融合基因突变的荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及融合基因突变的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子和核糖体结合序列等)控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白，融合基因突变可导致蛋白质水平、功能和作用位点的异常，容易导致或促进肿瘤的发生。

针对融合基因突变的检测方法主要包括：免疫组化法(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和高通量测序法(High-throughput sequencing)。免疫组化法是一种以组织为基础的蛋白检测方法，发生基因融合的肿瘤细胞存在明显的膜着色反应，操作较简便，但检测结果容易受影响，结果判定存在主观判断的差异，容易出现假阳性和假阴性。荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization，FISH)根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置；该方法的检测灵敏度较高，但操作较复杂，需要在载体上进行平面读取，缺乏立体空间读取功能，可能存在空间折叠导致误判，并且需要人工判读，受限于人工判读的经验及复杂度等方面，判读存在技术要求高、判读结果容易存在偏差等问题，且对检测样本保存的要求较高，容易因保持时间过长导致假阴性的发生，在临床检测中受到一定的限制。高通量测序技术(High-throughput sequencing)以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，对相关软件的要求较高，测序成本较高，操作繁琐，测序数据读取时间较长，对于低频突变检出结果准确性、时效性不足，尚难以在临床检测中得到广泛的应用。

EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和p23带，相隔约10Mb左右的距离。这两个基因片段的倒位融合能够使得组织表达新的融合蛋白。不同的EML4-ALK融合突变体往往具有恶性转化和致瘤性能力，然而，对EMI4-ALK融合基因突变的检测方法还有待提高其检出的特异性和敏感性。

荧光定量PCR检测技术是美国PE公司研发的一种新的核酸定量技术，在基因表达差异分析、SNP检测、产前诊断和药物疗效考核等方面得到广泛的应用，但尚未在融合基因检测方面得到广泛应用，因此，提供融合基因突变的荧光定量PCR检测方法，提高检测效率和检测结果，具有重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种融合基因突变的荧光定量PCR检测方法，提高检测效率和检测结果的准确性。本发明可以针对不同融合基因设计相应的引物，并实现其融合基因突变的检测。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供融合基因突变的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

1)融合基因位点查找：查找融合基因信息，查找其外显子断裂点，并根据外显子断裂点查找其断裂点到终止点的转录本序列；

2)融合突变序列兼并分析：将步骤1)得到的两段转录本序列合并，作为完整的融合结果序列；

3)扩增引物的设计与合成：以步骤2)得到的融合结果序列为序列模板，进行上下游扩增引物的序列设计，合成并纯化；

4)反应体系的扩增与验证：包括如下步骤：4.1准备阴性和阳性RNA样本，将阳性RNA样本按照倍数比例稀释为低突变频率阳性RNA样本，稀释过程使用阴性样本作为稀释剂；4.2RNA样本逆转录，使用试剂盒进行RNA逆转录成cDNA；4.3反应体系配制和PCR扩增：配制含所述上下游扩增引物的反应体系，进行PCR扩增，每个循环结束后收集荧光信号；4.4结果判断：根据扩增溶解曲线读取Tm值，进行检测结果的判断。

优选地，所述融合基因为EML4-ALK，其外显子断裂点包括EML4基因20号外显子断裂点和ALK基因20号外显子断裂点。

优选地，所述上下游扩增引物包括：上游引物TGGTCCCCAGACAACAAGTAT，即SEQ IDNO：1，下游引物TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT，即SEQ ID NO：2。

优选地，所述反应体系包括所述上下游扩增引物、扩增反应液、cDNA和无核酸酶水；PCR扩增的运行条件包括：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环。

优选地，所述试剂盒为cDNA一链合成试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供的荧光定量PCR检测方法，可以针对不同融合基因设计相应的引物，并实现其融合基因突变的检测，提高检测效率，检测结果可靠性强。

(2)本发明提供的荧光定量PCR检测方法检测快速，操作简便，结果判读的简单、直观，与FISH荧光原位杂交相比较，对于技术人员的判读水平不需要太高，可以直观看到溶解曲线的峰图变化对应的阴阳性判断。

(3)本发明提供的荧光定量PCR检测方法不需要更深的人工分析，与高通量测序技术相比，不需要生物信息学流程搭建及分析，节省了时间(通常高通量测序测序实验流程需要包括提取，文库构建，质检定量，测序上机等流程，需要3～5天完成，本发明基于荧光定量PCR技术进行，实验完整流程可以1天内完成并出结果)，且对物料、设备和人员的要求更低。

附图说明

图1阴性样本的扩增溶解曲线。

图2阳性样本的扩增溶解曲线。

图3 2倍稀释阳性样本的扩增溶解曲线。

图4 10倍稀释阳性样本的扩增溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1EML4-ALK融合基因突变的荧光定量PCR检测方法

EML4-ALK融合基因突变的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

1)融合基因位点查找：在COSMIC(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)查找EML4-ALK融合信息，查找EML4基因20号外显子断裂点，ALK基因20号外显子断裂点，并根据外显子断裂点，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找EML4基因起点到断裂点的转录本序列，ALK基因的断裂点到终止点的转录本序列；

EML4 exon20部分断裂点前后序列如下所示(删除线标记为断裂位点)：

ATGGCTTCCAAATAGAAGTACAGGGTCATACAGATGAGCTTTGGGGTCTTGCCACACATCCCTTCAAAGATTTGCTCTTGACATGTGCTCAGGACAGGCAGGTGTGCCTGTGGAACTCAATGGAACACAGGCTGGAATGGACCAGGCTGGTAGATGAACCAGGACACTGTGCAGATTTTCATCCAAGTGGCACAGTGGTGGCCATAGGAACGCACTCAGGCAGGTGGTTTGTTCTGGATGCAGAAACCAGAGATCTAGTTTCTATCCACACAGACGGGAATGAACAGCTCTCTGTGATGCGCTACTCAATAGATGGTACCTTCCTGGCTGTAGGATCTCATGACAACTTTATTTACCTCTATGTAGTCTCTGAAAATGGAAGAAAATATAGCAGATATGGAAGGTGCACTGGACATTCCAGCTACATCACACACCTTGACTGGTCCCCAGACAACAAGTATATAATGTCTAACTCGGGAGACTATGAAATATTGTACTGGGACATTCCAAATGGCTGCAAACTAATCAGGAATCGATCGGATTGTAAGGACATTGATTGGACGACATATACCTGTGTGCTAGGATTTCAAGTATTTGGTGTCTGGCCAGAAGGATCTGATGGGACAGATATCAATGCACTGGTGCGATCCCACAATAGAAAGGTGATAGCTGTTGCCGATGACTTTTGTAAAGTCCATCTGTTTCAGTATCCCTGCTCCAAAGCAAAGGCTCCCAGTCACAAGTACAGTGCCCACAGCAGCCATGTCACCAATGTCAGTTTTACTCACAATGACAGTCACCTGATATCAACTGGTGGAAAAGACATGAGCATCATTCAGTGGAAACTTGTGGAAAAGTTATCTTTGCCTCAGAATGAGACTGTAGCGGATACTACTCTAACCAAAGCCCCCGTCTCTTCCACTGAAAGTGTCATCCAATCTAATACTCCCACACCGCCTCCTTCTCAGCCCTTAAATGAGACAGCTGAAGAGGAAAGTAG。

ALK exon20部分断裂点前后序列如下所示(删除线标记为断裂位点)：

GATAACACTTCCTTGCTCTGGGCCGGAAAATCTTTGCAGGAGGGTGCCACCGGAGGACATTCCTGCCCCCAGGCCATGAAGAAGTGGGGGTGGGAGACAAGAGGGGGTTTCGGAGGGGGTGGAGGGGGGTGCTCCTCAGGTGGAGGAGGCGGAGGATATATAGGCGGCAATGCAGCCTCAAACAATGACCCCGAAATGGATGGGGAAGATGGGGTTTCCTTCATCAGTCCACTGGGCATCCTGTACACCCCAGCTTTAAAAGTGATGGAAGGCCACGGGGAAGTGAATATTAAGCATTATCTAAACTGCAGTCACTGTGAGGTAGACGAATGTCACATGGACCCTGAAAGCCACAAGGTCATCTGCTTCTGTGACCACGGGACGGTGCTGGCTGAGGATGGCGTCTCCTGCATTGTGTCACCCACCCCGGAGCCACACCTGCCACTCTCGCTGATCCTCTCTGTGGTGACCTCTGCCCTCGTGGCCGCCCTGGTCCTGGCTTTCTCCGGCATCATGATTGTGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCAGATGGAGCTGCAGAGCCCTGAGTACAAGCTGAGCAAGCTCCGCACCTCGACCATCATGACCGACTACAACCCCAACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCTCCTCCATCAGTGACCTGAAGGAGGTGCCGCGGAAAAACATCACCCTCATTCGGGGTCTGGGCCATGGCGCCTTTGGGGAGGTGTATGAAGGCCAGGTGTCCGGAATGCCCAACGACCCAAGCCCCCTGCAAGTGGCTGTGAAGACGCTGCCTGAAGTGTGCTCTGAACAGGACGAACTGGATTTCCTCATGGAAGCCCTGATCATCAGCAAATTCAACCACCAGAACATTGTTCGCTGCATTGGGGTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGGGGGAGACCTCAAGTCCTTCCTCCGAGAGACCCGCCCTCGCCCGAGCCAGC。

2)融合突变序列兼并分析：将步骤1)得到的两段转录本序列合并，作为完整的融合结果序列如下所示(删除线标记为断裂位点，下划线标记为上下游互补配对位点)；

ATGGCTTCCAAATAGAAGTACAGGGTCATACAGATGAGCTTTGGGGTCTTGCCACACATCCCTTCAAAGATTTGCTCTTGACATGTGCTCAGGACAGGCAGGTGTGCCTGTGGAACTCAATGGAACACAGGCTGGAATGGACCAGGCTGGTAGATGAACCAGGACACTGTGCAGATTTTCATCCAAGTGGCACAGTGGTGGCCATAGGAACGCACTCAGGCAGGTGGTTTGTTCTGGATGCAGAAACCAGAGATCTAGTTTCTATCCACACAGACGGGAATGAACAGCTCTCTGTGATGCGCTACTCAATAGATGGTACCTTCCTGGCTGTAGGATCTCATGACAACTTTATTTACCTCTATGTAGTCTCTGAAAATGGAAGAAAATATAGCAGATATGGAAGGTGCACTGGACATTCCAGCTACATCACACACCTTGAC

3)扩增引物的设计与合成：以步骤2)得到的融合结果序列为序列模板，进行上下游扩增引物的序列设计，合成并纯化；

表1上下游引物的序列及相关信息

上下游引物序列设计，需要满足如下要求：(1)上游引物3’端位置距离两个基因的断裂融合位点前的碱基序列数不低于45bp，下游引物5’端位置距离两个基因的断裂融合位点后的碱基序列数不低于45bp；(2)G/C含量在40～60％，引物长度在18～35bp，上下游引物间互补配对数不高于6bp；(3)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对上下游引物具有特异性。

4)反应体系的扩增与验证：包括如下步骤：4.1准备阴性和阳性RNA样本，将阳性RNA样本按照倍数比例稀释为低突变频率阳性RNA样本，稀释过程使用阴性样本作为稀释剂；4.2RNA样本逆转录，使用试剂盒进行RNA逆转录成cDNA；4.3反应体系配制和PCR扩增：配制含所述上下游扩增引物的反应体系，进行PCR扩增，每个循环结束后收集荧光信号；4.4结果判断：根据扩增溶解曲线读取Tm值，进行检测结果的判断。

表2反应体系

表3PCR扩增的运行条件

阴性样本的扩增溶解曲线如图1所示，阳性样本的扩增溶解曲线如图2所示，2倍阳性样本的扩增溶解曲线如图3所示，10倍阳性样本的扩增溶解曲线如图4所示。可见，本发明提供的荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异性好。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州华银健康医疗集团股份有限公司

<120> 融合基因突变的荧光定量PCR检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

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