一种永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系及其构建方法

技术领域

本申请属于细胞工程技术领域，更具体地说，它涉及一种永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系及其构建方法。

背景技术

胎盘是维持哺乳动物胎儿在母体内正常生长发育的临时性器官，同时又是胎儿与母体之间进行物质交换的必不可少的特殊器官。胎盘滋养层细胞位于胎盘屏障的最外层，在胚胎发育至桑葚胚时期分化出现，在此后的胚胎发育过程中对妊娠识别、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发育和维持妊娠发挥重要作用。

目前，胎盘滋养层细胞已被广泛应用于各种生物学研究，包括妊娠识别、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发育和妊娠维持等。胎盘滋养层细胞的原代分离纯化技术已经非常成熟，通过酶消化法和组织块培养法、密度梯度离心法、免疫磁珠负性筛选法获得了纯度能达到95％以上的胎盘滋养层细胞。然而，胎盘滋养层细胞的培养比较困难，要选取妊娠早期胎盘作为试验材料，此时滋养细胞活力强，易生长。胎盘随着妊娠月份的增加而逐渐老化，这时滋养层细胞也随之老化，且细胞数量少、活力低，很难获得满足试验所需的、性状稳定的原代滋养层细胞。因此，样品获取极为困难。

另外，滋养层原代细胞培养条件苛刻，细胞培养前，细胞培养瓶应该用鼠尾胶原包被处理，以促进胎盘滋养层细胞贴壁。在细胞培养过程中，还要选择高糖型含10％～20％胎牛血清的DMEM培养基培养胎盘滋养层细胞，培养获得的滋养层细胞活力、性状稳定，才能够满足试验要求。即使如此，牛原代滋养层细胞最多传八代，随着传代次数增多形态差异大，生长速度变慢，不再满足试验要求。必须重新获取原代滋养层细胞，步骤繁琐，消耗大量的人力、物力和财力。永生化的细胞能够克服这些缺点，并且具有原代细胞不具有的优点。因此，与原代胎盘滋养层细胞相比，获取永生化的胎盘滋养层细胞具有重要的现实意义。

端粒酶介导的细胞永生化是建立细胞系的常用手段之一。端粒酶在细胞永生化的应用中具有一定的优越性：永生化的细胞能够保持原代细胞的关键生物学特性，具有锚着依赖性、血清依赖性和接触抑制性，并且没有获得肿瘤转化特征。

发明内容

目前采用端粒酶方法，利用磁珠分离山羊胎盘滋养层细胞已经成功获得了山羊胎盘滋养层细胞系等。然而，发明人发现按照山羊胎盘滋养层细胞系的构建方法构建牛的胎盘滋养层细胞系无法获得成功，可能原因是利用抗体藕联磁珠分离胎盘滋养层细胞，分离后还需要对细胞进行洗脱等，步骤繁琐，细胞容易污染，从而使得纯化后的胎盘滋养层细胞活力下降，只能传8-10代。而且该方法需要购买大量的抗体偶联磁珠，成本高，限制了构建牛的胎盘滋养层细胞系的研究。

由于胚胎干细胞构建技术比较成熟，而且从胚胎干细胞中获得滋养层细胞纯度高，能达到100％。因此，目前大部分研究者聚焦于从胚胎干细胞中获得滋养层细胞系，但该方法需要在显微镜下操作，对设备要求高等，也限制了构建牛的胎盘滋养层细胞系的研究。截止目前还没有成功建立牛的胎盘滋养层细胞系的报道。

基于此，本申请提供一种永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系。

本申请是通过以下技术方案实现的：

本申请一方面提供一种永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系，其以中国荷斯坦奶牛胎盘滋养层细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到。

本申请中，利用奶牛胎盘滋养层细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，使得牛胎盘滋养层细胞获得端粒酶形成永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系，该细胞均一性好、稳定性强且培养方便。

在本申请的一个具体实施方式中，所述奶牛胎盘滋养层细胞来源于妊娠45-60天的奶牛胎盘。该时期的滋养层细胞，其增殖能力很强，活性很强，以此制备原代细胞进而制备的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系增殖能力也很强，可以分化出不同的细胞。

在本申请的一个具体实施方式中，所述奶牛胎盘滋养层细胞来中国荷斯坦奶牛胎盘组织。

在本申请的一个具体实施方式中，所述奶牛胎盘滋养层细胞通过以下方式获得：取妊娠45-60天的奶牛胎盘组织，去掉胎盘子叶，剪碎至1-2cm

本申请中，只对来源于奶牛胎盘组织的奶牛胎盘滋养层细胞进行简单的初步纯化，不进行完全纯化，大大减少了纯化步骤，同时节省了大量的人力、物力和财力。

在本申请的一个具体实施方式中，所述的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系，是利用脂质体转染法将pCI-neo-hTERT真核表达载体导入原代奶牛胎盘滋养层细胞中。

在本申请的一个具体实施方式中，所述脂质体为Lipofectamine2000。

在本申请的一个具体实施方式中，所述奶牛胎盘滋养层细胞系的保藏号为CGMCC21901，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院。

本申请另一方面提供上述永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系的构建方法，其包括如下步骤：

S1：取妊娠45-60天的奶牛胎盘组织，去掉胎盘子叶，剪碎至1-2cm

S2：采用Lipofectamine 2000Regent转染试剂将pC1-neo-hTERT质粒导入原代细胞中，转染24h，在含有第一浓度的G418的DMEM/F12培养基中连续培养两周后，在含有第二浓度的G418的DMEM/F12培养基中培养直至获得单菌落；采用胰蛋白酶将单菌落消化后，继续培养传代至50代既得永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系。

在本申请的一个具体实施方式中，所述第一浓度的G418的浓度为200μg/mL。

在本申请的一个具体实施方式中，所述第二浓度的G418的浓度为100μg/mL。

本申请另一方面提供上述永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系在用于制备胎盘部位滋养层细胞肿瘤疾病的病因学、转移机制、耐药机理、临床干预，以及妊娠识别、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发育、妊娠维持、胚胎和胎盘毒性药物筛选研究平台中的用途。

本申请提供的奶牛胎盘滋养层细胞系至少具有以下有益效果之一：

本申请提供的奶牛胎盘滋养层细胞系以奶牛胎盘滋养层细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的，其含有端粒酶，该细胞系均一性好、稳定性强且培养方便。

附图说明

图1A为本申请实施例中剪下胎盘子叶组织，剪碎后的胎盘组织块显微镜观察图。

图1B为本申请实施例中组织块迁移出并且贴壁生长的滋养层细胞和成纤维细胞的显微镜观察图。

图1C为本申请实施例中差速贴壁30分钟后贴壁培养的胎盘滋养层细胞的显微镜观察图。

图2为本申请实施例中提供的pCI-neo载体图谱。

图3为本申请实施例中提供的双酶切法鉴定pCI-neo-hTERT质粒的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图4A为本申请实施例中提供的pCI-neo-hTERT质粒转染后单菌落液体培养的显微镜观察图。

图4B为传代至50代的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系的显微镜观察图。

图5为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系与原代奶牛胎盘滋养层细胞生长曲线对比图。

图6为本申请实施例中提供的检测奶牛胎盘滋养层细胞系表达TERT蛋白的western blot实验结果图。

图7为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系表达标识蛋白的鉴定结果图。

图8为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系分泌CG的实验结果图。

图9为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系分泌PL的实验结果图。

图10为本申请实施例中提供的原代奶牛胎盘滋养层细胞侵袭性结果图。

图11为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系侵袭性结果图。

图12为本申请实施例中提供的奶牛胎盘滋养层细胞系的软琼脂克隆形成的实验结果图。

图13为本申请实施例中提供的HeLa细胞软琼脂克隆形成的实验结果图。

具体实施方式

本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请实施例中选用中国荷斯坦奶牛胎盘为例进行介绍。

中国荷斯坦奶牛是经过长期的杂交选育而形成的一个品种，这也是我国唯一的奶牛品种，在中国养殖厂家不计其数，也是我国主要养殖奶牛品种，在我国奶牛业养殖中占有重要地位。

本申请中涉及到的材料及其来源如下：

实施例1奶牛胎盘滋养层细胞系的建立

一、原代奶牛胎盘滋养层细胞的分离及初步纯化(组织块迁移-差速贴壁法)

从屠宰场选取妊娠45-60天的奶牛子宫(包含胎儿和胎盘)，剖检出胎盘，置于含双抗(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)的DPBS溶液中清洗。剪下胎盘子叶，浸入75％酒精15-30s立即放入新的DPBS缓冲液内清洗。处理好的胎盘组织剪碎至1-2cm

从图1B可以看出，采用组织块儿迁移法和酶消化法可获得成纤维细胞和滋养层细胞原代细胞；从图1C可以看出，差速贴壁可初步除去大部分成纤维细胞。

二、pCI-neo-hTERT质粒的鉴定

如图2所示，pCI-neo-hTERT质粒采用OMEGA公司生产的Endo-free plasmid midikit按照说明书操作步骤进行质粒提取。利用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度，分装于-20℃保存备用。

引物hTERT-F：TATGCTGTGGTCCAGAAGG；和

引物hTERT-R：CAAGAAAT-CATCGACCAAACG由上海生工生物工程技术服务有限公司设计。

将提取的pCI-neo-hTERT质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：1μL 10×限制性内切酶缓冲液(buffer H)，0.5μL EcoR I(12U/μL)，0.5μL Sal I(12U/μL)，0.25μL BSA(10mg/mL)，4μL质粒DNA，3.75μl ddH

图3中，M：DNA maker；1和2：双酶切后hTERT基因片段与空载体片段；3和4：完整质粒片段。pC1-neo-hTERT质粒全长为8900bp，hTERT基因片段长度为3450bp。从图3中可以看出，采用EcoR I和Sal I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示酶切片段与预期大小一致，质粒正确。

三、转染、阳性细胞筛选及扩大连续培养

将步骤一中分离得到的奶牛胎盘滋养层细胞接种于24孔板，生长至细胞铺满孔底部的70％-80％，加入不同浓度G418(100、150、200、250、300、350、400μg/mL)筛选培养基，每个梯度3个重复，每3天更换一次培养基，观察细胞生长情况，选取两周内杀死所有细胞的最小G418浓度作为筛选奶牛胎盘滋养层细胞系的第一浓度。经过筛选，第一浓度为200μg/mL。

按照Lipofectamine 2000Regent转染试剂手册说明将pC1-neo-hTERT质粒导入原代奶牛胎盘滋养层细胞，转染24h，在含有200μg/mL的G418的DMEM/F12培养基中连续培养两周(称为转染孔)，以没有转染的原代奶牛胎盘滋养层细胞为对照(称为对照孔)。待对照孔细胞全部死亡时，在含有100μg/mL G418的DMEM/F12培养基中培养直至获得阳性单菌落。采用胰蛋白酶将单菌落消化后，继续培养，24h传代一次，传代至50代既得永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系，其实验结果如图4A和图4B所示。

图4A为pCI-neo-hTERT质粒转染后单菌落液体培养的显微镜观察图；图4B为传代至50代的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系的显微镜观察图。从图4A和图4B中可以看出，pCI-neo-hTERT质粒转染成功，成功筛选出永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系。将获得的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系于2021年2月25日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院)保藏，保藏号为CGMCC 21901，建议的分类命名为中国荷斯坦奶牛胎盘滋养层细胞系。

实施例2奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901的生长特性

取24孔板，每个孔板中加入DMEM/F12培养基，收集第3代原代奶牛胎盘滋养层细胞和实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901，按1×10

从图5中可以看出实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901比原代细胞具有更加旺盛的生长活性，具有正常的细胞生长增殖曲线。

实施例3 hTERT基因在奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901中的表达

收集5×10

图6中，btc为原代奶牛胎盘滋养层细胞；hTERT-btc为实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901；hTERT为TERT蛋白在凝胶中的位置；β-actin为内参蛋白。从图6中可以看出，实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901高度表达TERT蛋白，说明pCI-neo-hTERT质粒转染进牛胎盘滋养层细胞内并表达TERT蛋白。

实施例4奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901标识蛋白的鉴定

取6孔板，每个孔板中加入DMEM/F12培养基，将灭菌盖玻片置于6孔板中，取实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901中的细胞按1×10

从图7中可以看出，实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901中高度表达滋养层细胞标识蛋白Cytokeratin 7(简写CK-7)和Vimentin，而癌变标识蛋白Thy1没有表达，说明该细胞系纯度达到100％且没有癌变，保持正常的细胞形态。

实施例5奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901激素分泌功能的检测

取24孔板，每个孔板中加入DMEM/F12培养基，收集第3代原代奶牛胎盘滋养层细胞和实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901，分别接种于24孔板；24h后弃去培养基，无菌PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入无血清DMEM/F12培养基，培养细胞48h后收集上清，﹣80℃保存备用；计算细胞数量，每个孔计数3次，每组细胞设3个平行孔。绒毛膜促性腺激素(CG)和胎盘催乳素(PL)的分泌量分别用ELISA检测试剂盒检测。其实验结果如图8和图9所示。

在妊娠过程中，CG和PL的表达是胎盘滋养层细胞的重要生物学功能之一。从图8和图9中可以看出，实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901(hTERT-BTCs)和原代奶牛胎盘滋养层细胞(primary BTCs)均分泌CG和PL，并且在分泌水平上奶牛胎盘滋养层细胞系(hTERT-BTCs)和原代奶牛胎盘滋养层细胞(primary BTCs)差异不显著。说明实施例1中筛选出的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系保留了原代滋养层细胞的激素分泌功能。

实施例6体外培养的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901具有侵袭性鉴定

收集2×10

图10为原代奶牛胎盘滋养层细胞侵袭性结果图；图11为实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901侵袭性结果图。从图10和图11中可以看出，原代奶牛胎盘滋养层细胞和实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901均能侵袭穿过Matrigel包被的Transwell小室，呈现出侵袭特性。说明实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC21901保持了原代细胞的侵袭性。

实施例7奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901与HeLa细胞软琼脂克隆形成对比试验

将2mL含有0.66％软琼脂的DMEM/F12完全培养基铺到6孔板作为底层琼脂，在4℃条件下凝固；用1mL含有0.33％软琼脂的DMEM/F12完全培养基分别重悬1×10

图12为实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901的软琼脂克隆形成的实验结果图；图13为HeLa细胞软琼脂克隆形成的实验结果图。

非贴壁依赖性生长特性是细胞发生恶性转化的重要表型。从图12和图13中，软琼脂克隆形成试验结果显示，实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901(hTERT-BTCs)在上层软琼脂上培养20d后没有形成细胞集落，而HeLa细胞在上层软琼脂上形成了明显的细胞集落(直径大于100μm)，表明hTERT-BTCs不具有悬浮生长能力。

综上，通过对实施例1筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC21901的生长特性，hTERT基因的表达，标识蛋白Cytokeratin7、Vimentin、Thy1的鉴定，绒毛膜促性腺激素(CG)和胎盘催乳素(PL)分泌功能的检测，侵袭性的鉴定以及软琼脂克隆形成对比试验等的鉴定，可知，本申请实施例1中筛选出的奶牛胎盘滋养层细胞系是一种均一性好，稳定性强，培养方便，分泌和功能与原代奶牛滋养层细胞没有差异，能稳定传代但没有癌变的奶牛滋养层细胞系。

终上所述，本申请实施例中利用脂质体(Lipofectamine 2000Regent)转染法将质粒pCI-neo-hTERT导入原代奶牛胎盘滋养层细胞中，并经G418筛选获得的永生化的奶牛胎盘滋养层细胞系CGMCC 21901，其操作简单，简化了建系程序，克服了牛胎盘滋养层细胞建系的难点，成功建成了永生化奶牛胎盘滋养层细胞系，为胎盘部位滋养细胞肿瘤疾病的病因学、转移机制、耐药机理、临床干预，以及妊娠识别、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发育、妊娠维持、胚胎和胎盘毒性药物筛选等的研究提供了基础材料。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。