一种化妆品舒敏原料的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种化妆品舒敏原料的筛选方法，属于化妆品技术领域。

背景技术

随着饮食结构的变化、大气污染、生活和工作压力的增大，过敏患者急剧增加。尤其是在日本、美国等发达国家，过敏已经成为了影响人类健康的社会问题。据不完全统计，全球敏感性肌肤的人群越来越多，男性占38％，女性占52％。

过敏是指人体免疫系统对某些物质如细菌、病毒、花粉、尘螨、皮毛以及药物等排斥，引起人体的异常反应。过敏性物质(即过敏原，也叫变应原)进入人体后，能使某些组织细胞释放出一些活性物质，而这些活性物质能使平滑肌收缩，毛细血管通透性增加，黏膜腺体分泌增多，所以过敏者常出现皮肤红肿、瘙痒、斑块或喉部、支气管、胃肠痉挛等症状。过敏反应是指人体对抗原物质接触后的不正常反应。皮肤敏感的一般表现是干燥、瘙痒、红肿、色素沉着等。它于正常的免疫反应不同，不但不起保护作用，相反由于反应过度强烈而导致生理功能紊乱和组织损伤。

传统的皮肤敏感性预测主要是基于动物实验，包括豚鼠最大值测试、局部封闭涂皮试验以及动物局部淋巴结试验，但一方面由于动物实验成本较高、通量低难以满足化妆品行业飞速发展的需求，另一方面由于动物福利观念的增强和动物实验本身的外推不确定性，基于非动物的体外替代方法越来越多地用于化妆品安全性评价。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种化妆品舒敏原料的筛选方法，建立体外皮肤细胞舒敏模型，将待测物作用于所建立的细胞舒敏模型，筛选能够抑制或促进目标分子表达的物质，得到舒敏原料。

实现上述目的的技术方案是：一种化妆品舒敏原料的筛选方法，结合体外细胞舒敏模型对目标活性物的舒敏功效进行筛选，包括以下步骤：

步骤S1，THP-1细胞培养；

步骤S2，THP-1细胞活力检测确定原料样品的检测浓度，包括以下工序：

将中对数生长的THP-1细胞接种至24孔细胞培养板，加入实验样品，所述实验样品包含6个不同浓度梯度的原料样品，每个浓度相差的倍数为2，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18-24h后，将每种受试物作用下的细胞，从24孔细胞培养板中分别移入对应的1mLEP管中，离心沉淀细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集细胞，然后加入100μL 7-AAD染色液，常温、暗室下作用10min，流式细胞仪进行活力分析，筛选得到THP-1细胞模型细胞存活率为75％(CV75)时对应的原料样品给药浓度；

步骤S3，将步骤S2中对数生长的THP-1细胞接种至24孔细胞培养板，设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和受试物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组和受试物处理组分别加入相同终浓度的DNCB诱发敏感模型；

步骤S4，受试物暴露：阳性对照组加入地塞米松作为对照，受试物处理组加入由完全培养基配置的原料样品，培养18-24h后，将每种受试物作用下的细胞，从24孔细胞培养板中分别移入对应的1mL EP管中，离心沉淀细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集细胞；

步骤S5，FcR阻断：按细胞数量配制适宜浓度的FcR阻断剂，50-100μL体积的一百万个细胞需要2.5μg的FcR阻断剂，随后将离心获得的细胞进行阻断；

步骤S6，CD86/CD54抗体染色：将上述进行过阻断的细胞按每管50μL平均分配至3支1mL的EP管中，再加入50μL抗体，包括FITC标记的表面标记物抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1；4℃环境和暗室条件下染色30min；使用FACS缓冲液清洗2次，再用500μL FACS缓冲液重悬细胞并转移5mL流式管中待检测；每次实验条件下需要同时进行7-AAD的染色，步骤同上述，以便确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况；

步骤S7，流式细胞测定：收集分析10000个细胞，通过无处理的空白对照组的THP-1细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算；

步骤S8，体外细胞舒敏模型建立：受试物处理组中的受试物采用二硝基氯苯，按照步骤S2-S7的方法建立体外细胞舒敏模型；

步骤S9，结合体外细胞舒敏模型，受试物处理组中的受试物加入目标活性物，参照步骤S2-S7的方法对目标活性物的舒敏功效进行筛选，以DNCB诱导的目标分子表达量为基准，计算目标活性物引起的目标分子相对表达量，以目标分子相对表达量降低的幅度表示舒敏功效的强度，由此筛选出最佳舒敏功效原料。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S7中，所述目标分子为细胞表面标记物CD86和细胞表面标记物CD54。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S1中，THP-1细胞采用RPMI-1640+10％FBS完全培养基培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S2中，THP-1细胞以2X10

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S3中，THP-1细胞以2X10

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S3中，乳酸的处理浓度为0.1％，DNCB的处理浓度为5μg/mL。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S4中，地塞米松的处理浓度为1μg/mL。

上述的一种化妆品舒敏原料的筛选方法，步骤S4中，所述目标活性物包括圣罗勒、水飞蓟、广藿香、陆地棉、马齿苋、矢车菊、玉兰、牧月、黄岑、乳糖和柑橘皮。

本发明的化妆品舒敏原料的筛选方法，结合体外细胞评价模型，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品舒敏活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为舒敏原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

附图说明

图1为细胞活力随DNCB浓度变化结果图；

图2为细胞活力随乳酸浓度变化结果图；

图3为舒敏受试物对细胞活力的影响结果图。

图4为不同受试物所引起的细胞表面标记物CD86的相对表达量变化结果图；

图5为不同受试物所引起的细胞表面标记物CD54的相对表达量变化结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：

化妆品舒敏原料的筛选方法中涉及的试剂与耗材如表1所示：

表1

一、溶液配制

1、配制FACS缓冲液

将100mg BSA粉末溶解于100mL 1xPBS中，0.22μm滤膜过滤即可。

2、FcR阻断剂工作液

向100μL FACS缓冲液中加入0.5μL FcR阻断剂抗体即可。

3、7-AAD工作液

向398μL FACS缓冲液中加入2μL 7-AAD即可。

二、实验方法

1)细胞培养

THP-1细胞购买于中科院上海细胞库，根据指示说明，使用RPMI-1640培养基添加10％的胎牛血清，放置于含有5％CO

1)细胞铺板：将预先培养的THP-1细胞离心，去上清，用培养基重悬细胞，浓度为2X10

2)受试物暴露：将受试物储备液稀释500倍为添加时的浓度。每孔添加500μL受试物，终浓度为储备液的10000倍。每种受试物测试6个浓度，每个浓度相差的倍数为2。

3)收集细胞：培养18-24h后，将每种受试物作用下的细胞，从24孔细胞培养板中分别移入对应的1mLEP管中，离心沉淀细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集细胞。

4)7-AAD染色：根据说明书，使用FACS缓冲液配制相应浓度的染料，每支EP管中添加100μL，常温、暗室下作用10min。

5)流式细胞仪分析：7-AAD可以区别活细胞和死细胞，死细胞会染上7-AAD。

6)细胞活力分析：细胞存活率(％)＝活细胞数量/通过流式细胞仪的总细胞数X100。

1)细胞铺板：将预先培养的THP-1细胞离心，去上清，用培养基重悬细胞，浓度为2X10

2)受试物暴露：24孔板内设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和不同受试物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组只加入地塞米松，受试物处理组为二硝基氯苯(DNCB)，处理后加入与阳性对照组最终浓度相同的地塞米松。

3)收集细胞：培养18-24h后，将每种受试物作用下的细胞，从24孔细胞培养板中分别移入对应的1mL EP管中，离心沉淀细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集细胞。

4)FcR阻断：按细胞数量配制适宜浓度的FcR阻断剂，50-100μL体积的一百万个细胞需要2.5μg的FcR阻断剂，随后将离心获得的细胞进行阻断。

5)CD86/CD54抗体染色：将上述细胞按每管50μL平均分配至3支1mL的EP管中，再加入50μL抗体，包括FITC-CD86抗体、PE-CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1。4度环境和暗室条件下染色30-45min；使用FACS缓冲液清洗2次，再用500μL FACS缓冲液重悬细胞并转移5mL流式管中待检测。每次实验条件下需要同时进行7-AAD的染色，步骤同上述，以便确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况。

6)流式细胞测定：实验前需要对流式细胞仪检查，保证实验顺利进行。通过无处理的空白对照组的THP-1细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算。建立体外细胞舒敏模型。

1)细胞铺板：将预先培养的THP-1细胞离心，去上清，用培养基重悬细胞，浓度为2X10

2)受试物暴露：舒敏模型选用DNCB来建立。24孔板内设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和不同受试物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入DNCB和地塞米松，受试物处理组先加入与阳性对照组相同浓度的DNCB，后分别加入圣罗勒、水飞蓟、广藿香、陆地棉、马齿苋、矢车菊、玉兰、牧月、黄岑、乳糖、柑橘皮。

3)收集细胞：培养18-24h后，将每种受试物作用下的细胞，从24孔细胞培养板中分别移入对应的1mL EP管中，离心沉淀细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集细胞。

4)FcR阻断：按细胞数量配制适宜浓度的FcR阻断剂，50-100μL体积的一百万个细胞需要2.5μg的FcR阻断剂，随后将离心获得的细胞进行阻断。

5)CD86/CD54抗体染色：将上述进行过阻断的细胞按每管50μL平均分配至3支1mL的EP管中，再加入50μL抗体，包括FITC-CD86抗体、PE-CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1。4℃环境和暗室条件下染色30-45min；使用FACS缓冲液清洗2次，再用500μL FACS缓冲液重悬细胞并转移5mL流式管中待检测。每次实验条件下需要同时进行7-AAD的染色，步骤同上述，以便确定该浓度下细胞活率与相应抗体染色的情况。

6)流式细胞测定：实验前需要对流式细胞仪检查，保证实验顺利进行。通过无处理的空白对照组的THP-1细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算。

三、实验结果

请参阅图1、图2和图3，运用细胞存活率(Cell Viability)来评估受试物对THP-1细胞存活能力的影响，细胞活力随DNCB浓度变化结果参见图1；细胞活力随乳酸浓度变化结果参见图2；舒敏受试物对细胞活力的影响结果参见图3。不同浓度的对照物对THP-1细胞存活率的影响如表2所示：

表2

不同浓度的受试物对THP-1细胞存活率的影响如表3所示：

表3

流式细胞术测定数据分析显示，随着DNCB浓度的升高，THP-1细胞活率逐渐降低，最终确定舒敏模型中DNCB的浓度选为5μg/mL(即CV75时的浓度)。乳酸对照组的细胞存活率无明显变化。

圣罗勒、水飞蓟、广藿香、陆地棉、马齿苋、矢车菊、玉兰、牧月、黄岑、乳糖、柑橘皮等受试物对THP-1细胞的存活率无明显影响。

不同待测物对目标分子CD86和CD54相对表达量的影响如表4所示：

表4

请参阅图4和图5，不同受试物所引起的细胞表面标记物CD86的相对表达量变化结果参见图4；不同受试物所引起的细胞表面标记物CD54的相对表达量变化结果参见图5。

其中，待测物的提取方法均采用现有技术。由表4、图4和图5可知，向细胞液中加入100μg/mL的广藿香后，目标分子CD86和CD54的相对表达量分别为0.27和0.60，与对照组相比有明显的降低，即广藿香能够有效降低细胞表面标记物CD86和CD54的表达，具有较好的舒敏功效。

另外，圣罗勒、水飞蓟、陆地棉、马齿苋、矢车菊、玉兰、牧月、黄岑、乳糖和柑橘皮均能明显降低目标分子CD86和CD54的表达量，可以作为舒敏功效物质进行后续研究。

本发明提供的通过CD86、CD54的表达筛选活性物的方式，稳定性高，重现性好，可以用于特定目的的化妆品原料的筛选，为后续研发提供了新的思路。

综上所述，本发明的化妆品舒敏原料的筛选方法，结合体外皮肤细胞舒敏模型，将待测物作用于所建立的细胞舒敏模型，筛选能够抑制或促进目标分子表达的物质，得到舒敏原料。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。