一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液及其制备方法

技术领域：

本发明涉及医用材料技术领域，涉及一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液及其制备方法，用氧化海藻酸钠对那他霉素进行改性，有效提高那他霉素水溶性和渗透性，减少那他霉素的眼部刺激性和不适感，提高真菌性角膜炎的治疗效果。

技术背景：

真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是致病真菌感染引起的角膜疾病。我国作为以工农业为主要产业的发展中国家，是真菌性角膜炎的高发区，生产活动中角膜外伤尤其是植物性外伤为真菌性角膜炎的发生提供了机会，再加上角膜接触镜佩戴人群不断扩大以及抗生素、激素的滥用，近年来真菌性角膜炎发病率明显上升，该病患者多为一线工作的青壮年劳动力，致盲率高。真菌性角膜炎临床治疗较为棘手。目前临床上尚无十分满意的抗真菌药物，常用的抗真菌滴眼液多为脂溶性，存在角膜局部渗透作用差、刺激性强、毒性大、半衰期短、给药方式繁琐等问题，治疗手段匮乏导致真菌性角膜炎的致盲率居高不下。

那他霉素是一种从链霉菌中提取的四烯类抗菌素。其作用机制是通过药物分子与真菌细胞膜的固醇部分结合，形成多烯固醇复合物，改变细胞膜的渗透性，使真菌细胞内的基本细胞成分流出，而至真菌死亡。临床上使用的那他霉素混悬液可用于治疗真菌性角膜炎，但那他霉素粒径较大，溶解性较差，并且受泪液分泌的影响，很难达到持续释放的效果。研究人员一直致力于对那他霉素的给药效果进行改进，例如中国专利CN200810140337.7公开的一种阳离子黏附型那他霉素纳米滴眼液，包括那他霉素，适量的渗透压调节剂和pH调节剂，还包括壳聚糖、普朗尼克F-68和磷脂，其中磷脂在滴眼液中的质量百分比浓度0.01％-2％、普朗尼克F-68在滴眼液中的质量百分比浓度0.1％-20％、壳聚糖在滴眼液中的质量百分比浓度0.01-4％，壳聚糖分子量为5000～300000，脱乙酰度>85％；将那他霉素普通混悬剂制备成直径在10-1000nm混悬剂粒，增大药物的溶解度，提高安全性和有效性，又将普通混悬剂的那他霉素药粒子通过磷脂和壳聚糖进行修饰，使其带正电荷，有助于提高药物的角膜吸收，增强药效并延长药物作用时间，且壳聚糖具有生物黏附作用，使药物粒子角膜黏附性增强；但其原料种类多，制备工艺复杂；中国申请专利CN201911030779.0公开了一种那他霉素聚合物胶束滴眼液，包括一定质量体积比的那他霉素聚合物胶束和磷酸盐缓冲液，其中那他霉素聚合物胶束中那他霉素所占质量百分含量为10～30％，余量为聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甘油酯嵌段共聚物；将聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甘油酯嵌段共聚物置于乙醇中自我组装成交联胶束，包载那他霉素后得到的那他霉素聚合物胶束滴眼液，能够延长那他霉素的释放时间，减少用药次数，但其治疗效果并未提高。

海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)键连接而成，是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。海藻酸钠已经在食品工业和医药领域得到了广泛应用。但海藻酸盐本身的降解速率很低，为改善海藻酸钠的降解性能，对海藻酸钠进行氧化，使海藻酸钠部分糖醛酸单元的羟基转变成醛基，达到改善海藻酸钠降解性能的目的；由于醛基的反应活性相对较高，可以偶联活性蛋白、多肽、特异氨基酸序列等生物活性物质，能够提高材料与细胞的相互作用，因此，有必要寻求设计一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液及其制备方法，利用海藻酸钠氧化后制得的氧化海藻酸钠改良那他霉素，有效提高那他霉素水溶性和渗透性，减少那他霉素的眼部刺激性和不适感，提高真菌性角膜炎的治疗效果。

发明内容：

本发明针对现有技术存在的缺点，提供一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液及其制备方法，用于治疗眼部真菌感染。

为了达到上述目的，本发明提供一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液，其组份和含量为：1mL灭菌去离子水里含有0.5-1.5mg氧化海藻酸钠-那他霉素冻干粉，所述氧化海藻酸钠-那他霉素为氧化海藻酸钠与那他霉素发生席夫碱反应的产物。

所述氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的制备方法具体步骤如下：

第一步，制备氧化海藻酸钠固体，将海藻酸钠溶于水，加入高碘酸钠，避光反应，然后加入乙二醇终止反应，生成氧化海藻酸钠，再加入无水乙醇使沉淀析出，经减压抽滤、透析、冷冻干燥，得纯氧化海藻酸钠固体；

第二步，制备氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末：将第一步制得的氧化海藻酸钠溶于水，加入那他霉素，在避光环境下搅拌，氧化海藻酸钠与那他霉素发生席夫碱反应，生成氧化海藻酸钠-那他霉素，然后经透析，冷冻干燥，碾磨，得氧化海藻酸钠-那他霉素固体粉末；

第三步，制备滴眼液：将0.5-1.5mg氧化海藻酸钠-那他霉素粉末加入1mL灭菌去离子水，制成浓度为0.5-1.5mg/mL氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液。

所述第一步制备氧化海藻酸钠固体的具体步骤为：(1)用精密电子天平称取海藻酸钠10g，加入200mL灭菌去离子水，室温磁力搅拌3-10小时制备成质量浓度为0.05g/mL的海藻酸钠水溶液，加入1-10g高碘酸钠，避光反应3-9小时后，加入0.260-2.60mL的乙二醇，磁力搅拌0.5小时，终止反应，生成氧化海藻酸钠混合物溶液，加入400mL的无水乙醇使沉淀析出，然后用循环水真空泵减压抽滤，获取氧化海藻酸钠的混合产物；

(2)将含氧化海藻酸钠的混合产物溶于灭菌去离子水中，然后在灭菌双蒸水中用透析袋透析1-3天，每6小时换一次双蒸水，将透析后的溶液在-70℃冷冻干燥，得到纯氧化海藻酸钠固体。

进一步的，向海藻酸钠水溶液加入5g高碘酸钠，避光反应6小时。

所述第二步氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末的具体步骤为：取第一步制得的氧化海藻酸钠固体粉末溶解在灭菌去离子水中，制得质量浓度0.01g/mL氧化海藻酸钠水溶液，向100mL氧化海藻酸钠水溶液中加入0.5-5g那他霉素，在40℃避光环境下搅拌24-48小时，然后使用透析袋在灭菌双蒸水中透析1-3天，用于去除未反应的那他霉素，将透析后的溶液在-70℃下冷冻干燥，得到氧化海藻酸钠-那他霉素固体，用石英研钵碾磨成粉末，置于干燥无菌玻璃瓶中避光保存；

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)以氧化海藻酸钠为基质的那他霉素滴眼液，由于氧化海藻酸钠性质类似于人体细胞外基质，组织相容性好，可降解为无毒且不参与代谢的多糖。

2)以氧化海藻酸钠为基质的那他霉素滴眼液，制作工艺相对简单，成本不高，易于保存。

3)以氧化海藻酸钠为基质的那他霉素滴眼液，改变了那他霉素混悬性，提高了那他霉素的水溶性和渗透性，减少了那他霉素的眼部刺激性和不适感，提高真菌性角膜炎的治疗效果。

附图说明：

图1为本发明涉及的实施例2用紫外分光光度计所测那他霉素溶液标准曲线图。

图2为本发明涉及的实施例5氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的傅里叶红外检测的物理表征谱图。

图3为本发明涉及的实施例7氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液细胞毒性实验结果示意图。

图4为本发明涉及的实施例8的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的体外抑菌实验结果示意图。

图5为本发明涉及的实施例10的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用实验结果示意图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液，1mL灭菌去离子水里含有0.5-1.5mg氧化海藻酸钠-那他霉素冻干粉，其具体的制备过程如下：

第一步，制备氧化海藻酸钠：

(1)用精密电子天平称取海藻酸钠10g，加入200mL灭菌去离子水，室温磁力搅拌3-10小时制备成质量浓度为0.05g/mL的海藻酸钠水溶液，加入1-10g高碘酸钠，避光反应3-9小时后，加入0.260-2.60mL的乙二醇，磁力搅拌0.5小时，终止反应，生成氧化海藻酸钠(OSA)混合物溶液，加入400mL的无水乙醇使沉淀析出，然后用循环水真空泵减压抽滤，获取含OSA的混合产物。

(2)将含OSA的混合产物溶于灭菌去离子水中，然后在灭菌双蒸水中用透析袋(MWCO＝7000D)透析1-3天，每6小时换一次双蒸水，用于去除高碘酸钠和乙二醇等小分子物质，将透析后的溶液在-70℃冷冻干燥，得到纯OSA固体；

第二步，制备氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末：取步骤(2)制得的1g OSA固体粉末溶解在100mL灭菌去离子水中，制得质量浓度为0.01g/mL的OSA溶液，然后加入0.5-5g那他霉素(NATA)，在40℃避光环境下搅拌36小时，然后使用透析袋(MWCO＝7000D)在灭菌双蒸水中透析1-3天，用于去除未反应的那他霉素，将透析后的溶液在-70℃下冷冻干燥，得到OSA-NATA固体，用石英研钵碾磨成粉末，置于干燥无菌玻璃瓶中避光保存；

所述OSA-NATA的制备过程用化学反应方程式表示如下：

第三步，制备滴眼液：将0.5-1.5mg OSA-NATA粉末加入1mL灭菌去离子水，制成0.5-1.5mg/mL的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液(简称OSA-NATA滴眼液)。

实施例2：

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的制备方法，其具体的制备过程如下：

第一步，制备氧化海藻酸钠：

精密电子天平称取海藻酸钠10g，加入200mL灭菌去离子水，室温磁力搅拌6小时制备成质量浓度为0.05g/mL的海藻酸钠水溶液，加入5g高碘酸钠，避光反应6小时后，加入1.430mL的乙二醇，磁力搅拌0.5小时，终止反应，生成氧化海藻酸钠(OSA)混合物溶液，加入400mL的无水乙醇使沉淀析出，然后用循环水真空泵减压抽滤，获取含OSA的混合产物。

将含OSA的混合产物溶于灭菌去离子水中，然后在灭菌双蒸水中用透析袋(MWCO＝7000D)透析2天，每6小时换一次双蒸水，将透析后的溶液在-70℃冷冻干燥，得到OSA固体。

第二步，制备氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末：取步骤(2)制得的1g OSA固体粉末溶解在100mL灭菌去离子水中，制得质量浓度为0.01g/mL的OSA溶液，然后加入2.5g那他霉素(NATA)，在40℃避光环境下搅拌36小时，使用透析袋(MWCO＝7000D)在灭菌双蒸水中透析2天，将透析后的溶液在-70℃下冷冻干燥，得到OSA-NATA固体，用石英研钵碾磨成粉末，置于干燥无菌玻璃瓶中避光保存。

第三步，制备滴眼液：将1mg OSA-NATA粉末加入1mL灭菌去离子水，制成1mg/mL的OSA-NATA滴眼液。

对滴眼液中那他霉素的有效含量进行测定：结果显示：使用紫外分光光度计在303nm处测定那他霉素标准曲线，1mg/mL OSA-NATA滴眼液中在303nm处测得吸光度为0.578，计算可知1mLOSA-NATA滴眼液中有效那他霉素的含量约为8μg。

实施例3：

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的制备方法，其具体的制备过程如下：第一步，制备氧化海藻酸钠：

(1)用精密电子天平称取海藻酸钠10g，加入200mL灭菌去离子水，室温磁力搅拌3小时制备成质量浓度为0.05g/mL的海藻酸钠水溶液，加入1g高碘酸钠，避光反应3小时后，加入0.260mL的乙二醇，磁力搅拌0.5小时，终止反应，生成氧化海藻酸钠(OSA)混合物溶液，加入400mL的无水乙醇使沉淀析出，然后用循环水真空泵减压抽滤，获取含OSA的混合产物。

(2)将含OSA的混合产物溶于灭菌去离子水中，然后在灭菌双蒸水中用透析袋(MWCO＝7000D)透析1天，每6小时换一次双蒸水，用于去除高碘酸钠和乙二醇等小分子物质，将透析后的溶液在-70℃冷冻干燥，得到纯OSA固体；

第二步，制备氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末：取步骤(2)制得的1g OSA固体粉末溶解在100mL灭菌去离子水中，制得质量浓度为0.01g/mL的OSA溶液，然后加入0.5g那他霉素(NATA)，在40℃避光环境下搅拌36小时，然后使用透析袋(MWCO＝7000D)在灭菌双蒸水中透析1天，用于去除未反应的那他霉素，将透析后的溶液在-70℃下冷冻干燥，得到OSA-NATA固体，用石英研钵碾磨成粉末，置于干燥无菌玻璃瓶中避光保存；

第三步，制备滴眼液：将0.5mg OSA-NATA粉末加入1mL灭菌去离子水，制成0.5mg/mL的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液(简称OSA-NATA滴眼液)。

实施例4：

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的的那他霉素滴眼液的制备方法，其具体的制备过程如下：第一步，制备氧化海藻酸钠：

(1)用精密电子天平称取海藻酸钠10g，加入200mL灭菌去离子水，室温磁力搅拌10小时制备成质量浓度为0.05g/mL的海藻酸钠水溶液，加入10g高碘酸钠，避光反应9小时后，加入2.60mL的乙二醇，磁力搅拌0.5小时，终止反应，生成氧化海藻酸钠(OSA)混合物溶液，加入400mL的无水乙醇使沉淀析出，然后用循环水真空泵减压抽滤，获取含OSA的混合产物。

(2)将含OSA的混合产物溶于灭菌去离子水中，然后在灭菌双蒸水中用透析袋(MWCO＝7000D)透析3天，每6小时换一次双蒸水，用于去除高碘酸钠和乙二醇等小分子物质，将透析后的溶液在-70℃冷冻干燥，得到纯OSA固体；

第二步，制备氧化海藻酸钠-那他霉素药物粉末：取步骤(2)制得的1g OSA固体粉末溶解在100mL灭菌去离子水中，制得质量浓度为0.01g/mL的OSA溶液，然后加入5g那他霉素(NATA)，在40℃避光环境下搅拌36小时，然后使用透析袋(MWCO＝7000D)在灭菌双蒸水中透析3天，用于去除未反应的那他霉素，将透析后的溶液在-70℃下冷冻干燥，得到OSA-NATA固体，用石英研钵碾磨成粉末，置于干燥无菌玻璃瓶中避光保存；

第三步，制备滴眼液：将1.5mg OSA-NATA粉末加入1mL灭菌去离子水，制成1.5mg/mL的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液(简称OSA-NATA滴眼液)。

实施例5：

本实施例采用傅里叶红外分析检测实施例2在制备氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液过程中的海藻酸钠、氧化海藻酸钠、那他霉素、以及氧化海藻酸钠-那他霉素的物理表征，红外图谱如图2所示。

从图2可以看出，与海藻酸钠的红外图谱相比，氧化海藻酸钠在1655cm

实施例6：

本实施例为实施例2制备的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的药代动力学试验，用高效液相色谱仪检测给药后的房水和角膜的药物浓度变化，具体试验过程如下：

1.制备那他霉素标准曲线：在室温下，精密称取那他霉素制备浓度分别为0.01、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0和8.0μg/ml的标准溶液，用高效液相色谱仪紫外检测波长在303nm处的吸光度，进样量为50μL，制成那他霉素浓度-吸光度标准曲线。

2.选择30只新西兰大白兔，雌雄不限，体重约为2.0-2.9kg。用微量加样器将50μL的OSA-NATA滴眼液滴入兔子双眼，分别于给药后0、5、10、15、30、60、120、180、240和360分钟各时间点采用空气栓塞处死3只兔子，分别取房水150-200μL和环钻取等大的角膜片，置于-20℃冰箱备用。

加200μL乙腈到100μL房水中，振荡，离心，取上清液，检测303nm处紫外吸收光强度，通过标准曲线计算对应的那他霉素药物浓度；在1ml磷酸盐缓冲液中研磨角膜组织，加入乙酸乙酯振荡离心后取有机相，加入200μL乙腈，离心，取上清液，检测303nm处紫外吸收光强度，计算对应那他霉素药物浓度。

结果显示，OSA-NATA滴眼液单次点眼后，房水的药物浓度变化趋势与角膜的药物浓度变化趋势一致，均在点眼后30分钟达到最高药物浓度，药物半衰期为2小时。

实施例7：

本实施例为实施例2制备的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的细胞毒性实验，具体为CCK8细胞增殖-毒性检测，步骤如下:

在2个96孔板中接种永生化人角膜上皮细胞悬液，将培养板放在培养箱中预培养24小时；向一个96孔板培养液中加入不同浓度的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液(OSA-NATA)，同时向另一个96孔板培养液中加入不同浓度的那他霉素溶液(NATA)；在恒温培养箱孵育24小时后，移除培养液，并每孔加入100μL新的培养液和10μL的CCK8溶液，置于培养箱内孵育3小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度，实验结果如图3所示。

从图3可以看出：24小时后，与未加药组(那他霉素浓度为0)比，那他霉素在16μg/ml对HCEC有抑制作用；同时与未加药组(OSA-NATA浓度为0)相比，OSA-NATA溶液浓度在＜1024μg/ml时，HCEC细胞活性未见明显异常，表明1mg/mL的OSA-NATA滴眼液无明显细胞毒性。

实施例8：

本实施例涉及实施例2制备的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的体外抑菌实验：

烟曲霉菌株在沙氏培养基35℃培养7天，促进小分生孢子生成，用1mL灭菌磷酸盐缓冲溶液冲洗菌落，收集冲洗液，取均匀混悬液行孢子计数；分别将那他霉素和OSA-NATA滴眼液用沙氏培养基稀释成不同浓度梯度，分装在灭菌EP管中，每个管中加入烟曲霉菌孢子混悬液，使管中孢子终浓度约为0.4×10

从图4可以看出，与未加药组(那他霉素和OSA-NATA浓度分别为0)相比，对烟曲霉菌，那他霉素的MIC

实施例9：

本实施例为氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的稳定性测试实验：

将实施例2制备的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液，分别保存在室温15-28℃和4℃下，分别在1、2、3、4、5、6、7、8和9个月后进行体外抑菌实验，体外抑菌实验步骤参照实施例8。

实验结果：在室温保存2个月以内，OSA-NATA的药量及体外杀菌效力没有明显变化，2个月以后开始逐渐下降；而在4℃保存的OSA-NATA在半年内效价没有明显变化，6个月之后开始有下降的趋势。说明实施例2制备的氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液可以长期保存，这就为氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液的大量生产保存、运输及广泛应用等提供了有利的条件。

实施例10:

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液在治疗小鼠真菌性角膜炎的应用实验：

取8周龄C57BL/6健康雌鼠24只，建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型，均以右眼为实验眼。模型建立成功后，随机分为四组，每组6只，分别为：第一组为单纯真菌组(AF)，不给予小鼠任何眼部治疗药物；第二组为氧化海藻酸钠溶液组(AF+OSA)，每天给小鼠用氧化海藻酸钠溶液点眼6次，每次5μL；第三组为氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液组(AF+OSA-NATA)，每天给小鼠用氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液点眼6次，每次5μL；第四组为那他霉素滴眼液组(AF+NATA)，每天给小鼠用那他霉素滴眼液点眼6次，每次5μL。点眼时间为5天。根据O’Day标准进行角膜溃疡评分标准，每天于裂隙灯下观察并记录小鼠角膜溃疡的评分情况。实验结果见图5。

结果表明，以氧化海藻酸钠为基质的那他霉素滴眼液组角膜溃疡评分低于单纯真菌感染组、氧化海藻酸溶液组及那他霉素滴眼液组，评分越低，说明角膜溃疡程度低，进而说明以氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液对烟曲霉菌性角膜炎的治疗效果优于其他三组

实施例11：

本实施例涉及氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液在治疗真菌性角膜炎的应用。

采集2019年3月至2020年11月于青岛大学附属医院接受治疗的真菌角膜炎患者31例，其中男性18例，女性13例，年龄为26～61岁，平均(36.25±6.07)岁。

所有患者均接受OSA-NATA滴眼液点眼治疗，每天6次，需连续治疗3周。

按照相关标准对患者治疗后临床效果进行评价，治愈：经过治疗后，角膜浸润及水肿情况消退，结膜充血情况消失，真菌培养呈现为阴性，角膜溃疡愈合，经过共聚焦显微镜检查后未见菌丝；显效：经过治疗后，患者相关检测结果为阴性，各项指标得到改善，仅存在结膜充血或角膜斑翳情况；有效：经过治疗后，患者相关检查结果呈现阴性，各项指标中仅有1～2项得到改善。无效：治疗前后各项指标均无变化，或者存在加重情况。治疗总有效率＝(治愈+显效+有效)/总例数×100％。按照相关标准对患者各项症状进行评价，每一项症状评分最高为5分，评分越高则代表该症状程度越严重。

经过统计后，31例患者接受治疗后，有28例患者治疗效果，其中治愈有17例，显效有6例，有效有5例，无效有3例，治疗有效率为90.3％(28/31)。

治疗前后的相关参数统计结果见表1。

表1 治疗前后的相关参数统计结果