其余的肌球蛋白为游离状态时，此时凝胶形成能力最大。MLC带在添加不同量TG酶 后发生不同程度的降解，推测TG酶促使肌动球蛋白复合体的形成，从而影响凝胶内聚结构 和肉制品的质地特性。

肌浆蛋白为分子量100kDa以下的水溶性蛋白，主要包括糖酵解酶系、肌酸激酶(40kDa)、肌红蛋白(17.5kDa)。由图7可以看出，鳜鱼鱼糜肌浆蛋白35～63kDa电泳条带依 次为甘油醛磷酸脱氢酶、肌酸激酶、醛缩酶、丙酮酸激活酶，四条条带无明显变化。空白组 肌红蛋白条带清晰，加入TG酶后条带相对减弱，推测鱼糜凝胶红度值的变化可能与TG酶 的加入有关。基质蛋白由几种大分子量蛋白构成，以胶原蛋白和弹性蛋白为主。在基质蛋白 条带中出现一条大分子量蛋白，Visessanguan等推测是胶原蛋白的产物，但加入TG酶后对 基质蛋白作用不明显。

TG酶能催化蛋白质以及肽和各种伯胺之间发生酰基转移，产生交联作用，改善鱼糜凝 胶品质。鳜鱼鱼糜中添加TG酶后，提高了鱼糜凝胶的白度值和质构特性，随着TG酶添加 量的增加回弹性显著增加，这与TG酶促进蛋白交联形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键有关。傅里 叶红外光谱结果显示，添加0.4U/g、0.8U/g、1.0U/g TG酶可以使得α-螺旋含量减少、β- 折叠含量增加，说明适量的TG酶有助于蛋白质分子展开，强化蛋白聚集程度。微观结构显 示，TG酶的添加使鱼糜凝胶网络结构更加紧密，孔径变小。蛋白电泳图谱结果显示，随着TG酶添加量的增加，肌球蛋白重链条带减弱程度越明显，可见TG酶促进蛋白交联，增强鱼糜凝胶三维网络结构。但过量添加TG酶，会影响质构和感官评价结果。综合来看，在鳜鱼 鱼糜凝胶中添加0.4U/g和0.6U/g TG酶，可有效改善其凝胶品质，为鳜鱼发酵加工应用提供理论支撑。

实施例2：一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的建立方法

一种用于臭鳜鱼腌制效果分析的半透膜肠模型的建立方法，包括下列步骤：

步骤1：将鲜活鳜鱼作为原材料，宰杀后去除内脏、鳃和鳞，留取鳜鱼鱼肉；

步骤2：将鳜鱼鱼肉去皮去骨，搅碎得到粗鱼糜；将粗鱼糜放入其体积3-5倍的0-4℃的 蒸馏水中漂洗2-3次，然后用灭菌纱布拧干其中水分，得到鱼糜；

步骤3：将半透膜透析袋置于pH只为8.0±0.2的溶液中煮沸10-12min；冷却后取出透析 袋，用蒸馏水浸泡清洗；

步骤4：将所述鱼糜放入半透膜透析袋中，半透膜透析袋的两端密封，形成鱼糜半透膜 肠；然后将鱼糜半透膜肠放入一容器中，再向所述容器中加入盐水，使盐水完全浸没半透膜 肠，将装有盐水和鱼糜半透膜肠的容器放入洁净的0-6℃环境中，即构建了半透膜肠模型。

优选的实施方式为：所述半透膜透析袋的型号为MD34-5M、材质为标准RC膜。

优选的实施方式为：所述半透膜透析袋的预处理方法包括：用NaHCO

优选的实施方式为：盐水的浓度30g/L，鱼糜半透膜肠与盐水的质量比例为1:4。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之 限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本 发明意图保护之范畴。