一种活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种可吸收、无刺激性、安全性高、使用方便、与组织粘附效果极佳的活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用。

背景技术

水凝胶，是一种可增强吸收的水基凝胶，常用于经皮和经粘膜给药。肽基水凝胶材料，由于具有良好的生物相容性、可逆性和可降解性等特点，被广泛应用于组织工程、药物递送和细胞培养等领域。目前可形成肽基水凝胶材料的肽类型包括离子互补型、肽两亲物和β-发夹型等。例如：美国专利US5670483A公开了一种发现于酵母蛋白中的离子互补肽(EAK16)，可自组装形成凝胶支架材料，该成果被誉为麻省理工学院七十年以来的最重要的15项成果之一。

例如公开号为CN111387508A的发明专利公开了一种锌螯合肽凝胶，包括组分：贝类活性肽9mmol/L，ZnCl

例如公开号为CN102348717B的发明专利，公开了系列具有特定氨基酸序列的自组装肽，并由此获得具有高力学强度的肽凝胶。

但上述肽凝胶材料所涉及的肽段序列较长，提取合成困难，成本高。因此开发成本可控，具有特定活性功能的寡肽凝胶具有广泛的市场前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用，尤其提供一种可吸收、无刺激性、安全性高、使用方便、与组织粘附效果极佳的活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种活性寡肽水凝胶材料，所述活性寡肽水凝胶材料包括活性寡肽以及与其络合的金属离子；

所述活性寡肽包括棕榈酰寡肽、棕榈酰寡肽衍生物、肉豆蔻酰寡肽、肉豆蔻酰寡肽衍生物中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所涉及的活性寡肽水凝胶材料中活性寡肽的肽段序列较短、提取合成容易、成本低，且具有特定活性功能；金属离子广泛地存在生物体内，在参与生命体系中的多种化学反应和信号转导等重要生理活动方面起着至关重要的作用，例如大多数生物学研究表明，银离子具有与活细胞形成复合物无以产生负责组织再生的干细胞，具有抗菌活性。铜离子可以促进纤维细胞胶原蛋白的合成；镁离子可参与蛋白质的合成；锌在核酸结合蛋白和基因调节蛋白中起结构作用；铁离子是运输氧的重要因子。本发明很好地融合了金属离子和活性寡肽各自的特点，在提高材料机械强度的同时，进一步协同增效，获得了一种可吸收、无刺激性、安全性高、使用方便、与组织粘附效果极佳的活性生物敷料材料。

本发明所涉及的水凝胶材料为透明凝胶或半透明凝胶形式，具有可逆的溶胶/凝胶转变特性，具有剪切变稀的流变特性。

所述至少两种的组合例如棕榈酰寡肽和肉豆蔻酰寡肽的组合、棕榈酰寡肽和棕榈酰寡肽衍生物的组合、肉豆蔻酰寡肽和肉豆蔻酰寡肽衍生物的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述棕榈酰寡肽包括棕榈酰二肽-7、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、棕榈酰三肽-8、棕榈酰三肽-28、棕榈酰三肽-38、棕榈酰四肽-3、棕榈酰四肽-5、棕榈酰四肽-7、棕榈酰四肽-10、棕榈酰五-4、棕榈酰五-5、棕榈酰六肽-9、棕榈酰六肽-19、棕榈酰六肽-14、棕榈酰六肽-15或棕榈酰七肽-5中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如棕榈酰二肽-7和棕榈酰三肽-1的组合、棕榈酰三肽-5和棕榈酰三肽-8的组合、棕榈酰三肽-28和棕榈酰三肽-38的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

所述肉豆蔻酰寡肽包括肉豆蔻酰六肽-4、肉豆蔻酰六肽-5或肉豆蔻酰四肽-12中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如肉豆蔻酰六肽-4和肉豆蔻酰六肽-5的组合、肉豆蔻酰六肽-5和肉豆蔻酰四肽-12的组合、肉豆蔻酰六肽-4和肉豆蔻酰四肽-12的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述活性寡肽为棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7或棕榈酰五肽-4中的任意一种或至少两种的组合。

本发明更优选棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7或棕榈酰五肽-4中的任意一种或至少两种的组合作为活性寡肽成分是因为这些类型在与金属离子进行协同配合时，具有更好的协同增效效果，在作为活性生物敷料材料进行使用时，对促进伤口的愈合效果更加显著。

优选地，所述金属离子包括锌离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、镁离子、钒离子、钼离子、锰离子、钙离子、钴离子、银离子、铬离子或硒离子中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如锌离子和亚铁离子的组合、铁离子和铜离子的组合、锰离子和钙离子的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述活性寡肽在水凝胶材料中的摩尔浓度为0.5-100mM，例如0.5mM、2mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选为1-50mM；进一步优选为2-20mM。

优选地，所述活性寡肽水凝胶材料中，活性寡肽与金属离子的摩尔比为1:10-20:1，例如1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、4:1、5:1、10:1、12:1、15:1或20:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选为1:5-10:1；进一步优选为1:2-5:1。

所述活性寡肽与金属离子的摩尔比特定选择为1:10-20:1的数值范围，是因为在此范围内，活性寡肽在与金属离子进行协同配合时，具有更好的协同增效效果，在作为活性生物敷料材料进行使用时，对促进伤口的愈合效果更加显著，优选为1:5-10:1，进一步优选为1:2-5:1。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的活性寡肽水凝胶材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将活性寡肽分散于水介质溶液中，再与金属盐混合，升温至溶解状态，可选地进行保温，然后静置降温，得到所述活性寡肽水凝胶材料。

本发明通过将活性寡肽分散在水介质中，经由金属络合及程序控温等操作处理，通过多重分子间作用形成具有预定特性的凝胶材料，实现了工程化活性寡肽的凝胶化过程，可作为制备肽基凝胶的新思路。同时可灵活控制金属络合比例及凝胶化过程，调控该凝胶材料的流变特性，所得产品的稳定均一，耐寒耐热性能好。

优选地，所述水介质溶液包括纯水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲生理盐水、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液或二甲胂酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述水介质溶液中活性寡肽的浓度为0.05-10mmol，例如0.05mmol、0.5mmol、1mmol、2mmol、3mmol、5mmol、8mmol或10mmol等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述升温是指升温至37-80℃，例如37℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保温时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述降温速率为1-10℃/h，例如1℃/h、2℃/h、3℃/h、5℃/h、6℃/h、8℃/h或10℃/h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的活性寡肽水凝胶材料在制备药物递送系统中的应用。

第四方面，本发明提供一种药物递送系统，所述药物递送系统以如第一方面所述的活性寡肽水凝胶材料为载体，负载其他活性成分。

优选地，所述其他活性成分包括药物分子、免疫调节因子、神经肽类分子或细胞因子中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如药物分子和免疫调节因子的组合、免疫调节因子和神经肽类分子的组合、神经肽类分子和细胞因子的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的活性寡肽水凝胶材料在制备褥疮制剂、慢性伤口修复制剂、急性组织损伤修复制剂或由手术切口引起的组织间隙填充修复制剂中的应用。

传统的伤口处理方式存在伤口脱水、结痂，不利于上皮细胞分裂生长；护理材料易流失，愈合速度缓慢；材料与创面粘连，更换敷料时患者疼痛；容易发生再次性机械损伤。现代伤口愈合理论更推荐采用湿性愈合方式，利用本发明所涉及的水凝胶材料，创造伤口湿润和微酸的愈合环境，从而保护创面、减轻伤口疼痛、促进肉芽组织生长、溶解黑痂及坏死组织，填充窦道及腔隙类伤口。该水凝胶材料具有可吸收、无刺激性、安全性高、使用方便、与组织粘附效果极佳等优点。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的活性寡肽水凝胶材料中活性寡肽的肽段序列较短、提取合成容易、成本低，且具有特定活性功能；金属离子广泛地存在生物体内，在参与生命体系中的多种化学反应和信号转导等重要生理活动方面起着至关重要的作用。本发明很好地融合了金属离子和活性寡肽各自的特点，在提高材料机械强度的同时，进一步协同增效，获得了一种可吸收、无刺激性、安全性高、使用方便、与组织粘附效果极佳的活性生物敷料材料。

本发明通过将活性寡肽分散在水介质中，经由金属络合及程序控温等操作处理，通过多重分子间作用形成具有预定特性的凝胶材料，实现了工程化活性寡肽的凝胶化过程，可作为制备肽基凝胶的新思路。同时可灵活控制金属络合比例及凝胶化过程，调控该凝胶材料的流变特性，所得产品的稳定均一，耐寒耐热性能好。

附图说明

图1是各实施例制备的活性寡肽水凝胶的实物图(其中a、c、d分别对应于实施例1、2、3；b为实施例1制备的活性寡肽水凝胶剪切后破坏后呈现溶液态的实物图)；

图2是实施例4的活性寡肽水凝胶的圆二色谱图；

图3是各实施例制备的活性寡肽水凝胶的实物图(其中a、c、d、d、e分别对应于实施例5、6、7、8、11)；

图4是实施例9的活性寡肽水凝胶的傅里叶红外光谱图；

图5是实施例10的活性寡肽水凝胶的透射电子显微照片；

图6是实施例11的活性寡肽水凝胶的扫射电子显微照片。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取2.0mmol的棕榈酰六肽-9，分散在100mL的磷酸盐缓冲生理盐水(0.1M，pH＝7.4)中，再加入0.1mmol氯化锌，混合均匀后，升温至80℃，得均匀分散溶液；放置于4℃，静置老化12h，最终得到棕榈酰六肽-9的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图1中的a，该水凝胶外观均一透明，倒置后呈不流动的状态。在用注射前推拉剪切后(模拟涂抹作用)，即可转变为溶胶状态，如图1中的b所示。

实施例2

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.8mmol的棕榈酰三肽-5，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷水溶液(0.01M)中，加入0.8mmol硝酸银，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；保温0.5小时后，缓慢降温(降温速率为5℃/h)，静置老化8h，最终得到棕榈酰三肽-1的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图1中的c所示，该水凝胶外观均一，为透明状，倒置后呈不流动的状态。

实施例3

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.8mmol的棕榈酰五肽-4，分散在100mL的pH＝7.4磷酸盐缓冲生理盐水中，加入0.8mmol氯化钴，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；放置于4℃，静置老化12h，最终得到棕榈酰五肽-4的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图1中的d所示，该水凝胶外观均一，为透明状，倒置后呈不流动的状态。

实施例4

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.1mmol的棕榈酰四肽-7，分散在100mL的pH＝7.4磷酸盐缓冲生理盐水中，加入0.2mmol硫酸铜，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；保温1小时后，缓慢降温(降温速率为10℃/h)，静置老化4h，最终得到棕榈酰四肽-7的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶的圆二色光谱如图2。结果显示，水凝胶内部维结构呈“β-折叠”态，表明分子间的相互作用诱导形成有序结构，是其呈现凝胶纤维的原因。

实施例5

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.5mmol的棕榈酰四肽-10，分散在100mL的0.01M三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液中，加入0.05mmol硫酸铜，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；保温1小时后，缓慢降温(降温速率为2℃/h)，静置老化24h，最终得到棕榈酰四肽-10的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图3中的a，呈现均一，半透明凝胶态。

实施例6

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取10mmol的棕榈酰三肽-1，分散在100mL的pH＝7.4磷酸盐缓冲生理盐水中，加入5mmol硝酸银，混合均匀后，升温至80℃，得均匀分散溶液；缓慢降温(降温速率为5℃/h)，老化12h，最终得到棕榈酰三肽-1的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图3中的b，呈现均一澄清透明凝胶态。

实施例7

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.05mmol的棕榈酰三肽-8，分散在100mL的pH＝6.5磷酸盐缓冲生理盐水中，加入0.5mmol硝酸银，混合均匀后，升温至37℃，得均匀分散溶液；放置于25℃，静置老化12h，最终得到棕榈酰三肽-8的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图3中的c，呈现均一澄清透明凝胶态。

实施例8

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取1.0mmol的棕榈酰三肽-5，分散在100mL pH为8.0的磷酸盐缓冲生理盐水中，加入0.5mmol氯化铜，混合均匀后，升温至50℃，得均匀分散溶液；缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，最终得到棕榈酰三肽-5的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图3中的d，该水凝胶外观均一澄清透明凝胶态。

实施例9

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.05mmol的棕榈酰三肽-1，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，加入0.1mmol硝酸银，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，最终得到棕榈酰四肽-7的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶的傅里叶红外光谱如图4所示。红外光谱图中可见：归属于羰基C＝O的伸缩振动游离和分子内的羧酸氢键特征峰的发生蓝移，显示分子更强的分子间氢键相互作用；归属于羧基的对称和反对称的发生蓝移，验证了活性寡肽与金属离子之间的配位作用。

对比例1

本对比例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法与实施例9的区别仅在于去除加入金属离子的步骤：称取0.05mmol的棕榈酰三肽-1，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，升温至60℃，将分散溶液缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，即得。

实施例10

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.05mmol的棕榈酰四肽-7，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，加入0.1mmol硝酸银，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，最终得到棕榈酰四肽-7的水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶的透射电子显微镜图片如图5所示，结果显示所得到的水凝胶的微观结构为纤维交织构成的三维网络结构。

对比例2

本对比例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法与实施例10的区别仅在于去除加入金属离子的步骤：称取0.05mmol的棕榈酰四肽-7，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，升温至60℃，将分散溶液缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，即得。

实施例11

本实施例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法如下：

称取0.05mmol的棕榈酰三肽-1和0.05mmol的棕榈酰四肽-7，分散在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，加入0.1mmol硝酸银，混合均匀后，升温至60℃，得均匀分散溶液；缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，最终得到混合活性寡肽水凝胶。

上述工艺条件下，所得到的水凝胶实物图如图3中的e，该水凝胶外观均一澄清透明凝胶态，其扫描电子显微镜图片如图6所示，结果显示所得到的水凝胶的微观结构为纤维交织构成的三维网络结构。

对比例3

本对比例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法与实施例11的区别仅在于去除加入金属离子的步骤：称取0.1mmol硝酸银，溶解在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，升温至60℃，将分散溶液缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置老化12h，即得。

对比例4

本对比例提供一种活性寡肽水凝胶材料，制备方法与实施例11的区别仅在于去除加入活性寡肽的步骤：称取0.05mmol的硝酸银，溶解在100mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(1mM)中，升温至60℃，将溶液缓慢降温(降温速率为3℃/h)，静置12h，即得。

评价试验——促小鼠皮肤愈合评价试验：

通过构建小鼠全皮损模型和测定伤口愈合收缩率来评价上述实施例和对比例的促皮肤愈合效果。将32只雄性30-34g，体格健康的昆明小鼠，随机分称8组，分别为空白组(PBS，阴性对照组)，对照组1(对比例1)，对照组2(对比例2)，对照组3(对比例3)，对照组4(对比例4)，实验组1(实施例9)，实验组2(实施例10)，实验组3(实施例11)；每组4只，麻醉处理后，在每只小鼠备部剪取6mm的圆形伤口并拍照记录伤口大小，作为全皮损模型。按照分组每组分别用不用材料处理伤口。到第3天、第7天和第14天，观察记录小鼠背部伤口面积。伤口面积和原始面积的比值被用于表征其愈合率，计算公式如下式：

Si％＝1-Si/S0×100％

Si表示第i天的每组小鼠背部伤口的平均面积，i为3，7，14；S0表示原始伤口面积。

结果如表1所示：

表1

由表1数据可知：本发明所涉及的活性寡肽水凝胶材料相比于单独的活性寡肽或者金属离子具有更显著的促愈合效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种活性寡肽水凝胶材料及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。