铱纳米棒、复合纳米探针、ECL比率型生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农药检测技术领域，具体而言，涉及铱纳米棒、复合纳米探针、ECL比率型生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

电致化学发光(ECL)作为一种结合了电化学和化学发光的新型分析技术，具有简单，快速，灵敏，可控性强等优点，在研究领域和工业领域都具有巨大的发展势头。

对于ECL检测，ECL发光体的选择是至关重要的。在各种发光体如有机小分子、有机聚合物、无机纳米材料和过渡金属络合物，其中，Ir(III)和Ru(II)配合物因其良好的氧化还原稳定性和长的发光寿命成为ECL领域的主流。与Ru(II)配合物相比，Ir(III)配合物不仅具有更高的量子产率，而且可通过改变配体结构来调节其电化学性质和发射波长，从而为构建电位分辨和多色复合ECL系统提供了有利的机会。然而，由于Ir(III)配合物在水溶液中的溶解度较差，因此，必须在有机溶液(如乙腈(CH

到目前为止，基于Ir(Ⅲ)配合物的ECL检测模式一般为单信号检测模型，存在假阳性或假阴性的问题。比率型ECL分析可通过两个ECL信号自校准以有效消除仪器或环境干扰，已广泛应用于DNA，microRNA，抗原，抗体，癌细胞和离子的检测。通常，在ECL比率分析中，两个信号的不同变化趋势是通过共振能量转移(RET)或竞争性消耗共反应试剂如H

有机磷农药(OPs)作为农业生产中常用的农药，可以有效解决农作物病虫害的问题。但是，长期的不合理使用会使食物和水受到严重污染，并严重威胁人类健康和环境。因此，实现OPs残留物的准确检测非常重要。在多种检测方法中，包括酶联免疫吸附法，色谱法，光谱法，电化学法和荧光分析法，ECL比率检测由于其优越的准确性，可靠性和灵敏性，已成为检测OPs的首选方法。迄今为止，在ECL领域中Ir(III)配合物的发展仍处于起步阶段，尚无关于基于Ir(III)配合物的ECL比率法测定OPs的报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供铱纳米棒、复合纳米探针、ECL比率型生物传感器及其制备方法和应用。本发明提供的铱纳米棒水溶性优异，且具有高发光效率，可以制备双信标的复合探针，继而可以用于制备能同时实现增强阴极信号并猝灭阳极信号的传感器，继而能够有效检测有机磷的含量。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种铱纳米棒，其为将铱配合物羧基功能化后形成的纳米棒。

第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的铱纳米棒的制备方法，包括：将所述铱配合物羧基功能化形成所述纳米棒。

第三方面，本发明提供一种复合纳米探针，其包括前述实施方式上述的铱纳米棒和所述铱纳米棒上负载的量子点；

优选地，所述量子点为具有以下要求的量子点：(1)负电位发光；(2)与铱纳米棒的发光互不影响；(3)能够与铱纳米棒的羧基反应使得所述量子点被交联到所述铱纳米棒上；

优选地，所述量子点为硫化镉量子点；

优选地，所述复合纳米探针中上述铱纳米棒为阳极发光体，所述量子点为阴极发光体。

第四方面，本发明提供一种前述实施方式所述的复合纳米探针的制备方法，包括：将量子点负载于所述铱纳米棒上；

优选地，负载包括：将活化剂与所述铱纳米棒混合活化所述铱纳米棒上的羧基，而后再与缩合剂和量子点混合进行反应；

优选地，所述活化剂为羧基活化试剂，优选为EDC，所述缩合剂为NHS；

优选地，所述活化剂与所述缩合剂的摩尔比为3.8-4.2:1。

第五方面，本发明提供一种ECL比率型生物传感器，其包括前述实施方式所述的复合纳米探针和固定于所述复合纳米探针上的酶；

优选地，所述酶为乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶；

优选地，所述ECL比率型生物传感器包括电极，优选为玻碳电极；

优选地，所述复合纳米探针附着于所述电极表面，所述酶固定于所述复合纳米探针上。

第六方面，本发明提供一种ECL比率型生物传感器的制备方法，包括：将酶固定于所述复合纳米探针上；

优选地，包括：对电极进行预处理，而后将所述复合纳米探针涂布于所述电极上并干燥，接着，将含有所述酶的生物复合材料涂布于所述电极上，并在3-5℃的条件下进行孵育。

第七方面，本发明提供一种前述实施方式所述的铱纳米棒、前述实施方式所述的复合纳米探针或前述实施方式所述的ECL比率型生物传感器在检测有机磷中的应用；

优选地，所述有机磷为有机磷农药；

优选地，所述有机磷农药为植株上残留的有机磷农药。

第八方面，本发明提供一种检测有机磷的方法，包括利用前述实施方式所述的ECL比率型生物传感器检测有机磷含量；

优选地，检测步骤包括：在3-5℃利用所述ECL比率型生物传感器孵育有机磷，而后利用检测液进行ECL检测，所述检测液为包括TPrA和ATCl的PBS溶液；

优选地，所述PBS的pH为7.0-7.4；

优选地，所述PBS中TPrA的浓度为4.8-5.2mM，所述PBS中ATCl的浓度为0.25-0.28mM；

优选地，检测的有机磷的含量范围为：5.0×10

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新的铱纳米棒，其通过对铱配合物进行羧基功能化，继而不仅仅改变铱配合物的形态，使其为纳米棒结构，还大幅度提升铱配合物的水溶性，使得形成铱纳米棒有良好的水溶性，且具有高发光效率，扩大了铱配合物在ECL中的应用。

同时，本发明实施例通过将铱纳米棒与量子点作用形成在正电位和负电位均能发光的双信标复合纳米探针，使得酶促反应产生的双功能过氧化氢对两个ECL信号有相反的作用，继而可以更准确检测有机磷。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的ECL传感结构示意图及其对OPs的响应示意图；

图2为本发明实施例的提供的表征1的结果图；

图3为本发明实施例的提供的表征2的结果图；

图4为本发明实施例的提供的表征3的X射线光电子能谱的结果图；

图5为本发明实施例的提供的表征4的结果图；

图6为本发明实施例的提供的实验的结果图；

图7为本发明实施例的提供的可行性分析2的结果图；

图8为本发明实施例的提供的ECL机制图的结果图；

图9为本发明实施例的提供的重现性和稳定性的结果图；

图10为本发明实施例的提供的表征3的FT-IR光谱和UV-vis吸收光谱结果图；

图11为本发明实施例提供的ECL检测条件确定的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种铱纳米棒，其为将铱配合物羧基功能化后形成的纳米棒。本发明将铱配合物羧基功能化不仅仅能提升铱配合物的水溶性，还更改了铱配合物的形态，由原料的粉末、颗粒等变为棒状结构的纳米棒，有利于后续形成ECL纳米探针。同时，羧基功能化还提升了铱配合物的发光效率，提升铱配合物在ECL中的应用。且该铱纳米棒能够良好的负载于电极上，进一步提升铱纳米棒的检测效率。

铱纳米棒的水接触角为45-47度；优选为46.29度；本发明将铱配合物羧基功能化形成铱纳米棒后，大幅度降低了水接触角，继而进一步说明形成铱纳米棒有优异的水溶性。

其中，铱配合物为三(2-苯基吡啶)铱(III)、三(1-苯基异喹啉)铱(III)和二(2-苯基喹啉-C2,N＇)(乙酰丙酮)合铱(III)中的任意一种，实现所述铱配合物羧基功能化的功能化物质为聚(苯乙烯-马来酸酐)。采用上述物质有利于铱纳米棒的形成。

参见图1，本发明实施例还提供一种上述铱纳米棒的制备方法，包括：将所述铱配合物羧基功能化形成所述纳米棒。本发明实施例采用纳米沉淀法使得铱配合物羧基功能化形成纳米棒，本发明实施例提供的制备方法更简单，操作条件易于实现，且制备得到的铱纳米棒性能稳定，后续能够稳定地附着在电极上。

具体地，将所述铱配合物与功能化物质溶解分别形成铱配合物溶液和功能化物质溶液(溶解采用的溶剂可以是THF等)，而后将所述铱配合物溶液和所述功能化物质溶液在溶剂(该溶剂可以为水等)中混合，接着，去除形成所述铱配合物溶液和所述功能化物质溶液的溶剂；其中，铱配合物溶液的浓度为0.8-1.2mg/ml，例如为0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml以及1.2mg/ml等任意数值；所述功能化物质溶液的浓度为0.8-1.2mg/ml，例如为0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml以及1.2mg/ml等任意数值；铱配合物与所述功能化物质的质量比为1.8-2:1，例如为1.8:1、1.9:1以及2:1等任意数值；采用上述条件有利于铱纳米棒的形成。

本发明实施例还提供一种复合纳米探针，其包括上述铱纳米棒和所述铱纳米棒上负载的量子点；其中，该量子点为具有以下要求的量子点：(1)负电位发光；(2)与铱纳米棒的发光互不影响；(3)能够与铱纳米棒的羧基反应使得所述量子点被交联到所述铱纳米棒上；例如为硫化镉量子点，硫化镉量子点仅为举例，其他满足上述要求的量子点也在本发明的保护范围内。

进一步地，上述复合纳米探针中所述铱纳米棒为阳极发光体(即正电位发光)，所述量子点为阴极发光体(即负电位发光)，也就是说该复合纳米探针既可以在正电位发光也可以在负电位发光，且互不影响，那么使得后续酶促反应产生的双功能过氧化氢(H

本发明实施例还提供一种上述复合纳米探针的制备方法，包括：将量子点负载于所述铱纳米棒上。具体地，将活化剂与所述铱纳米棒混合活化所述铱纳米棒上的羧基，而后再与缩合剂和量子点混合进行反应；其中，活化剂为羧基活化试剂，例如为EDC，所述缩合剂为NHS，当然，其他活化剂或者缩合剂也可以。活化剂与所述缩合剂的摩尔比为3.8-4.2:1，例如为3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1以及4.2:1等任意数值。采用上述条件有利于复合纳米探针的形成，继而有利于保证复合纳米探针的性能。

本发明实施例提供一种ECL比率型生物传感器，其包括上述复合纳米探针和固定于所述复合纳米探针上的酶，其中，酶为乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶，即以上述复合纳米探针为基体，将乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶固定于基体上，采用上述ECL比率型生物传感器能够有效检测有机磷。

进一步地，ECL比率型生物传感器包括电极，优选为玻碳电极；复合纳米探针附着于所述电极表面，所述酶固定于所述复合纳米探针上。

参见图1，该ECL比率型生物传感器的工作过程是：在没有OPs(有机磷)存在时，发生酶促反应并生成H

本发明实施例还提供一种上述ECL比率型生物传感器的制备方法，包括：将酶固定于所述复合纳米探针上。具体地，对电极进行预处理，而后将所述复合纳米探针涂布于所述电极上并干燥，接着，将含有所述酶的生物复合材料涂布于所述电极上，并在3-5℃的条件下进行孵育。采用上述条件有利于复合纳米探针和酶作用于电极上，继而保证该传感器的性能。

进一步地，本发明实施例还提供一种上述铱纳米棒、复合纳米探针或ECL比率型生物传感器在检测有机磷中的应用；其中，所述有机磷为有机磷农药；所述有机磷农药为植株上残留的有机磷农药。

本发明实施例还提供一种检测有机磷的方法，包括：利用上述ECL比率型生物传感器检测有机磷含量；具体地，在3-5℃利用所述ECL比率型生物传感器孵育有机磷，而后利用检测液进行ECL检测，所述检测液为包括TPrA和ATCl的PBS溶液；其中，所述PBS的pH为7.0-7.4，例如为7.0、7.1、7.2、7.3或7.4等任意数值；所述PBS中TPrA的浓度为4.8-5.2mM，例如为4.8mM、4.9mM、5.0mM、5.1mM和5.2mM等任意数值，所述PBS中ATCl的浓度为0.25-0.28mM，例如为0.25mM、0.26mM、0.27mM和0.28mM等任意数值。采用上述检测条件保证有机磷的检测结果的准确性。

其中，检测的有机磷的含量范围为：5.0×10

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种铱纳米棒(编号为Ir NDs)的制备方法，包括：

将三(2-苯基吡啶)铱(Ir(ppy)

实施例2

本实施例提供一种复合纳米探针(编号为Ir NDs@CdS QDs)的制备方法，包括：

S1、制备硫化镉量子点(编号为CdS QDs)

对现有技术：B.Zhou,M.Y.Zhu,Y.Hao,P.H.Yang,Potential-resolvedelectrochemiluminescence for simultaneous determination of triple latenttuberculosis infection markers,ACS Appl.Mater.Interfaces 9(2017)30536-30542.稍加修改合成硫化镉量子点。具体为：

在室温下将L-半胱氨酸(0.363g)，CdCl

S2、制备Ir NDs@CdS QDs

将1.0mL实施例1制备得到的Ir NDs的悬浮液(0.1mg/mL)和EDC混合搅拌15分钟，活化Ir NDs的羧基。然后将NHS加入上述混合物中，并注入4.0mL CdS QDs。之后，混合物在室温(20℃-30℃之间)下充分反应过夜。用无水乙醇和超纯水的混合溶液洗涤3次以除去过量的EDC/NHS，获得Ir NDs@CdS QDs的双信标复合纳米探针。

实施例3

本实施例提供一种ECL比率型生物传感器(编号为：AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs/GCE)的制备方法，包括：

分别用0.3和0.05μm的氧化铝浆液反复抛光直径为4mm的玻碳电极(编号为GCE)，然后用乙醇和超纯水进行超声清洗。在空气中干燥后，在GCE滴涂10μL复合纳米探针(IrNDs@CdS QDs)，在室温(20-30℃)下过夜，获得Ir NDs@CdS QDs/GCE。滴加10μL AChE-ChOx生物复合材料，在4℃下孵育12小时以获得生物传感器(AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs/GCE)。存储在冰箱中备用。

表征1

透射电子显微镜(TEM)表征实施例1制备得到的铱纳米棒和实施例2制备得到的硫化镉量子点和复合纳米探针，利用元素映射表征实施例2制备得到的复合纳米探针，表征结果参见图2。图2中A为铱纳米棒的TEM图，图2中B为硫化镉量子点的TEM图；图2中C为复合纳米探针的TEM图；图2中D为复合纳米探针TEM图，E-I为相应元素映射表征图。

如图2中A所示，Ir NDs呈现出具有优异分散性的棒状结构，平均长度和直径分别为707nm和65nm。图2中B所示，CdS QDs呈现出理想的晶体结构，晶面间距为0.334nm，这与文献报道的结果相吻合。图2中C所示，CdS QDs均匀地附着在棒状Ir NDs的表面上，表明了IrNDs@CdS QDs纳米探针的成功制备。图2中D-I所示，Ir，S，Cd，O和N元素在Ir NDs@CdS QDs中同时存在。以上结果证实了Ir NDs@CdS QDs的成功制备。

表征2

检测Ir(ppy)

Ir(ppy)

表征3

利用X射线光电子能谱(XPS)来表征Ir NDs和Ir NDs@CdS QDs，检测结果参见图4。如图4中A-C所示，Ir NDs的XPS的测试结果显示了Ir4f，C1s，N1s和O1s的峰。Ir4f(61.20eV)，C1(284.80eV)，N1(399.52eV)主要来自Ir(ppy)

此外，还测量了Ir NDs，CdS QDs和Ir NDs@CdS QDs的FT-IR光谱和UV-vis吸收光谱，结果显示在图10。FT-IR光谱和UV-vis吸收光谱的结果进一步证实了Ir NDs和Ir NDs@CdS QDs纳米复合材料的合成。

表征4

使用循环伏安法(CV)对ECL比率型生物传感器的制备进行表征，在5.0mM K

图5中A曲线a显示裸电极的CV曲线。与之相比，Ir NDs@CdS QDs修饰的GCE氧化还原峰值电流下降(曲线b)，这归因于Ir NDs@CdS QDs差的导电性。当将AChE-ChOx孵育到IrNDs@CdS QDs/GCE上时，由于酶不导电，峰值电流进一步降低(曲线c)。此外，用电化学阻抗谱(EIS)技术来研究生物传感器的制备步骤。图5中B描述了相应的结果，其与CV表征结果一致。CV和EIS结果均表明生物传感器的成功制备。

实验

制备实际样品:将5.0g洗净的卷心菜，小菜和生菜样品分别研磨成汁后，将由丙酮(0.5mL)和0.10M pH 7.4PBS(4.5mL)组成的混合溶液加入上述蔬菜汁中。超声10分钟之后，8000rpm离心15分钟来收集上清液。

ECL测定:4℃下，在AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs/GCE上孵育不同浓度(5.0×10

对比例：将AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs/GCE替换为Ir NDs/GCE，区别在于在制备生物传感器时，将AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs替换为铱纳米棒。

检测结果参见图6，其中，图6中B表示：在(a)至(h)不同浓度的H

如图6中B所示，随着H

如图6中D所示，当OPs浓度增加时，Ir NDs的阳极信号逐渐上升，而CdS QDs的阴极信号相应地下降。图6中E显示了阴极和阳极信号强度随着OPs浓度的对数的变化。当OPs浓度在5.0×10

可行性分析1

使用ECL比率型生物传感器(AChE-ChOx/Ir NDs@CdS QDs/GCE)研究了比率检测的可行性，结果如图6中A所示，与不含酶底物硫代乙胆碱(ATCl)的曲线a相比，在存在ATCl的情况下获得的曲线b显示出CdS QDs的阴极信号增加，而Ir NDs的阳极信号下降，这归因于ATCl水解产生的硫代胆碱经ChOx催化生成H

可行性分析2

对阳极ECL发光体的ECL光谱和阴极ECL发光体的紫外可见吸收光谱进行了测量，以研究它们之间可能的能量转移。结果参见图7，如图7中A所示，CdS QDs的UV-vis特征吸收峰位于432nm(曲线a)，而Ir NDs最大的ECL光谱在543nm处(曲线b)。如预期的那样，它们之间没有光谱重叠。

此外，研究了两个ECL信号之间的相互作用，即为GCE，Ir NDs/GCE，CdS QDs/GCE和Ir NDs@CdS QDs在含5.0mM TPrA的0.10M PBS(pH7.4)中的ECL响应(电位扫描范围为-1.3V～+1.2V)。图7中B显示了在含5.0mM TPrA的0.10M PBS(pH 7.4)中不同修饰电极的ECL响应。如图所示，裸电极(粉红色曲线)无ECL响应，而Ir NDs/GCE在+1.2V(红色曲线)上呈现出很强的ECL发射，CdS QDs/GCE在-1.3V(黑色曲线)上呈现出了较弱的ECL发射。在Ir NDs@CdS QDs/GCE(蓝色曲线)上，同时观察到来自Ir NDs的阳极信号和来自CdS QDs的阴极信号。此外，阳极信号强度几乎与Ir NDs修饰的电极相同，阴极ECL信号强度几乎与CdS QDs修饰的电极相同。以上结果表明，Ir NDs和CdS QDs之间没有发生能量转移。

ECL检测条件确定

(1)优化PBS溶液的pH(0.27mM的ATCl)

检测结果参见图11中的A，如图11中的A所示，当pH从6.0升高到7.4时，观察到IrNDs的ECL信号减少，而CdS QDs的ECL信号增加。pH值超过7.4时，阳极强度增加，阴极信号逐渐下降。原因如下：随着pH值升高(从6.0升高到7.4)，更多的H

(2)不同浓度的ATCl下测试了生物传感器的ECL响应

检测结果参见图11中的B，如图11中的B所示，当PBS中的ATCl(0.10M，pH 7.4)浓度从0上升至0.27mM时，Ir NDs的ECL信号强度逐渐下降，而CdS QDs的ECL信号强度逐渐增加。ATCl的浓度超过0.27mM后，两个信号的强度随ATCl浓度的增加而变化不大。原因如下：在AChE-ChOx存在下，ATCl水解，催化生成H

重现性和稳定性

通过批间和批内分析研究ECL比率型生物传感器的重现性。具体地，在不同批次和相同批次制备的四个生物传感器上孵育5.0×10

潜在适用性

选择小白菜，卷心菜和生菜作为实际样品，以评估比率型生物传感器在检测OPs中的潜在适用性。使用准备的三个实际样品，通过标准加入法进行回收实验。如下所示，

由上表可知，小白菜，卷心菜和生菜样品中OPs的回收率分别为91.9％～98.7％，101％～108％，93.3％～101％，表明该生物传感器在实际样品分析中的具有潜在应用价值。

综上所述，本发明实施例通过将铱配合物羧基功能化，制备得到具有高发光效率的水溶性铱纳米棒，扩大了铱配合物在ECL中的应用。其次，结合上述铱纳米棒和量子点，特别是硫化镉量子点，形成双信标复合纳米探针，用于构建ECL比率型生物传感器。双功能试剂H

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。