用于包含乐伐替尼和依维莫司的组合疗法的生物标志物

技术领域

本发明总体上涉及生物标志物和肾细胞癌。

背景技术

肾细胞癌(RCC)是成人中最常见的肾癌类型，占已诊断的肾癌的约90％。

美国食品和药物管理局已经批准乐伐替尼甲磺酸盐为LENVIMA

大多数抗肿瘤治疗与不期望的副作用(例如，深度恶心、呕吐、或严重疲劳)相关。特别是当使用多种抗肿瘤剂作为组合疗法时，需要对这些副作用进行控制。并且，尽管抗肿瘤治疗已经取得了成功，但它们未对所有接受它们的患者产生显著的临床响应，却导致了不期望的副作用、延迟、以及治疗无效相关的成本。因此，强烈地需要可以用于在施用前预测受试者对抗肿瘤剂(特别是当其用于组合疗法中时)的响应的生物标志物。

发明内容

本申请至少部分地基于生物标志物的鉴定，这些生物标志物可以用于鉴定或选择对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应的患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者。获得自治疗前的人类受试者的生物样品中的至少一种蛋白质的表达水平(“基线水平”)被鉴定为对于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应是有用的，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。另外，基于获得自治疗前的人类受试者的生物样品中的至少五种蛋白质的表达水平(“基线水平”)的综合生物标志物被鉴定为对于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应是有用的，这些蛋白质包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A。此外，基于获得自治疗前的人类受试者的生物样品中的至少两种蛋白质的表达水平(“基线水平”)的综合生物标志物被鉴定为对于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应是有用的，这些蛋白质包含IL-18BP和ANG-2。因此，本文所述的包括综合生物标志物分数的生物标志物和组合物在例如鉴定、分层、和/或选择患有肾细胞癌的患者或患者亚组中是有用的，该患者或患者亚组可以受益于包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法。另外，本文所述的方法在例如为患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者选择适当治疗模式(例如，包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法或者替代性肾细胞癌疗法)中是有用的。

在一个方面，本披露提供了鉴定患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的方法。该方法涉及测定获得自施用组合疗法前的受试者的生物样品并且确定与对照相比，生物样品中的至少一种蛋白质的表达水平更低，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。在生物样品中具有至少一种蛋白质的低表达水平的受试者被鉴定为对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。可替代地，该方法涉及测定获得自施用组合疗法前的受试者的生物样品并且确定与对照综合标志物分数相比，基于生物样品中

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内。在生物样品中具有此综合生物标志物分数的受试者被鉴定为对组合疗法有响应。在某些实施例中，基于生物样品中包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在一些实施例中，基于生物样品中包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在一些实施例中，基于生物样品中包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在其他实施例中，基于生物样品中包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。

在第二方面，本披露的特征在于选择患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者来施用包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法的方法。该方法包括测定获得自人类受试者的生物样品的至少一种蛋白质的基线表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。如果确定与对照相比，生物样品中至少一种蛋白质的基线表达水平更低，则选择该受试者来施用组合疗法，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。在某些实施例中，该方法进一步包括向人类受试者施用组合疗法。可替代地，该方法包括在生物样品中测定获得自人类受试者的生物样品的

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平。如果确定与对照综合标志物分数相比，综合生物标志物分数落在表明人类受试者对组合疗法有响应的范围内，则选择该受试者来施用组合疗法。在某些实施例中，该方法进一步包括向人类受试者施用组合疗法。在某些实施例中，该方法包括在生物样品中测定生物样品的至少五种蛋白质的基线表达水平，这些蛋白质包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A。在一些实施例中，该方法包括在生物样品中测定生物样品的至少五种蛋白质的基线表达水平，这些蛋白质包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2。在一些实施例中，该方法包括在生物样品中测定生物样品的至少五种蛋白质的基线表达水平，这些蛋白质包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A。在其他实施例中，该方法包括在生物样品中测定生物样品的至少两种蛋白质的基线表达水平，这些蛋白质包含IL-18BP和ANG-2。

在第三方面，本披露提供了治疗肾细胞癌的方法。该方法涉及提供获得自治疗前患有肾细胞癌的人类受试者的生物样品；在生物样品中测量与对照相比更低的至少一种蛋白质的表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组；以及向人类受试者施用治疗有效量的乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司。可替代地，该方法包括涉及提供获得自治疗前患有肾细胞癌的人类受试者的生物样品；测量基于生物样品中

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数；以及向人类受试者施用治疗有效量的乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司，其中与对照综合标志物分数相比，该综合生物标志物分数表明人类受试者对组合疗法有响应。在某些实施例中，基于生物样品中包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在一些实施例中，基于生物样品中包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在一些实施例中，基于生物样品中包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。在其他实施例中，基于生物样品中包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平来计算综合生物标志物分数。

在第四方面，本披露提供了治疗肾细胞癌的方法。该方法涉及向患有肾细胞癌的人类受试者施用治疗有效量的包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法，其中该人类受试者已被鉴定为具有与对照相比更低的至少一种蛋白质的表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的，或者与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的。在某些实施例中，受试者已被鉴定为在获得自该人类受试者的生物样品中具有更低的至少一种蛋白质的表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。在某些实施例中，受试者已被鉴定为在获得自该人类受试者的生物样品中具有基于至少五种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数，这些蛋白质包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A，其中与对照综合标志物分数相比，该综合生物标志物分数落在表明人类受试者对组合疗法有响应的范围内。在一些实施例中，受试者已被鉴定为在获得自该人类受试者的生物样品中具有基于至少五种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数，这些蛋白质包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，其中与对照综合标志物分数相比，该综合生物标志物分数落在表明人类受试者对组合疗法有响应的范围内。

在一些实施例中，受试者已被鉴定为在获得自该人类受试者的生物样品中具有基于至少五种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数，这些蛋白质包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A，其中与对照综合标志物分数相比，该综合生物标志物分数落在表明人类受试者对组合疗法有响应的范围内。在一些实施例中，受试者已被鉴定为在获得自该人类受试者的生物样品中具有基于至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数，这些蛋白质包含IL-18BP和ANG-2，其中与对照综合标志物分数相比，该综合生物标志物分数落在表明人类受试者对组合疗法有响应的范围内。

在第五方面，本披露的特征在于治疗患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者的方法。该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者在获得自该受试者的生物样品中具有低于对照的至少一种蛋白质的基线表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组，或者该人类受试者具有与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的。在某些实施例中，该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者在获得自该受试者的生物样品中具有低于对照的至少一种蛋白质的基线表达水平，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。在一些实施例中，该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者具有与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平计算的。在一些实施例中，该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者具有与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2的至少五种蛋白质的基线表达水平计算的。在一些实施例中，该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者具有与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质的基线表达水平计算的。在其他实施例中，该方法涉及向人类受试者施用包含依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中该人类受试者具有与对照综合标志物分数相比，落在表明人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的范围内的综合生物标志物分数，该分数是基于包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的。

上述综合生物标志物分数可以通过以下步骤来计算：

在生物样品中测量

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平；

基于每种蛋白质的基线表达水平来确定其分数；以及

对这些分数求和以获得综合生物标志物分数。

在一个实施例中，如果基线表达水平落在与对组合疗法有较好治疗结果响应的人类受试者群体相关的值范围内，则更大的值可以被指定为每种蛋白质的分数，其中等于或高于对照综合生物标志物分数的该综合生物标志物分数预测了该人类受试者对该包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应。在一个实施例中，如果基线表达水平落在与对组合疗法有较好治疗结果响应的人类受试者群体相关的值范围内，则更小的值可以被指定为每种蛋白质的分数，其中等于或低于对照综合生物标志物分数的该综合生物标志物分数预测了该人类受试者对该包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应。

在一个实施例中，每种蛋白质的分数是基于每种蛋白质的基线表达水平的二进制值。在一个实施例中，该二进制值是0或1。

在一个实施例中，通过比较每种蛋白质的基线表达水平和对照表达水平来确定与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围。

在一个实施例中，该至少五种蛋白质包含HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2。在另一个实施例中，该至少五种蛋白质包含TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A。在又另一个实施例中，该至少五种蛋白质由HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2组成。在仍另一个实施例中，该至少五种蛋白质由TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A组成。

在一个实施例中，该至少两种蛋白质包含IL-18BP和ANG-2。在另一个实施例中，该至少两种蛋白质由IL-18BP和ANG-2组成。

以下这些实施例设想用于以上所有这些方面。

在一个实施例中，该乐伐替尼或其药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。

在一个实施例中，该肾细胞癌是晚期肾细胞癌或转移性肾细胞癌。

在一些实施例中，该生物样品选自由以下组成的组：血液样品、血清样品、血浆样品、肾细胞癌存档的肿瘤样品、以及肾细胞癌活组织检查样品。

在一些实施例中，该对照或对照表达水平是预建立的截断值。在一个实施例中，该预建立的截断值是基于预测相比于无截断具有更高阳性预测值的肿瘤响应的接收者操作特性(ROC)分析或百分率分析确定的蛋白质的表达水平，并且其中等于或高于该预建立的截断值的蛋白质的表达水平是高表达水平，并且低于该预建立的截断值的值是低表达水平。该肿瘤响应是客观响应率(ORR)、临床受益率(CBR)、或最大肿瘤缩小％。在另一个实施例中，该预建立的截断值是基于预测存活期的模拟模型或百分率分析而确定的蛋白质的表达水平，并且其中等于或高于该预建立的截断值的蛋白质的表达水平是蛋白质的高表达水平，并且低于该预建立的截断值的值是蛋白质的低表达水平。在此上下文中，存活期是无进展存活期(PFS)或总体存活期(OS)。在一些实施例中，通过Eisenhauer,E.A.等人,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]45:228-247(2009)中阐述的RECIST 1.1响应标准来定义ORR、CBR或PFS和OS。

在一些实施例中，该对照综合生物标志物分数是预建立的截断值。在一个实施例中，该预建立的截断值是综合生物标志物分数，其中每种蛋白质的分数是基于预测相比于无截断具有更高阳性预测值的肿瘤响应的ROC分析或百分率分析确定的，并且其中等于或高于该预建立的截断值的综合生物标志物分数是高综合生物标志物分数并且低于该预建立的截断值的综合生物标志物分数是低综合生物标志物分数。该肿瘤响应是ORR、CBR、或最大肿瘤缩小％。在另一个实施例中，该预建立的截断值是基于预测存活期的模拟模型或百分率分析而确定的综合生物标志物分数，并且其中等于或高于该预建立的截断值的综合生物标志物分数是高综合生物标志物分数并且低于该预建立的截断值的综合生物标志物分数是低综合生物标志物分数。在此上下文中，存活期是PFS或OS。

在一些实施例中，该方法进一步包括将这些检验结果通信至该受试者的医疗服务提供者。在某些实施例中，该方法进一步包括修改该受试者的医疗记录以表明该受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应或无响应。在具体的实施例中，该记录在一种计算机可读介质上创建。在某些实施例中，如果选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的基线表达谱或基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数预测了受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法有响应，则该方法进一步包括为该受试者开出包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法的处方。在一些实施例中，如果选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的基线表达谱或基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数预测了受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的疗法有响应，则该方法进一步包括向该受试者施用包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法。

在一个实施例中，通过测量蛋白质的量来确定蛋白质的表达水平。在一个实施例中，可以通过免疫学方法来测量蛋白质的量。在一些实施例中，该免疫学方法选自由以下组成的组：酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、胶乳比浊免疫测定、胶乳光度免疫测定、免疫色谱测定、和蛋白质印迹法。在另一个实施例中，通过酶免疫测定来测量蛋白质的量。

在第六方面，本披露提供了与依维莫司同时使用用于治疗人类受试者中肾细胞癌的乐伐替尼或其药学上可接受的盐，其中通过上述方法，该人类受试者被鉴定为对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的受试者。在一些实施例中，该乐伐替尼的药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。在一个实施例中，该肾细胞癌是晚期或转移性肾细胞癌。

在第七方面，本披露提供了用于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的蛋白质检测药剂。在一个实施例中，该蛋白质检测药剂是与蛋白质结合的抗体。在一些实施例中，该乐伐替尼的药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。

在第八方面，本披露的特征在于包含用于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应的蛋白质检测药剂的试剂盒。在某些实施例中，该蛋白质检测药剂是与蛋白质结合的抗体。在某些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在其他实施例中，该抗体是多克隆抗体。在某些实施例中，该抗体与可检测药剂偶联。在一个实施例中，该可检测药剂是辣根过氧化物酶、生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标签、或肽标签。在一个实施例中，该可检测地标记的抗体被涂覆在微板上。在某些实施例中，该微板是96孔微板。在某些实施例中，该试剂盒任选地包括一种或多种浓度标准、一种或多种缓冲液(例如，洗涤缓冲液)、一种或多种稀释剂(例如，测定和/或校准稀释剂)、以及一种或多种促进检测蛋白质检测药剂是否特异性地结合获得自该受试者的生物样品中的蛋白质的试剂(例如，显色试剂、终止溶液)。在一些实施例中，该乐伐替尼的药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或试验中可以应用类似于或等同于本文描述的那些的方法和材料，但是以下描述了示例性的方法和材料。将所有出版物、专利申请书、专利和本文提及的其他参考文献通过引用以其全文并入。在矛盾的情况下，本申请(包括定义)将居主导。这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。

本发明的其他特征和优点从以下详细的说明以及从权利要求中应当是清楚的。

附图说明

[图1]图1是CBS分析(5种生物标志物)中LEN/EVE和EVE组中通过CBS分类(0-2相对3-5)确定的PFS的Kaplan-Meier(K-M)曲线。

[图2]图2是CBS分析(5种生物标志物)中LEN/EVE和EVE组中通过CBS分类(0-2相对3-5)确定的OS的K-M曲线。

[图3]图3是CBS分析(2种生物标志物)中LEN/EVE和EVE组中通过CBS分类(0相对1-2)确定的PFS的K-M曲线。

[图4]图4是CBS分析(2种生物标志物)中LEN/EVE和EVE组中通过CBS分类(0相对1-2)确定的OS的K-M曲线。

具体实施方式

本披露提供了用于鉴定对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应的肾细胞癌受试者(例如，人类患者)的方法和组合物。本披露提供了作为预测性生物标志物的选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的基线表达水平，或基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数，以鉴定那些患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌(例如，晚期或转移性肾细胞癌)风险中的受试者，建议向这些受试者施用包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法。本文所述的包括综合生物标志物分数的生物标志物、组合物和方法在为患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者选择适当治疗模式(例如，包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法或者替代性肾细胞癌疗法)中是有用的。此外，本申请提供了选择可以受益于包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的患者的方法以及治疗方法。

术语“受试者”意指一种哺乳动物，包括但不限于，人类、黑猩猩、红猩猩、大猩猩、狒狒、猴、小鼠、大鼠、猪、马、狗、以及牛。

术语“组合疗法”意指向患者同时施用两种或更多种药物的疗法。可以同时、基本上同时或依次施用两种或更多种药物。在一些情况下，可将两种或更多种药物配制在一起(例如，制成单个片剂或胶囊)。在其他情况下，两种或更多种药物不共同配制(例如，它们以单独的片剂或胶囊形式施用)。

术语“乐伐替尼”是指4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺。此化合物披露于美国专利号7,253,286的实例368(参见，第270栏)中。将美国专利号7,253,286通过引用以其全文并入本文。术语“乐伐替尼化合物”是指“乐伐替尼或其药学上可接受的盐”。乐伐替尼的药学上可接受的盐的一个实例是乐伐替尼甲磺酸盐。乐伐替尼甲磺酸盐也被称为E7080。美国食品和药物管理局已经批准乐伐替尼甲磺酸盐为LENVIMA

至于盐的类型，术语“药学上可接受的盐”不受特别限制。这类盐的实例包括但不限于无机酸加成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、氢溴酸盐以及氢碘酸盐；有机羧酸加成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、乳酸盐、酒石酸盐以及三氟乙酸盐；有机磺酸加成盐，例如甲磺酸盐、羟基甲磺酸盐、羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐以及牛磺酸盐；胺加成盐，例如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、普鲁卡因盐、皮考啉盐、二环己基胺盐、N,N'-二苄乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、三(羟甲基氨基)甲烷盐以及苯乙基苄胺盐；以及氨基酸加成盐，例如精氨酸盐、赖氨酸盐、丝氨酸盐、甘氨酸盐、天冬氨酸盐以及谷氨酸盐。在一个实施例中，药学上可接受的盐是甲烷磺酸盐(“甲磺酸盐”)。4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺的甲烷磺酸盐形式(即，甲磺酸盐)披露于美国专利7,612,208中，将其通过引用以其全文并入本文。

术语“依维莫司”是指(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.0

术语“蛋白质”意指氨基酸的任何肽连接的链，不论长度或翻译后修饰。典型地，当本文所述的蛋白质构成制剂中按重量计至少60％的总蛋白质时(例如，样品中60％的总蛋白质)，它是“分离的”。在一些实施例中，本文所述的蛋白质由在制剂中按重量计至少75％、至少90％或至少99％的总蛋白质组成。

术语“VEGF靶向疗法”意指包括施用作用于一个或多个血管内皮生长因子(VEGF)受体的抗肿瘤剂的任何疗法。用于VEGF靶向疗法的抗肿瘤剂的非限制性实例是：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿替尼替、瓦他拉尼碱和替他扎尼。

术语“响应于疗法/对疗法有响应”意指被施用该疗法的受试者对于所提供的疗法显示出正响应。这种正响应的非限制性实例是：肿瘤尺寸的减小、肿瘤转移的减少、或治疗后增长的存活期。对于经预测对组合疗法有响应的受试者，可将组合疗法作为优选治疗进行推荐。可将组合疗法作为优选治疗进行推荐的情况的非限制性实例是：包含两种特定药物的组合疗法被预测为比包含至少一种不同于所述两种特定药物的两种药物的一种或多种其他组合疗法更有效；包含两种特定药物的组合疗法被预测为比用所述两种药物中的一种或每种的单一疗法更有效。在一个实施例中，情况是，乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法被预测为比用依维莫司的单一疗法更有效，这两种疗法均已获美国食品和药物管理局批准作为晚期肾细胞癌的疗法。

来自受试者的样品中的蛋白质的术语“基线水平”意指向受试者施用依维莫司和乐伐替尼或其药学上可接受的盐的组合疗法之前样品中蛋白质的量。

术语“单一生物标志物分析”意指通过单一生物标志物表达水平来确定患者对治疗的响应的鉴定、预测或选择的分析。当分析多于一种生物标志物时，将对每种蛋白质进行确定。更特别地，本披露的单一生物标志物分析是使用生物样品中的至少一种蛋白质进行的分析，以鉴定或预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者是否对本文披露的包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应，该蛋白质选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组。

术语“综合生物标志物分数分析”意指通过综合评估多个蛋白质的表达水平来确定患者对治疗的响应的鉴定、预测或选择的分析。综合生物标志物分数分析中使用的蛋白质可以选自与希望的治疗结果有关的蛋白质。更特别地，本披露的综合生物标志物分数分析是使用基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合标志物分数进行的分析，以鉴定或预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的人类受试者是否对本文披露的包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。综合生物标志物分数可以通过以下步骤来计算：

在生物样品中测量或已经测量了

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平；

基于每种蛋白质的基线表达水平来确定或已经确定了其分数；以及

对这些分数求和或已经对这些分数进行了求和以获得综合生物标志物分数。

医师可以自己进行基线表达水平的测量、分数确定或综合生物标志物分数的计算，或者可以让其他医师或医疗服务提供者来进行。

在一个实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更高的分数指定至每种蛋白质。在这种情况下，等于或高于对照综合生物标志物分数的综合生物标志物分数预测了人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应。在另一个实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更低的分数指定至每种蛋白质。在这种情况下，等于或低于对照综合生物标志物分数的综合生物标志物分数预测了人类受试者对包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐和依维莫司的组合疗法有响应。

基于每种蛋白质的基线表达水平的分数可以是二进制值。该二进制值可以是任何值。该二进制值可以选自零和正数。该二进制值也可以选自零和正整数。该二进制值的一个实例是0或1。可以通过比较每种蛋白质的基线表达水平和对照表达水平来确定与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围。对于HGF、MIG、IL-18BP、IL-18、ANG-2、TIMP-1、M-CSF和VEGF-A，与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围可以是低于每种蛋白质的对照表达水平的值范围。综合生物标志物分数分析中使用的蛋白质选自与希望的治疗结果有关(例如，强烈有关或相关)的蛋白质。与希望的治疗结果有关的蛋白质可以通过本领域已知的统计方法来确定。例如，可以使用单变量Cox回归分析和对数秩检验来进行中位数截断点的二分法分析，以鉴定与希望的治疗结果有关的候选生物标志物，并且可以选择相关性最强的几种候选生物标志物进行综合生物标志物分数分析。“至少五种蛋白质”可以是包含以下的多于五种蛋白质：(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A，或者以下的五种蛋白质：(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A。“至少两种蛋白质”可以是包含IL-18BP和ANG-2的多于两种蛋白质，或者IL-18BP和ANG-2的两种蛋白质。综合生物标志物分数分析的一种方法描述于Voss等人,Br J Cancer[英国癌症杂志].2016年3月15日；114(6):642-9中。

与选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的对照相比，低基线表达水平(例如，蛋白质或mRNA表达)表明或预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。例如，获得自用疗法治疗前的受试者的生物样品中选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的低基线表达水平(与对照相比)预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则将更大的值指定为每种蛋白质的分数值，在这种情况下与对照综合生物标志物分数相比，基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的高综合标志物分数表明或预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。例如，与对照综合标志物分数相比，基于获得自用疗法治疗前的受试者的生物样品中

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的高综合标志物分数预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则将更小的值指定为每种蛋白质的分数值，在这种情况下与对照综合生物标志物分数相比，基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的低综合标志物分数表明或预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。例如，与对照综合标志物分数相比，基于获得自用疗法治疗前的受试者的生物样品中

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的低综合标志物分数预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

在某些实施例中，如果受试者在用包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法治疗后显示出部分响应，则确定该受试者对该疗法有响应。“部分响应”意指靶病变的最长直径(LD)总和减小至少30％，以基线总计LD用作参比。在一些实施例中，如果受试者在用包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法治疗后显示出肿瘤缩小，则确定该受试者对该疗法有响应。“最大肿瘤缩小(MTS)％”意指靶病变直径总和的变化百分比，以基线总直径用作参比。在其他实施例中，如果受试者显示出总体存活期，则确定该受试者对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。“总体存活期”(OS)是指从随机化直到任何原因所导致死亡的时间。“随机化”意指当确定患者的治疗计划时使患者随机进入测试组或对照组。在一些实施例中，如果受试者显示出总体存活期和肿瘤缩小两者，则确定该受试者对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。在其他实施例中，如果受试者显示出无进展存活期，则确定该受试者对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。“无进展存活期”(PFS)是指从随机化的日期到疾病进展或死亡(以先发者为准)的首次记录日期的时间。在一些实施例中，如果受试者显示出无进展存活期和肿瘤缩小两者，则确定该受试者对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。

本披露提供了鉴定患有肾细胞癌的受试者的方法，相比于仅包含依维莫司的单一疗法，该患有肾细胞癌的受试者在遵循包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法后更可能获得存活益处(例如，OS)。在此方法中，测定获得自用包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法治疗前的受试者的生物样品，并且测量选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的表达水平或

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的表达水平。与对照相比，选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的较低基线表达表明，相比于仅包含依维莫司的单一疗法，受试者在遵循包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法后将更可能获得存活益处(例如，OS)。如果基线表达水平落在值范围内，则将更大的值指定为每种蛋白质的分数，在这种情况下与对照综合生物标志物分数相比，基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的较高综合标志物分数表明，相比于仅包含依维莫司的单一疗法，受试者在遵循包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法后将更可能获得存活益处。如果基线表达水平落在值范围内，则将更小的值指定为每种蛋白质的分数，在这种情况下与对照综合生物标志物分数相比，基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的较低综合标志物分数表明，相比于仅包含依维莫司的单一疗法，受试者在遵循包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法后将更可能获得存活益处(例如，OS)。

在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用12、18或24mg剂量(各自计算为乐伐替尼游离碱)的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)，每天一次。

在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用5或10mg剂量的依维莫司，每天一次。

在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用18mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用5mg的依维莫司(每天一次)。在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用12mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用5mg的依维莫司(每天一次)。在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用24mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用5mg的依维莫司(每天一次)。在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用18mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用10mg的依维莫司(每天一次)。在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用12mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用10mg的依维莫司(每天一次)。在某些实施例中，可以向本发明的受试者口服施用24mg剂量的乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)(每天一次)以及口服施用10mg的依维莫司(每天一次)。

蛋白质的量可以使用本领域中已知的任何方法进行测量(例如，免疫学测定)。这类方法的非限制性实例包括酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、胶乳比浊免疫测定、胶乳光度免疫测定、免疫色谱测定、和蛋白质印迹法。在某些实施例中，通过酶免疫测定来测量蛋白质的量。

如上所述，本发明的方法可以涉及测量或已经测量了来自患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者的生物样品中蛋白质的基线表达水平，其中与对照相比，蛋白质的表达水平预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合治疗有响应(或受益于该组合疗法)，或者与对照相比，蛋白质的表达水平可以用于计算综合标志物分数。在某些实施例中，当来自患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者的生物样品中选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的基线表达水平低于对照时，受试者被鉴定为对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。在使用综合生物标志物分数分析的某些实施例中，当与对照相比，

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的每种蛋白质的基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内时，指定某一分数。在一个实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更大的值指定为每种蛋白质的分数。在另一个实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更小的值指定为每种蛋白质的分数。

在此上下文中，术语“对照”包括获得自对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法无响应的受试者的样品(例如，来自相同的组织)。这种对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法无响应的受试者可包括预测其对该组合疗法有响应的受试者，但是其对该组合疗法的这种响应并不比对用依维莫司进行的单一疗法所预测的响应显著更好。术语“对照”还包括如下样品(例如，来自相同的组织)，该样品过去获得自已知对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应的受试者并且用作为了测试取自预测需要进行组合疗法的受试者的样品的将来对比的参比。

在一些实施例中，可以使用“阳性对照”来代替“对照”。特定细胞类型或组织中“阳性对照”表达水平可以替代性地通过对一个或多个已被鉴定为对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应的受试者的分析来预建立。然后可以将该预建立的参比值(其可以是取自已经被鉴定为对组合疗法有响应的多个受试者的表达水平的平均值或中位数)用作与测试样品对比中的“阳性对照”表达水平。在这一对比中，如果正被分析的选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的表达水平与预建立的阳性对照参比相同或相当，则预测受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。在应用综合生物标志物分数分析的实施例中，如果

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的每种生物标志物的基线表达水平与预建立的阳性对照参比相同或相当，则将某一分数指定为落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内的基线表达水平。在一些实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更大的值指定为每种蛋白质的分数。在其他实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则可以将更小的值指定为每种蛋白质的分数。

在某些实施例中，该“对照”是预设的截断值。

如上所述，使用综合生物标志物分数分析的本发明的方法可以涉及在来自患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者的生物样品中通过对分数进行求和来确定综合生物标志物分数，每个分数是基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平确定的，其中与对照综合生物标志物分数相比，该综合生物标志物分数预测了受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合治疗有响应(或受益于该组合治疗)。在某些实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则将更大的值指定为每种蛋白质的分数并且综合生物标志物分数等于或高于对照，在这种情况下将受试者鉴定为对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。在某些实施例中，如果基线表达水平落在与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内，则将更小的值指定为每种蛋白质的分数并且综合生物标志物分数等于或低于对照，在这种情况下将受试者鉴定为对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应。在此上下文中，术语“对照综合生物标志物分数”包括来自如下样品(例如，来自相同的组织)的综合生物标志物分数，该样品获得自对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法无响应的受试者。这种对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法无响应的受试者可包括预测其对该组合疗法有响应的受试者，但是其对该组合疗法的这种响应并不比对用依维莫司进行的单一疗法所预测的响应显著更好。术语“对照综合生物标志物分数”还包括来自如下样品(例如，来自相同的组织)的综合生物标志物分数，该样品过去获得自已知对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应的受试者并且用作为了测试取自预测对组合疗法有响应的受试者的样品的将来对比的参比。

在一些实施例中，可以使用“阳性对照综合生物标志物分数”来代替“对照综合生物标志物分数”。来自特定细胞类型或组织的“阳性对照综合生物标志物分数”可以替代性地通过对一个或多个已被鉴定为对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应的受试者的分析来预建立。然后可以将该预建立的参比值(其可以是取自已经被鉴定为对组合疗法有响应的多个受试者的综合生物标志物分数的平均值或中位数)用作与测试样品对比中的“阳性对照综合生物标志物分数”。在这一对比中，如果正被分析的基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的表达水平计算的综合生物标志物分数与预建立的参比阳性对照综合生物标志物分数相同或相当，则预测受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

在某些实施例中，该“对照综合生物标志物分数”是预设的截断值。

在一些实施例中，本文所述的方法包括确定蛋白质的表达水平是否高于或低于预设的截断值。

根据本文所述的使用单一生物标志物分析的方法和组合物，高于或低于被鉴定为截断值的蛋白质的参比基线表达水平预测了对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的必要性。此外，根据使用综合生物标志物分数分析的方法和组合物，高于或低于被鉴定为截断值的蛋白质的参比基线表达水平限定了与具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的每种生物标志物蛋白质的值范围。一些截断值不是绝对的，因为临床相关性在该截断任一侧值的范围内仍然可以保持显著性；然而，针对特定样品类型，能够选择蛋白质的表达水平的最佳截断值(例如，改变H-得分)。可以将确定用于本文所述的方法中的截断值与例如公开的表达水平范围比较，但可以根据所使用的方法学和患者群体进行个性化。应当理解，最佳截断值的改进可以取决于所使用的统计方法的复杂性以及针对不同样品类型用于确定参比水平值的样品的数量和来源来确定。因此，已建立的截断值可以基于定期重新评估或方法学或群体分布的变化上下调整。

可以通过各种方法确定蛋白质的参比表达水平。参比水平可以通过比较例如对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应或对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应的受试者(例如，患者)群体中感兴趣的蛋白质的表达水平来确定。这可以通过例如直方图分析完成，其中图解呈现了整个患者群组，其中第一轴表示蛋白质的表达水平，而第二轴表示在该群组中样品含有一个或多个蛋白质的表达水平的受试者的数量。然后可以基于最佳区分这些独立组的表达水平来确定蛋白质的参比表达水平。参比水平可以是单个数字(同样适用于每个受试者)，或者参比水平可以根据具体的受试者亚群而改变。例如，对于相同的癌症，年老受试者与年轻受试者可能具有不同的参比水平。另外，患有更晚期疾病(例如，晚期或转移性肾细胞癌)的受试者与患有轻度形式的该疾病的受试者可能具有不同的参比值。

预建立的截断值可以是基于ROC分析确定的蛋白质表达水平或综合生物标志物分数。ROC曲线用于确定用于临床试验的截断值。考虑有两组患者并使用已建立的标准技术的情况，已知一组对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应并且已知另一组对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应。使用来自两组所有成员的生物样品进行的测量来测试对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法的必要性。

在本披露的单一生物标志物分析中，该测试将找出一些但不是全部对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应的受试者。由该测试找出的对组合疗法有响应的受试者与对组合疗法有响应的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阳性率(也称为灵敏度)。在本披露的单一生物标志物分析中，该测试将找出一些但不是全部对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应的受试者。由该测试找出的对组合疗法无响应的受试者与对组合疗法无响应的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阴性率(也称为特异性)。希望的是，上述测试的ROC曲线分析会发现能最小化假阳性和假阴性数目的截断值。

在本披露的综合生物标志物分数分析中，该测试将找出一些但不是全部如下受试者，其蛋白质表达水平落在与对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内。由该测试找出的具有较好治疗结果的受试者与具有较好治疗结果的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阳性率(也称为灵敏度)。在本披露的综合生物标志物分数分析中，该测试将找出一些但不是全部如下受试者，其蛋白质表达水平不落在与对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法具有较好治疗结果的人类受试者群体相关的值范围内。由该测试找出的不具有较好治疗结果的受试者与不具有较好治疗结果的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阴性率(也称为特异性)。希望的是，上述测试的ROC曲线分析会发现能最小化假阳性和假阴性数目的截断值。

在本披露的综合生物标志物分数分析中，该测试将找出一些但不是全部对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法有响应的受试者。由该测试找出的对组合疗法有响应的受试者与对组合疗法有响应的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阳性率(也称为灵敏度)。在本披露的综合生物标志物分数分析中，该测试将找出一些但不是全部对包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法无响应的受试者。由该测试找出的对组合疗法无响应的受试者与对组合疗法无响应的受试者的总数(通过已建立的标准技术而已知)的比率是真阴性率(也称为特异性)。希望的是，上述测试的ROC曲线分析会发现能最小化假阳性和假阴性数目的截断值。

ROC是一种图表，该图表示出了二类分层系统随着它的辨别阈改变时的性能。它是通过在不同阈值设置下阳性中的真阳性部分对阴性中的假阳性部分作图而创建的。

在一个实施例中，蛋白质的表达水平是基于预测具有阳性预测值的肿瘤响应的ROC分析而确定的，其中等于或高于预建立的截断值的蛋白质的表达水平是蛋白质的高表达水平，并且低于预建立的截断值的值是蛋白质的低表达水平。阳性预测值是为真阳性的阳性测试结果的比例；它反映出阳性测试反映所测试的潜在病症的概率。构建ROC曲线和确定阳性预测值的方法是本领域中所熟知的。在某些实施例中，肿瘤响应是ORR、CBR、或最大肿瘤缩小％。

以类似方式，基于ROC分析确定综合生物标志物分数。

在另一个实施例中，该预建立的截断值可以是基于预测存活期的模拟模型而确定的蛋白质的表达水平，其中等于或高于该预建立的截断值的蛋白质的表达水平是蛋白质的高表达水平，并且低于该预建立的截断值的值是蛋白质的低表达水平。在一些实施例中，该存活期是PFS。在其他实施例中，该存活期是OS。

在另一个实施例中，该预建立的截断值可以是基于预测存活期的模拟模型来确定的综合生物标志物分数，其中等于或高于该预建立的截断值的综合生物标志物分数是高综合生物标志物分数，并且低于该预建立的截断值的值是低综合生物标志物分数。在一些实施例中，该存活期是PFS。在其他实施例中，该存活期是OS。

在某些实施例中，该预建立的截断值落在受试者群体的20％到80％的范围内。在一些实施例中，该预建立的截断值落在受试者群体的20％至75％、25％至80％或25％至75％的范围内。在一些实施例中，该预建立的截断值是受试者群体的中位数、第一三分位数、第二三分位数、第一分位数、第三分位数、第一五分位数、第二五分位数、第三五分位数或第四五分位数。

用于本文所述方法的合适的生物样品包括含有待测量的蛋白质的任何生物流体、细胞、组织或其部分。生物样品可以是例如获得自人类受试者的试样或可以来源于这一受试者。例如，样品可以是获得自活组织检查的组织切片、存档的肿瘤组织、或置于或适应于组织培养的细胞。生物样品还可以是生物学流体，例如，血液、血浆、血清、或被吸收到基质(例如，玻璃、聚合物、纸)上的样品。生物样品还可以包括肾细胞癌组织样品。在具体的实施例中，该生物样品是获得自疑似含有肿瘤或癌前期病变受试者的区域的一个或多个肿瘤细胞或肿瘤组织。例如，该生物样品可以是肾细胞癌肿瘤样品。如果希望的话，可以进一步将生物样品分成含有特定细胞类型的部分。例如，可以将血液样品分成血清或分成含有特定类型血细胞(例如，红细胞或白细胞(白血球))的部分。如果希望的话，样品可以是来自受试者的样品的组合(例如，组织和体液样品的组合)。

该生物样品可以获得自患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者。在某些实施例中，该受试者患有晚期或转移性肾细胞癌。在一些实施例中，该受试者患有复发性肾细胞癌。在其他实施例中，该受试者患有不可切除的晚期或转移性肾细胞癌。在其他实施例中，该受试者患有III期肾细胞癌。在某些实施例中，该受试者患有IV期肾细胞癌。

虽然示例性方法包括例如静脉切开术、细针穿刺抽吸活检方法，但可以采用任何适合用于获得生物样品的方法。还可以通过例如显微切割(例如，激光捕获显微切割(LCM)或激光显微切割(LMD))收集样品。

用于获得和/或存储样品(保存样品中分子(例如，核酸或蛋白质)的活性或完整性)的方法是本领域内的普通技术人员熟知的。例如，生物样品可以进一步与一种或多种添加剂接触，该一种或多种添加剂是例如，缓冲液和/或抑制剂，包括一种或多种核酸酶、蛋白酶、以及磷酸酶抑制剂，其保存或最小化样品中分子(例如，核酸或蛋白质)的变化。这类抑制剂包括，例如，螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(对氨基乙基醚)N,N,N1,Nl-四乙酸(EGTA)、蛋白酶抑制剂(例如，苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、抗痛素等)、以及磷酸酶抑制剂(例如，磷酸盐、氟化钠、钒酸盐等)。合适的缓冲液和用于分离分子的条件是本领域内的普通技术人员熟知的，并且可以取决于例如样品中待表征的分子类型而变化(参见，例如，Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology[现行分子生物学方案](增刊47),约翰·威利父子出版社(John Wiley&Sons),纽约(1999)；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)(1988)；Harlow和Lane,Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1999)；Tietz Textbook of Clinical Chemistry[蒂茨临床化学教科书],第3版.Burtis和Ashwood(编辑)W.B.桑德斯(W.B.Saunders),费城,(1999))。还可以对样品进行处理以消除或最小化干扰物质的存在。例如，可以将生物样品分部分或纯化以移除一种或多种不感兴趣的材料。分部分或纯化生物样品的方法包括但不限于色谱方法，例如，液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、或亲和色谱法。用于在本文所述方法中使用的样品可以处于多种物理状态。例如，样品可以是液体或固体、可以溶于或悬浮于液体中、可以处于乳剂或凝胶形式、或可以被吸收到一种材料上。

可以通过测量蛋白质本身或编码该蛋白质的mRNA来确定蛋白质的表达水平。

在一个实施例中，可以通过测量蛋白质的量或浓度来确定蛋白质的表达。确定蛋白质的量或浓度的方法在本领域中是熟知的。通常所用的方法涉及使用对感兴趣的靶蛋白具有特异性的抗体。例如，确定蛋白质表达的方法包括但不限于蛋白质印迹法或斑点印迹分析、免疫组织化学(例如，定量免疫组织化学)、免疫细胞化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT；Coligan,J.E.等人(编辑),(1995)CurrentProtocols in Immunology.[当代免疫学实验手册]威利出版社(Wiley),纽约)、放射免疫测定、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、胶乳比浊免疫测定、胶乳光度免疫测定、免疫色谱测定、以及抗体阵列分析(参见，例如，美国公开号20030013208和2004171068，将其各自的披露内容通过引用以其全文并入本文)。上述多种方法和用于检测蛋白质表达的另外的方法的进一步描述可以发现于例如Sambrook等人(见上文)中。

在一个实例中，可以使用蛋白质印迹技术来确定蛋白质的表达水平。例如，可以从生物样品制备裂解物，或者生物样品本身可以与Laemmli缓冲液接触并且进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。SDS-PAGE解析的蛋白质按尺寸分离，然后可以被转移到过滤膜(例如，硝化纤维)上并且使用对蛋白质具有特异性的可检测地标记的抗体进行免疫印迹技术。结合的可检测地标记的抗体的量指示生物样品中蛋白质的量。

在另一个实例中，可以使用免疫测定来测量蛋白质表达水平。如上，可以用具有检测部分(例如，荧光剂或酶)的抗体进行免疫测定。来自生物样品的蛋白质可以直接偶联至固相基质(例如，多孔测定板、硝化纤维、琼脂糖、交联琼脂糖、编码的粒子、或磁珠)、或者它可以偶联至特异性结合对(例如，生物素或链霉抗生物素蛋白)的第一成员，该第一成员在结合特异性结合对(例如，链霉抗生物素蛋白或生物素)的第二成员后附接至固相基质。这样附接至固相基质允许在与检测抗体接触之前从生物样品的其他干扰或无关组分中纯化出蛋白质，并且还允许随后洗涤未结合的抗体。在此如上所述，结合的可检测地标记的抗体的量指示生物样品中蛋白质的量。

对于抗体的形式没有特别的限定，并且本披露包括多克隆抗体类以及单克隆抗体。还包括通过免疫动物(例如，具有蛋白质或其片段的兔)获得的抗血清，以及所有类别的多克隆和单克隆抗体、人类抗体、和通过基因重组产生的人源化抗体。

可以将完整蛋白质或它的部分肽用作用于免疫的抗原。作为蛋白质的部分肽，例如，可以给出蛋白质的氨基(N)-末端片段和羧基(C)-末端片段。

将待表达的编码蛋白质或其片段(例如，免疫学片段)的基因插入已知的表达载体中，并且通过用本文所述的载体转化宿主细胞，使用标准方法从宿主细胞外部或内部回收所希望的蛋白质或其片段。这种蛋白质可以用作致敏性抗原。并且，表达该蛋白质、细胞裂解物、或本发明的化学合成蛋白质的细胞也可以用作致敏性抗原。

通过致敏性抗原免疫的哺乳动物不受限制；然而，优选的是考虑与在细胞融合中使用的亲本细胞的兼容性而选择动物。通常使用属于啮齿目、兔形目、或灵长目的动物。可以使用的属于啮齿目的动物的实例包括，例如，小鼠、大鼠、和仓鼠。可以使用的属于兔形目的动物的实例包括，例如，兔。可以使用的属于灵长目的动物的实例包括，例如，猴。有待使用的猴的实例包括狭鼻下目(infraorder catarrhini)(旧世界猴)，例如，食蟹猴、猕猴、神圣狒狒、以及黑猩猩。

而且，本披露的抗体可以是抗体片段或经修饰的抗体，条件是它结合至待测量的蛋白质。例如，Fab、F(ab’)

这些抗体可以偶联至不同的分子，例如，荧光物质、放射性物质、以及发光物质。将这类部分附接到抗体上的方法在本领域已经建立而且是常规的(参见，例如，US 5,057,313和5,156,840)。

测定抗体的抗原结合活性的方法的实例包括，例如，测量吸光度、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、和/或免疫荧光。例如，当使用ELISA时，将由本发明的生物标志物编码的蛋白质添加至涂覆有本披露抗体的板上，然后添加抗体样品(例如，产生抗体的细胞的培养物上清液或经纯化的抗体)。然后，添加识别第一抗体的第二抗体(其由碱性磷酸酶和这类酶标记)，将该板温育并洗涤，并且测定吸光度以在添加酶底物(例如，对硝基苯磷酸)之后评估抗原结合活性。作为该蛋白质，可以使用蛋白质片段，例如，含有C-末端的片段或含有N-末端的片段。为了评估本发明抗体的活性，可以使用BIAcore(通用医疗集团(GE Healthcare))。

通过使用这些方法，本发明的抗体与推测含有待测量的蛋白质的样品接触，并且通过检测或测定在上述抗体和蛋白质之间形成的免疫复合物来检测或测定蛋白质。

基于质谱的定量测定方法(例如但不限于，基于多重反应监测(MRM)的方法与稳定同位素标记的内标组合)是用于蛋白质定量测定的免疫测定的替代方案。这些方法不要求使用抗体，所以能以具有成本效益和时效的方式进行该分析(参见，例如，Addona等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],27:633-641,2009；Kuzyk等人,Mol.Cell Proteomics[分子与细胞蛋白质组学],8:1860-1877,2009；Paulovich等人,Proteomics Clin.Appl.[蛋白质组学临床应用],2:1386-1402,2008)。另外，MRM提供优越的分布式监测能力，从而允许大量蛋白质同时平行地定量。这些方法的基本理论已经很好地得以确立并且被广泛用于小分子的药物代谢和药代动力学分析。

多种适合的方法可用于检测和/或测量基因的mRNA表达水平。例如，可以使用RNA印迹法或斑点印迹分析、逆转录酶-PCR(RT-PCR；例如，定量RT-PCR)、原位杂交(例如，定量原位杂交)或核酸阵列(例如，寡核苷酸阵列或基因芯片)分析来确定mRNA表达。这类方法的细节描述于下文并且描述于例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验手册]第二版第1、2和3卷.冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约,美国,1989年11月；Gibson等人(1999)Genome Res.[基因组研究],6(10):995-100i；和Zhang等人(2005)Environ.Sci.Technol.[环境科学技术],39(8):2777-2785；美国公开号2004086915；欧洲专利号0543942；以及美国专利号7,101,663；将其各自的披露内容通过引用以其全文并入本文。

在一个实施例中，可以通过从生物样品(参见，例如，Sambrook等人(见上文)以及美国专利号6,812,341)中分离总mRNA以及通过对分离的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳以便按尺寸分离mRNA来确定生物样品中mRNA群体的离散群体的存在或量。然后将尺寸分离的mRNA转移(例如，通过扩散)到固体支持体(例如，硝酸纤维素膜)。然后可以使用一种或多种可检测地标记的多核苷酸探针来确定生物样品中mRNA群体的存在或量，这些探针与感兴趣的mRNA序列互补，结合至感兴趣的mRNA序列并且由此使得它们相应的mRNA群体可检测。可检测的标记包括，例如，荧光标记(例如，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、别藻蓝蛋白(APC)、或藻红蛋白)，发光标记(例如，铕、铽、由量子点公司(Quantum Dot Corporation)(帕洛阿尔托，加利佛尼亚州)供应的Qdot

在另一个实施例中，可以使用核酸(或寡核苷酸)阵列(例如，下面在“阵列和试剂盒”下描述的阵列)来确定生物样品中mRNA的离散群体的存在或量。例如，可以使用RT-PCR与例如随机六聚体或寡(dT)引物介导的第一链合成来扩增从生物样品中分离出的mRNA。可以使扩增子片段化为较短区段。该RT-PCR步骤可以用于可检测地标记扩增子，或任选地，可以在RT-PCR步骤之后可检测地标记扩增子。例如，可以使用多种适合的技术(参见例如，Sambrook等人，见上文)中的任一种将可检测的标记酶促地(例如，通过缺口翻译法或激酶(例如，T4多核苷酸激酶))或化学地偶联至扩增子。然后将这些可检测地标记的扩增子与多个多核苷酸探针组接触，每一组包含一个或多个针对(并且能够结合至)相应的扩增子具有特异性的多核苷酸(例如，寡核苷酸)探针，并且其中多个包含许多探针组(每个对应于不同的扩增子)。

通常，这些探针组结合至固体支持体并且每个探针组的位置在该固体支持体上是预设的。可检测地标记的扩增子与探针组的相应探针的结合指示生物样品中靶mRNA的存在或量。使用核酸阵列用于检测mRNA表达的另外的方法描述于例如美国专利号5,445,934；6,027,880；6,057,100；6,156,501；6,261,776；以及6,576,424中；将其各自的披露内容通过引用以其全文并入本文。

检测和/或用于定量可检测的标记的方法取决于该标记的性质。由适当的酶(其中该可检测的标记是酶；参见上文)催化的反应的产物可以是而不限于：荧光的、发光的、或放射性的或它们可以吸收可见光或紫外线。适用于检测这类可检测的标记的检测器的实例包括但不限于X射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、发光计、以及光密度计。

本文所述的方法还可以用于产生患有肾细胞癌的受试者对包含乐伐替尼(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的响应曲线。该曲线可以包括例如在用乐伐替尼或其药学上可接受的盐治疗之前表明需要测量的蛋白质的基线表达水平的信息；和/或任何肾细胞癌的组织学分析。可以将所得信息(乐伐替尼疗法的响应曲线)用于预测患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者(例如，人类患者)对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

应当理解，乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)响应曲线可以处于电子形式(例如，储存在计算机或其他电子(计算机可读)媒介(例如DVD、CD、或软盘)上的电子患者记录)或书写形式。该乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)响应曲线还可以包括若干(例如，两个、三个、四个、五个、10个、20个、30个、50个、或100个或更多个)受试者(例如，人类患者)的信息。这类多受试者响应曲线可以用于例如受试者群组特定性质的分析(例如，统计分析)中。

受试者对于包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的响应性可以按几种方式分类，并且分类取决于受试者的疾病、疾病的严重程度、以及施用至受试者的特定药物。按照最简单的意义，响应性是相比于治疗前疾病状态的任何减轻，而非响应性是相比于治疗前在疾病状态上没有任何改变。患有肾细胞癌的受试者(例如，人类)的响应性可以依据许多客观临床指标中的一个或多个(例如但不限于，肿瘤尺寸、临床受益(CB)、PFS、OS、最大肿瘤缩小(MTS)％、或ORR)进行分类。

“临床受益”是指具有以下状态之一-完全响应(CR)、部分响应(PR)；或具有6个月或更长PFS的稳定疾病(SD)。“完全响应”意指所有靶病变完全消失。“部分响应”意指靶病变的LD总和减小至少30％，以基线总计LD用作参比。“进行性疾病”(PD)意指靶病变的LD总和增加至少20％，以自治疗开始、或一个或多个新病变出现以后记录的最小总计LD用作参比。“稳定疾病”意指靶病变既未缩小到足够符合PR也未增长到足够符合PD，以自治疗开始最小总计LD用作参比。

“总体存活期”(OS)被定义为从随机化直到任何原因所导致死亡的时间。“随机化”意指当确定患者的治疗计划时使患者随机进入测试组或对照组。

“无进展存活期”(PFS)是指从随机化的日期到疾病进展或死亡(以先发者为准)的首次记录日期的时间。

“最大肿瘤缩小(MTS)％”意指靶病变直径总和的变化百分比，以基线总直径用作参比。

“客观响应率”(ORR)将具有CR或PR的受试者与具有SD或PD的受试者进行比较。

可以基于肿瘤尺寸、CB、PFS、OS、MTS％或ORR来评估“较好治疗结果”。在一个实施例中，较好治疗结果是更长的PFS或更长的OS。

本申请还提供了试剂盒。在某些实施例中，试剂盒可以包括一种或多种抗体，这个或这些抗体可以被用于检测需要测量的蛋白质或者其浓度或表达水平。试剂盒中的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以进一步与可检测的标记偶联。试剂盒可以任选地包含用于检测和/或测量生物样品中需要测量的蛋白质的浓度的说明书。

试剂盒可以任选地包括例如对照(例如，需要测量的蛋白质的浓度标准)。在一些情况下，对照可以是含有蛋白质的表达水平或表达水平范围的插入物(例如，纸插入物或电子媒介(例如CD、DVD、或软盘))，该蛋白质在单一生物标志物分析中预测了对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的必要性或者在综合分析中与具有较好治疗结果的人类受试者群体有关。用于综合分析的试剂盒可以任选地包括含有对照综合生物标志物分数值或范围的插入物，该值或范围预测了对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法的必要性。

在一些实施例中，试剂盒可以包括一种或多种用于处理生物样品的试剂(例如，校准试剂、缓冲液、稀释液、显色试剂、终止反应的试剂)。例如，试剂盒可以包括用于从生物样品中分离蛋白质的试剂和/或用于检测生物样品中需要测量的蛋白质的存在和/或量的试剂(例如，结合蛋白质的抗体和/或与结合蛋白质的抗体结合的抗体)。

在某些实施例中，该试剂盒包括至少一个微板(例如，96孔板；即，12条，每条8孔)。该微板可以设有其相应的板盖。该微板可以是聚苯乙烯或是任何其他合适的材料。该微板可以具有用于鉴定涂覆在每个孔内的待测量的蛋白质存在的抗体。该抗体可以与可检测的标记偶联。该试剂盒还可以包括至少一个粘合带。

在一些实施例中，试剂盒可以包括用于分析例如表达谱或微阵列分析结果的软件包。

本文所述的试剂盒还可以任选地包括用于施用包含乐伐替尼化合物和依维莫司的组合疗法的说明书，其中选自由IL-18BP、ICAM-1、FGF-21和M-CSF组成的组的至少一种蛋白质的基线表达水平或基于

(A)包含(i)HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2，或(ii)TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A的至少五种蛋白质或者

(B)包含IL-18BP和ANG-2的至少两种蛋白质的基线表达水平计算的综合生物标志物分数预测了患有、疑似患有、或处于发生肾细胞癌风险中的受试者对包含乐伐替尼化合物(例如，乐伐替尼甲磺酸盐)和依维莫司的组合疗法有响应。

[实例]

实例1：测量接受用乐伐替尼和/或依维莫司治疗的患者的生物标志物表达水平

在VEGF靶向疗法后，对患有转移性肾细胞癌(RCC)的患者进行了乐伐替尼的2期研究。在先前的VEGF靶向疗法后，患有转移性肾细胞癌的患者接受乐伐替尼甲磺酸盐(“乐伐替尼”)、依维莫司或其组合，直到疾病进展或不可控的毒性发展。将总共153名受试者随机分为3个治疗组以接受：

1)18mg/天乐伐替尼(乐伐替尼游离碱；同样适用于下文)+5mg/天依维莫司(组A[LEN/EVE治疗组]，N＝51)，

2)乐伐替尼24mg/天(组B[LEN治疗组]，N＝52)，或

3)依维莫司10mg/天(组C[EVE治疗组]，N＝50)。

每个周期由4周(28天)组成。

在所有3个治疗组(LEN/EVE，N＝49；LEN，N＝51；EVE，N＝47；总计，N＝147)中在第1周期第1天(治疗前)从受试者中收集用于生物标志物评估的血液样品。在来自145名受试者(所有意向治疗[ITT]群体的94.8％；LEN/EVE，N＝49；LEN，N＝50；EVE，N＝46)的样品中，使用19个预配置的CustomMAP免疫测定板对表1中示出的40种候选生物标志物进行测定，并且由制造商(多分析物谱(MAP))在Myriad RBM(奥斯汀，德克萨斯州，美国)通过基于多重流式细胞术的平台对其进行测量。在以下实例中描述的相关性分析中进一步分析结果。

[表1]

表1.40种候选生物标志物

实例2：关于PFS和OS的单一生物标志物分析

对于每种血清生物标志物的基线水平，在3组中的每组中均使用单变量Cox回归进行了关于PFS的相关性分析。将具有连续值的生物标志物的风险比(HR)计算为具有一个标准偏差的测量值之间的风险比(HR/标准偏差)。在LEN/EVE组中，基线血清IL-18BP水平与PFS相关(表2)。在下表中，FDR是指假发现率，MST是指中位存活时间，并且CI是指置信区间。

[表2]

表2.在LEN/EVE和EVE组中关于PFS的IL-18BP的基线水平的单变量Cox回归分析

对于IL-18BP，进行二分法分析，以将低水平和高水平受试者的基线血清生物标志物水平与3组中的PFS相关联。截断点是中位数、第一三分位数、第二三分位数、第一四分位数、或第三四分位数。使用单变量Cox回归和对数秩检验(在每个选择的截断点)来探索组与PFS之间的关联。在第二三分位数截断点，在LEN/EVE组中，高IL-18BP组的中位数PFS(5.6个月)短于低组(17.5个月)(表3)。与EVE组相比，关于治疗组、基线水平和PFS的多变量Cox回归分析在第二三分位数截断点显示出相互作用(相互作用P值＝0.0389)。这些结果表明，与EVE组相比，在LEN/EVE组中，低IL-18BP水平对更长的PFS具有潜在的预测作用。

[表3]

表3.在LEN/EVE和EVE组中，关于PFS的IL-18BP的基线水平的截断分析

对于每种血清生物标志物的基线水平，在3组中的每组中均使用单变量Cox回归进行了关于OS的相关性分析。将具有连续值的生物标志物的风险比(HR)计算为具有一个标准偏差的测量值之间的风险比(HR/标准偏差)。在LEN/EVE组中，基线血清FGF-21、ICAM-1和M-CSF水平与OS相关(表4)。

[表4]

表4.在LEN/EVE和EVE组中，关于OS的FGF-21、ICAM-1和M-CSF的基线水平的单变量Cox回归分析

对于FGF-21、ICAM-1和M-CSF，使用单变量Cox回归和对数秩检验(在中位数截断点)进行二分法分析，以将低水平和高水平受试者的基线血清生物标志物水平与3组中的OS相关联。在LEN/EVE组中，FGF-21、ICAM-1和M-CSF的低基线水平与更长的OS相关(表5)。与EVE组相比，关于治疗组、基线水平和OS的多变量Cox回归分析在中位数截断点显示出相互作用(对于FGF-21、ICAM-1和M-CSF，相互作用P值分别＝0.0223、0.0039、和0.0362)。这些结果表明，与EVE组相比，在LEN/EVE组中，低FGF-21、ICAM-1、和M-CSF水平对更长的OS具有潜在的预测作用。

[表5]

表5.在LEN/EVE和EVE组中，关于OS的FGF-21、ICAM-1和M-CSF的基线水平的截断分析

实例3：关于PFS的综合生物标志物分数分析(5种标志物)

根据Voss等人，2016(Br J Cancer[英国癌症杂志]2016年3月15日；114(6)：642-9)，使用5种选择的生物标志物(HGF、MIG、IL-18BP、IL-18和ANG-2)进行综合生物标志物分数(CBS)分析，其中在LEN/EVE组中，在通过中位数进行的截断分析中，基线水平显示出与PFS的相关性最强(表6)。

[表6]

表6.在LEN+EVE组中，基线生物标志物水平与PFS的关联

对于整合到CBS中的每种生物标志物，如果各自的基线生物标志物水平落在经确定与单一生物标志物截断分析中的较长存活期相关的范围内，则指定值为1；如果各自的基线生物标志物水平被归类为与较短存活期相关的范围内，则指定值为0。对于每个受试者，将各个值(对于5种生物标志物中的每种，0相对1)的总和计算为CBS(范围0-5)。然后按照CBS将患者分为低组和高组(0相对1-5、0-1相对2-5、0-2相对3-5、0-3相对4-5、以及0-4相对5)。在每个治疗组中，使用单变量Cox回归和对数秩检验(在每个选择的二分点)来探索组与PFS之间的关联。通过关于治疗组、基线水平和PFS的多变量Cox回归分析来评估相互作用P值。还使用费希尔精确检验(Fisher's exact test)探索了组与客观响应率(ORR)之间的关联。

在LEN/EVE组中，CBS低组和高组之间的PFS有显著差异，而在EVE组中，CBS低组和高组之间的PFS没有显著差异(图1)。在LEN/EVE组中，高CBS分数(3-5)的患者的PFS比低CBS分数(0-2)的患者的PFS更长(mPFS：高CBS为20.1个月而低CBS为5.6个月，HR：0.279，P值：0.0022)。在高CBS分数(3-5)的患者中，LEN/EVE组的PFS比EVE组的PFS更长(mPFS：LEN/EVE为20.1个月而EVE为3.6个月，HR：0.186，P值：<0.0001，表7)。

多变量Cox回归分析显示出PFS与LEN+EVE相对EVE和CBS组之间的显著相互作用(P＝0.0154)。

在高CBS分数(3-5)的患者中，LEN/EVE中的ORR(57.1％)比EVE组中的ORR(5.0％)更高(P值＝0.0002，表7)。

[表7]

表7.通过低(0-2)和高(3-5)CBS分类的LEN+EVE和EVE组中的中位数PFS和ORR

这些数据表明，高CBS与PFS益处相关，并且该分数可用于鉴定与EVE单一疗法相比明显受益于组合疗法的患者。

实例4：关于OS的综合生物标志物分数分析(5种标志物)

与实例3相似，使用5种选择的生物标志物(TIMP-1、M-CSF、IL-18BP、ANG-2和VEGF-A)进行CBS分析，其中在LEN/EVE组中，在通过中位数进行的截断分析中，基线水平显示出与OS的相关性最强(表8)。

[表8]

表8.在LEN+EVE组中，基线CAF水平与OS的关联

对于整合到CBS中的每种生物标志物，如果各自的基线生物标志物水平落在经先前确定与单一生物标志物截断分析中的较长存活期相关的范围内，则指定值为1；如果各自的基线生物标志物水平被归类为与较短存活期相关的范围内，则指定值为0。对于每个受试者，将各个值(对于5种生物标志物中的每种，0相对1)的总和计算为CBS(范围0-5；高＝有利的存活期)。然后按照CBS将患者分为低组和高组(0相对1-5、0-1相对2-5、0-2相对3-5、0-3相对4-5、以及0-4相对5)。在每个治疗组中，使用单变量Cox回归和对数秩检验(在每个选择的二分点)来探索组与OS之间的关联。通过关于治疗组、基线水平和OS的多变量Cox回归分析来评估相互作用P值。还使用费希尔精确检验探索了组与客观响应率(ORR)之间的关联。

在LEN/EVE组中，CBS低组和高组之间的OS有显著差异，而在EVE组中，CBS低组和高组之间的OS没有显著差异(图2)。在LEN/EVE组中，高CBS分数(3-5)的患者的OS比低CBS分数(0-2)的患者的OS更长(中位数OS(mOS)：高CBS为不可评估的(NE)而低CBS为12.6个月，HR＝0.150，P值<0.0001)。在高CBS分数(3-5)的患者中，LEN/EVE组的OS比EVE组的OS更长(mOS：LEN/EVE为NE而EVE为17.4个月，HR：0.331，P值：0.0079，表9)。

多变量Cox回归分析显示出PFS与LEN+EVE相对EVE和CBS组之间的显著相互作用(P＝0.0125)。

在高CBS分数(3-5)的患者中，LEN/EVE中的ORR(63.0％)比EVE组中的ORR(5.3％)更高(P值<0.0001，表9)。

[表9]

表9.通过低(0-2)和高(3-5)CBS分类的LEN+EVE和EVE组中的中位数OS和ORR

这些数据表明，高CBS与OS益处相关，并且该分数可用于鉴定与EVE单一疗法相比明显受益于组合疗法的患者。

实例5：关于PFS的综合生物标志物分数分析(2种标志物)

在实例3和4中，IL-18BP和ANG-2常用于经选择进行针对PFS和OS的CBS分析的生物标志物。使用这2种生物标志物，进行关于PFS的CBS分析(2种标志物)。

对于整合到CBS中的每种生物标志物，如果各自的基线生物标志物水平落在经确定与单一生物标志物截断分析中的较长存活期相关的范围内，则指定值为1；如果各自的基线生物标志物水平被归类为与较短存活期相关的范围内，则指定值为0。对于每个受试者，将各个值(对于2种生物标志物中的每种，0相对1)的总和计算为CBS(范围0-2)。然后按照CBS将患者分为低组和高组(0相对1-2以及0-1相对2)。在每个治疗组中，使用单变量Cox回归和对数秩检验(在每个选择的二分点)来探索组与PFS之间的关联。通过关于治疗组、基线水平和PFS的多变量Cox回归分析来评估相互作用P值。还使用费希尔精确检验探索了组与客观响应率(ORR)之间的关联。

在LEN/EVE组中，CBS低组和高组之间的PFS有显著差异，而在EVE组中，CBS低组和高组之间的PFS没有显著差异(图3)。在LEN/EVE组中，高CBS分数(1-2)的患者的PFS比低CBS分数(0)的患者的PFS更长(mPFS：高CBS为17.5个月而低CBS为5.6个月，HR＝0.364，P值＝0.0130)。在高CBS分数(1-2)的患者中，LEN/EVE组的PFS比EVE组的PFS更长(mPFS：LEN/EVE为17.5个月而EVE为5.5个月，HR：0.254，P值：<0.0001，表10)。

多变量Cox回归分析显示出PFS与LEN+EVE相对EVE和CBS组之间无显著相互作用(P＝0.2297)。

在高CBS分数(1-2)的患者中，LEN/EVE中的ORR(54.3％)比EVE组中的ORR(6.9％)更高(P值<0.0001，表10)。

[表10]

表10.通过低(0)和高(1-2)CBS分类的LEN+EVE和EVE组中的中位数PFS和ORR

实例6：关于OS的综合生物标志物分数分析(2种标志物)

在实例3和4中，IL-18BP和ANG-2常用于经选择进行针对PFS和OS的CBS分析的生物标志物。使用这2种生物标志物，进行关于OS的CBS分析(2种标志物)。

对于整合到CBS中的每种生物标志物，如果各自的基线生物标志物水平落在经确定与单一生物标志物截断分析中的较长存活期相关的范围内，则指定值为1；如果各自的基线生物标志物水平被归类为与较短存活期相关的范围内，则指定值为0。对于每个受试者，将各个值(对于2种生物标志物中的每种，0相对1)的总和计算为CBS(范围0-2)。然后按照CBS将患者分为低组和高组(0相对1-2以及0-1相对2)。在每个治疗组中，使用单变量Cox回归和对数秩检验(在每个选择的二分点)来探索组与OS之间的关联。通过关于治疗组、基线水平和OS的多变量Cox回归分析来评估相互作用P值。

在LEN/EVE和EVE组中，CBS低组和高组之间的OS有显著差异(图4)。在LEN/EVE组中，高CBS分数(1-2)的患者的OS比低CBS分数(0)的患者的OS更长(mOS：高CBS为32.1个月而低CBS为11.9个月，HR＝0.213，P值<0.0001)。在EVE组中，高CBS分数(1-2)的患者的OS比低CBS分数(0)的患者的OS更长(mOS：高CBS为17.5个月而低CBS为11.4个月，HR＝0.461，P值＝0.0294)。在高CBS分数(1-2)的患者中，LEN/EVE组的OS比EVE组的OS更长(mOS：LEN/EVE为32.1个月而EVE为17.5个月，HR：0.504，P值：0.0359，表11)。

多变量Cox回归分析显示出OS与LEN+EVE相对EVE和CBS组之间无显著相互作用(P＝0.2125)。

[表11]

表11.通过低(0)和高(1-2)CBS分类的LEN+EVE和EVE组中的中位数OS

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