一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法

技术领域

本发明涉及一种籼稻的制备方法，具体是一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法。

背景技术

水稻是我国乃至世界上的主要粮食作物，是全球近一半人口的主要热量来源，然而由于杂草危害直接造成的水稻产量损失巨大。伴随着人们对除草剂作用机理和代谢途径的了解和分子生物学技术的快速发展，通过现代生物技术培育抗除草剂的农作物，使田间化学除草技术和生物技术紧密结合，可以扩大高效与超高效低毒除草剂品种的应用范围，降低除草剂残留。

草甘膦(glyphosate)即N-(phosphonomethy)glycine，商品名农达(Roundup)，是一种广泛应用于水旱地杂草防除的灭生性除草剂。草甘膦施用后可被植物迅速吸收，进入植物体内与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS(5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶)的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。草甘膦具有很好的传导性能，对世界上十大多年生、深根性难除杂草均有良好效果，是一种广谱灭生性除草剂。草甘膦进入土中遇金属二价离子形成络合物，通过微生物降解作用失去活性，即与土壤接触后失去其植物毒性；与土壤具有强的亲和力，在土壤中迁移性很小；在水中可发生明显的水解作用，迅速失去活性；同时由于人类和哺乳动物体内缺乏芳香族氨基酸合成途径，没有草甘膦的作用靶标酶，因此草甘瞵对人畜是没有毒性的。由于草甘膦具有高效低毒无残留，对人畜无毒，入土后迅速失活，不会造成土壤及地下水的污染的特点，研制抗草甘膦水稻具有很高的商业价值。

草甘膦是目前使用面积最大、使用范围最广的广谱性除草剂，相对于草丁膦，草甘膦具有价格便宜，在土壤中易分解、短残留、不易进入地下水等优点，在水稻免耕与少耕种植中起着关键性作用，培育抗草甘膦除草剂的水稻对生产抗除草剂水稻具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，将籼稻的愈伤组织放置于抗草甘膦培养基中进行培育。

作为本发明进一步的方案：所述抗草甘膦培养基的组分包括以下重量份的组分：

抗草甘膦黑麦草愈伤组织10-15重量份、培养基悬浮液30-50重量份、中草药制剂5-10重量份、改性蛋白质2-4重量份、营养剂0.5-1重量份、抗菌剂0.5-1重量份、PH调节剂0.5-1重量份。

作为本发明再进一步的方案：所述抗草甘膦培养基的组分包括以下重量份的组分：

抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份。

作为本发明再进一步的方案：所述抗草甘膦培养基的制备方法包括以下步骤：

S1：制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；

S2：制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；

S3：制备中草药制剂，按重量份将中草药制剂加入培养基悬浮液中，混合均匀，并用移液枪吸去表面多余的中草药制剂，常温下静置30-90min，完成后备用；

S4；制备改性蛋白质，将改性蛋白质按重量份加入培养基悬浮液中；

S5：按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀即可；

S6：将抗草甘膦黑麦草愈伤组织加入培养基中即可完成。

作为本发明再进一步的方案：所述PH调节剂为柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、磷酸中的一种或几种。

作为本发明再进一步的方案：所述中草药制剂包括以下重量份的组分：

当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份。

作为本发明再进一步的方案：所述中草药制剂的制备方法包括以下步骤：

S1:按重量份取原料，原料包括：当归、枸杞、田七、甘草、薰衣草、茉莉花.、宁香草、何首乌、党参，将原料清洗干净，晾干备用；

S2：将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液；

S3：将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液；

S4：将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂。

作为本发明再进一步的方案：所述改性蛋白质的制备方法包括以下步骤：

S1：取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置；

S2：待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜；

S3：将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min；

S4：研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液；

S5：将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，通过将籼稻愈伤组织，放置在加入了改性蛋白质、中草药制剂和培养基悬浮液的培养基上培育，使得籼稻获得抗草甘膦的特性，解决了现在没有抗草甘膦的籼稻，使得籼稻施药时较为麻烦的问题。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，制备改性蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜，将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min，研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液，将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质；第五步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份；第六步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

实施例2

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，制备改性蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜，将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min，研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液，将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质；第五步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织10重量份、培养基悬浮液30重量份、中草药制剂5重量份、改性蛋白质2重量份、营养剂0.5重量份、抗菌剂0.5重量份、PH调节剂0.5重量份；第六步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

实施例3

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，制备改性蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜，将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min，研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液，将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质；第五步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织15重量份、培养基悬浮液50重量份、中草药制剂10重量份、改性蛋白质4重量份、营养剂1重量份、抗菌剂1重量份、PH调节剂1重量份；第六步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

对比例1

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，制备蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜；第五步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份；第六步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

对比例2

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份；第五步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

对比例3

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备普通悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液；第三步，制备中草药制剂，按重量份取原料，原料包括：当归7重量份、枸杞5重量份、田七3重量份、甘草5重量份、薰衣草2重量份、茉莉花0.5重量份、宁香草0.8重量份、何首乌1重量份、党参1重量份，将原料清洗干净，晾干备用，将当归、枸杞、田七放入反应瓮，加水升温，水加至刚末过药材，升温至150℃，至药液浓缩至20-30重量份为止，静置冷却，得到中药初液，将何首乌、党参、甘草放入反应瓮内，加水升温，水加至刚末过药材，升温至110℃，至药液浓缩至50-60重量份为止，开始降温至温度为60-80℃，加入薰衣草、茉莉花、宁香草后继续熬制5-6h，室温下冷却，过滤掉药渣，得到混合药液，将中药初液与混合药液混合，搅拌均匀即可制得中草药制剂；第四步，制备改性蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜，将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min，研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液，将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质；第五步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份；第六步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

对比例4

一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法，包括以下步骤：第一步，制备抗草甘膦愈伤组织:取黑麦草的愈伤组织，将黑麦草的愈伤组织放置于含有草甘膦的培养基中培育3-5d，加入PH调节剂控制PH值为6-7，完成后得到抗草甘膦黑麦草愈伤组织；第二步，制备培养基悬浮液：取200μL新鲜的悬浮液，3000rpm离心20s，60℃水浴热击5min，然后转入0℃冰浴2min后，得到培养基悬浮液，按重量份将培养基悬浮液加入培养基中；第三步，制备改性蛋白质，取新鲜豆浆倒入锅中加热煮沸，将煮沸的豆浆倒入不锈钢托盘中，将托盘放入冰箱，静置，待豆浆表面自然凝结成一层蛋白质薄膜，用镊子镊取得到蛋白质薄膜，将蛋白质薄膜和质量分数为10％的氢氧化钠溶液混合后装入研磨罐中，研磨20～30min，研磨结束后用浓度为1mol/L盐酸调节pH至中性，得到蛋白质分散液，将蛋白质分散液和硝酸铜以及硫酸铁混合后放入反应釜中，在常温下搅拌反应，得到改性蛋白质；第四步，按重量份取原料，原料包括：抗草甘膦黑麦草愈伤组织13重量份、培养基悬浮液45重量份、中草药制剂8重量份、改性蛋白质3重量份、营养剂0.8重量份、抗菌剂0.8重量份、PH调节剂0.8重量份；第五步，将培养基悬浮液与中草药制剂混合，加入改性蛋白质，按重量份依次加入营养剂、抗菌剂和PH调节剂，与改性蛋白质一起混合均匀，最后将抗草甘膦黑麦草愈伤组织和籼稻愈伤组织加入培养基中即可完成。

将各个实施例和对比例培育出的籼稻，放到草甘膦培养基上培育，比较抗草甘膦的效果。

由表可知，加入了改性蛋白质、中草药制剂和培养基悬浮液的实施例在抗草甘膦方面要优于采用普通蛋白质的对比例1、缺少蛋白质的对比例2、采用普通悬浮液的对比例3和未加入中草药制剂的对比例4，且以实施例1的配比为最。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。