一种用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料及其应用

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料及其应用。

背景技术

膨胀超分辨技术是近几年发展的新技术，该技术并没有在显微镜硬件上作出改动，而是将用荧光标记的生物样品放在可膨胀的水凝胶中凝固，然后样品随着聚丙烯酰胺水凝胶膨胀而整体均匀放大，这样能够用普通的显微成像设备获取超分辨的图像。

目前应用于膨胀超分辨的荧光标记方法主要有两种，一种是用一抗接荧光偶联的二抗，还有一种是荧光蛋白融合目的蛋白。但是通过一抗二抗标记目的蛋白，使得膨胀之后荧光基团位置与实际目的蛋白位置的误差大大增加。虽然荧光蛋白也能用于膨胀超分辨，但是在细胞还没被蛋白酶消化完全之前，荧光蛋白的荧光基团就被破坏殆尽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料及其应用。本发

明提供的DNA纳米结构染料和标签蛋白结合进行荧光标记膨胀超分辨成像时，能够减小膨胀显微技术中样品目的蛋白的实际位置与荧光基团位置的误差；其通过基因表达标签蛋白融合目的蛋白，能提高膨胀样品的荧光信号，使显微图片信噪比更高，图片质量更好。

为达到上述目的，本发明采取下述技术方案。

一种用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料，用DNA纳米结构作为染料的承载体，其以DNA纳米结构为主干，DNA纳米结构的游离基团上修饰荧光基团、用于特异性定位识别标签蛋白的基团和能够锚定在水凝胶上的基团；其中：所述DNA纳米结构中的碱基对不超过40对；标签蛋白能基因编辑，在细胞内标签蛋白能与目的蛋白形成融合蛋白。

上述DNA纳米结构为DNA双链结构、DNA四面体结构或其他更复杂的空间结构；DNA纳米结构中的碱基对在10~30对之间。

上述荧光基团有且不限于Alexa Fluor 488、Cy3、Cy5、ATTO 647N、QD655等。上述荧光基团为一个以上，多个荧光基团可以是同一种，也可以是荧光共振能量转移染料对。荧光基团能使要研究的目的蛋白及其所代表的细胞结构在荧光显微镜下可见。

上述用于特异性定位识别标签蛋白的基团，有且不限于针对SNAP标签蛋白苄基鸟嘌呤BG基团、针对CLIP标签蛋白的苄基胞嘧啶（BC）基团、针对Halo标签蛋白的氯代烷烃基等。BG基团是标签蛋白SNAP的底物，将目的蛋白的基因序列与SNAP的基因序列连接，转染到细胞中就能表达目的蛋白与SNAP的融合蛋白。

上述能够锚定在水凝胶上的基团有且不限于丙烯酰胺基团等，使标记好的样品可以进行膨胀处理。

上述能够锚定在水凝胶上的基团为丙烯酰胺基团，使标记好的样品可以进行膨胀处理。

本发明进一步提供上述用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料的应用，其与标签蛋白特异性结合进行荧光染色。应用过程中，还涉及到质粒构建过程，将目的蛋白的翻译序列克隆出来，在其编码框内加上SNAP或其他标签蛋白基因序列；还涉及到细胞表达系统，将构建有目的蛋白和标签蛋白的质粒转染进细胞中表达。优选的，染色过程用去污剂在细胞膜上打少量的孔，用上述的用于膨胀超分辨成像的DNA纳米结构染料进行染色之后再固定细胞。

本发明与传统膨胀显微镜技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、与免疫荧光标记方法相比，抗体分子量比较大，其荧光基团的位置与目的蛋白的实际位置误差较大，而标签蛋白分子量较小，荧光染料所在的DNA纳米结构也小，荧光基团的位置离目的蛋白的实际距离比较近，减小了距离误差。

2、与免疫荧光标记方法相比，我们这种标记方法适用于标记的转基因标记表达的蛋白，能标记的蛋白种类多；抗体因为其制作方式的复杂性，能标记的蛋白种类有限，且抗体标记的样品因抗原决定簇的相似性，造成某些抗体能标记除目的蛋白之外的其他蛋白，使免疫荧光标记方法做出的最终样品有较强的背景荧光。

3、与直接荧光蛋白标记技术相比，我们这种标记方式保持了蛋白内源标记优点，同时能克服荧光蛋白不耐蛋白酶消化的缺点，DNA上荧光染料的亮度、抗淬灭等光学特性都比荧光蛋白要好。

4、在膨胀样品制作过程中，DNA寡链上的丙烯酰胺基团等够让DNA纳米结构锚定在水凝胶上，样品制作过程中不需要如戊二醛（GA）、succinimidyl ester of 6-((acryloyl)amino)hexanoic acid (acryloyl-X, SE)、methacrylic acid N-hydroxysuccinimidylester（MA-NHS）等试剂的处理，这样使膨胀样品的制作过程更简便。同时因为整个分子是建立在DNA基础上的，所以不会被蛋白酶消化。DNA纳米结构不会被蛋白酶消化。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明的DNA纳米结构修饰的示意图。以DNA双链为例，其上一共有4个端点，荧光染料分子、BG和丙烯酰胺基团各占一个端点。

图2为本发明的染色原理。细胞中表达SNAP标签蛋白和目的蛋白的融合蛋白，之后用图1的DNA纳米结构给细胞染色，通过DNA双链上的BG识别SNAP标签蛋白，从而使目的蛋白带上荧光信号。

图3为本发明的实际应用，以微丝蛋白为目的蛋白，得到染色的图。

图中标号：1为DNA双链，2为BG，3为丙烯酰胺基团，4为荧光染料分子，5为SNAP标签蛋白，6为目的蛋白。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

在DNA寡链的一端修饰一个丙烯酰胺基团，在膨胀样品制作过程中，能将DNA寡链锚定在水凝胶上。因为整个分子是建立在DNA基础上的，所以不会被蛋白酶消化。

1、DNA双链结构的设计和序列合成

DNA双链结构的2条链均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成的时候修饰BG、荧光染料和丙烯酰胺基团。2条链序列如下：

A：5’- GACGATGTATGCTTAGGGTCT-3’

（5’端修饰上丙烯酰胺基团， 3’端修饰上 Alexa Fluor 647）

B：5’- GACCCTAAGCATACATCGTCTT-3’

（5’端修饰上BG）

2、DNA双链的结构形成

A、B两条单链等比例混合在退火缓冲液中，配成终浓度为50 μM的DNA双链结构。然后将配好的样品放入PCR仪中从98℃每分钟降温1℃到16℃，即可得到DNA双链结构。

3、细胞培养和染色

将SNAP-LifeAct转染HeLa细胞，48小时之后铺在直径1.5厘米的细胞爬片上，16小时之后，将细胞用import buffer （20mM Hepes，110mM KOAc 5 mM NaOAc，2 mM MgOAc，1mMEGTA，pH7.3）洗2次，40μg/ml的digitonin溶于import buffer，处理细胞30秒，再用1.5%polyvinylpyrrolidone（PVP,360kDa）溶于import buffer，洗2遍，再将溶有500nM DNA双链的PVP溶液对细胞染色5分钟，之后用import buffer清洗细胞两次再4%多聚甲醛固定细胞，PBS润洗3次。

4、膨胀显微技术样品处理

将用DNA双链结构孵育好的细胞用单体溶液（1×PBS，2M NaCl，2.5%丙烯酰胺，0.15%N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，8.625%丙烯酸钠）室温处理大约1分钟。10%过硫酸铵（APS）和10%四甲基乙二胺用水制成高浓度的母液，用单体溶液稀释成0.2% 凝胶溶液用于凝胶化，这个过程中APS最后加。约100微升凝胶溶液加到1mm深，直径1cm的聚四氟乙烯圆孔中，随后将盖玻片细胞面朝下置于凝胶溶液上面。室温静置1小时直至完全凝固。凝固之后用蛋白酶K溶液（50 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 0.8 M guanidineHCl，8 units/mL蛋白酶K）消化20小时。之后将样品放入去离子水中膨胀，每30分钟换一次水，直至完全膨胀。

5、膨胀样品显微成像

将膨胀好的样品切成合适的大小放到0号玻片的玻璃底培养皿中，用宽场显微镜进行成像。结果如图3所示，（1）为EGFP标记的微丝荧光图，（2）为（1）中伪足部分的放大图，（3）为BG-dsDNA标记的膨胀后的微丝荧光图，（4）为（3）中伪足部分的放大图，（5）为（2）和（4）中划线部分的灰度值。从图3中能看到，BG-dsDNA标记的细胞膨胀后伪足的细节比较清晰，而EGFP标记的微丝图像无法看到其中细节，从图3（5）中能看到，BG-dsDNA标记下能分辨的两条线的距离比EGFP标记的更小。

通过以上实施例，可以看到我们用SNAP 标签蛋白标记目的蛋白，将SNAP的底物小分子BG（benzylguanine）连接到20bp左右的DNA寡链上，同时在DNA寡链上修饰丙烯酰胺基团和荧光染料分子。这样极大减少了荧光基团位置与实际目的蛋白位置的误差，也避免了在消化的过程中荧光基团的损失。